艾納香查爾酮合酶基因Bb-CHS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法
【專利摘要】本發明涉及一種艾納香查爾酮合酶基因Bb?CHS，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，一種艾納香查爾酮合酶基因Bb?CHS編碼的蛋白質，氨基酸序列如SEQ ID NO:2，本發明還涉及RT?PCR和RACE技術相結合，用于克隆艾納香查爾酮合酶基因Bb?CHS基因全長的方法。為進一步研究艾納香Bb?CHS基因的表達、調控奠定了基礎，為Bb?CHS基因參與艾納香黃酮組成及調控機制研究提供參考，同時也為菊科植物Bb?CHS基因功能和進化研究提供了新的背景資料。另外Bb?CHS基因的大量表達，有助于提高艾納香的生物學產量，同時提高植株有效成分榭皮素等類黃酮化合物的含量，從而同時提高艾納香的產量和品質。
【專利說明】
艾納香查爾酬合酶基因化-CHS、其編碼蛋白質從及基因克隆 方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及一種基因及其克隆方法，同時也設及到該基因編 碼蛋白質，尤其設及一種艾納香查爾酬合酶基因抓-CHS、其編碼蛋白質W及基因克隆方法。
【背景技術】
[0002] 艾納香(Blumea balsamifera L.DC.)為菊科艾納香屬多年生木質草本植物，主要 分布于我國海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺灣等省。W其全草或地上部分入藥，具有鎮痛、 發汗、桂風除濕、去疲止咳、通經止血等功效，在黎族、苗族、壯族等少數民族地區有著悠久 的用藥歷史，是一種重要的民間藥物。同時艾納香也是獲取天然冰片(艾片）的重要植物來 源之一。并且，在精致艾片過程中所產生的艾油具有擴張血管、降低血壓、抑制交感神經的 作用，因而被廣泛應用于醫藥行業。另外，艾油因其獨特的芳香氣味，還被廣泛應用于香料 W及化妝品行業。雖然W艾納香為原材料的產品眾多，然而關于其化學成分的研究較少。
[0003] 對于艾納香而言，其化學成分比較復雜，但具有藥理作用的主要集中在黃酬類和 揮發油成分上。關于艾納香揮發油成分的研究：周欣等（2001)、馬芝玉等（2009)采用GC/MS 方法檢測到艾納香中揮發油成分主要為:k龍腦、精腦、e-石竹締、芳精醇、大葉香締D、香木 蘭締、順-a-沒藥締、e-孽澄茄油締、丫-依蘭油締、ent-貝殼杉締等祗類化合物。鄧芹英等 (1996)，曹家慶等(2008)，陳銘等(2009)分別對艾納香中黃酬類成分進行了分析，主要含有 艾納香素、木犀草素、搬皮素、兒茶素W及阿亞黃素等。除此之外，艾納香中還含有多其他種 化合物，如小麥黃素、芹菜素、原兒茶酸（甲醋）、咖啡酸（甲醋）、香草酸等化合物。其中樹皮 素等類黃酬化合物具有廣泛的生理活性，在抗腫瘤方面具有良好的作用。
[0004] 查爾酬合酶（chalcone synthase,CHS)是類黃酬類物質代謝合成過程中的關鍵 酶，在植物與環境的相互作用中起到了重要的作用（如抗病、防止UV損傷、影響植物根瘤形 成等），對植物的生長發育起著至關重要的作用，同時與植物的花色的形成密切相關。目前 在研究植物生長發育及抗性中設及較多研究，而從植物次生代謝及產物藥理藥效活性方面 研究較少。
[0005] 目前，CHS基因在高梁、玉米、矮牽牛、蘭花、金魚草、擬南芥、豆類和松樹等植物上 成功克隆，但目前還沒有關于艾納香查爾酬合酶(CHS)基因的相關報道。因此，對艾納香查 爾酬合酶基因的克隆W及對他們的生物學功能研究，將有助于明確艾納香中類黃酬類次生 代謝的分子機理，為調控其艾納香中有效成分等奠定基礎。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種首次從艾納香種獲得的查爾 酬合酶基因。本發明的另一個目的是提供艾納香查爾酬合酶編碼的氨基酸序列及編碼蛋白 質性質生物信息學預測。同時，本發明還提供該艾納香查爾酬合酶基因的克隆方法及引物 對。
[0007]為了達到上述目的，本發明的技術方案是運樣實現的：
[000引本發明的第一個方面是提供一種艾納香查爾酬合酶基因，從艾納香（Blumea balsamifera DC)中克隆，命名為抓-C服基因，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 本發明的第二個方面是提供一種本發明第一個方面所述的艾納香查爾酬合酶基 因編碼的蛋白質，命名為抓-C服蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本發明的第S個方面是提供本發明第一個方面所述的艾納香查爾酬合酶基因化- C服的克隆方法，其特征在于:包括W下步驟：
[0011] (1)從艾納香葉片中提取總RNA;
[001。。似總RNA為模板進行反轉錄獲得CDNA;
[0013] (3)設計簡并引物對，進行PCR擴增，回收PCR產物，其中，簡并引物對為：
[0014] PFl:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0015] PR1：TCACCCACCT CGTATTTTGC；
[0016] (4)PCR產物與pGEM-T easy Vector連接，連接產物轉化E.COli JM109感受態細 胞，采用藍白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得化-CHS基因 片段；
[0017] (5似總RNA為模板，采用SMART? race Kit提供的反轉錄引物合成RACE第一鏈 CDNA;根據獲得化-CHS基因片段設計3 '和5 '末端快速擴增引物對，WRACE第一鏈CDNA為模 板進行快速擴增，其中，3 '和5 '末端快速擴增引物對為：
[001 引 66-(：服基因5'尺4〔6引物:〔4〔4466口'4 1'〔44641666，
[0019] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1';
[0020] (6)步驟(5)得到的PCR產物經檢測、回收、亞克隆和測序，獲得化-CHS基因3 '和5 ' 末端序列，并進行拼接；
[0021] (7)根據上述拼接序列，于抓-CHS基因開放閱讀框兩端設計全長CDNA擴增引物對， 進行全長序列的克隆，其中全長CDNA擴增引物對為：
[0022] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0023] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0024] 進一步地，步驟(5)中5'-&3'-RACE PCR反應體系為：TaKaRa Ex Taq(SUAU)O.化 l;10x Ex !"aq Buffe;r，Mg2+plus 5]il;dNTP Mixture各2.5mmol/L，4]il;3'-RACE-Ready cDNA 化1 ;GSP，10皿ol/L，化I; UPM，IOx，5iU ; d地20補充至50iU ;
[0025] 進一步地，步驟(7)中化-CHS基因全長序列的克隆的反應體系為:PCR反應總體積 為50ia，1.5mmol/LMgCl2,4種dNTP各200i^mol/L，引物各150ng，1.5UTaqplusDNA polymerase,高保真，IOOng cDNA。
[0026] 進一步地，步驟(1)中采用TRNzol法提取總RNA。
[0027] 進一步地，步驟（2)中采用TaKaRa公司生產的PrimeScript? 1st Shand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄獲得cDNA。
[0028] 本發明的第四個方面是提供一種克隆本發明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-C服的簡并引物對，其特征在于，所述簡并引物對為：
[00巧]PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0030] PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC。
[0031] 本發明的第五個方面是提供一種克隆本發明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-C服的3'和5'末端快速擴增引物對，所述3'和5'末端快速擴增引物對為：
[0032] Bb-CHS基因5'RACE引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG，
[0033] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1'。
[0034] 本發明的第六個方面是提供一種克隆本發明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-C服的全長CDNA擴增引物對，所述全長CDNA擴增引物對為：
[0035] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0036] Bb-CHS基因3' 引物：TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0037] 本發明的第屯個方面是提供一種克隆本發明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-CHS的引物組，所述引物組包括簡并引物對、3'和5'末端快速擴增引物對、W及全 長CDNA擴增引物對，其中，
[0038] 所述簡并引物對為：
[0039] PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0040] PR1：TCACCCACCT CGTATTTTGC；
[0041 ] 所述3 '和5 '末端快速擴增引物對為：
[0042] Bb-C服基因5'RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG，
[0043] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1';
[0044] 全長cDNA擴增引物對為：
[0045] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0046] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0047] 本發明的有益效果是：
[0048] 本發明設及一種艾納香查爾酬合酶基因化-CHS與編碼的蛋白質及其克隆方法。本 發明采用RT-PCR與RACE技術相結合的方法，對艾納香種化-CHS基因進行了研究，首次從艾 納香葉片中克隆得到化-CHS基因全長序列，并對其所編碼的氨基酸序列進行了分析，為進 一步研究艾納香化-CHS基因的表達、調控奠定了基礎，為化-CHS基因參與艾納香黃酬組成 及調控機制研究提供參考，同時也為菊科植物化-C服基因功能和進化研究提供了新的背景 資料。另外抓-CHS基因的大量表達，有助于提高艾納香的生物學產量，并同時提高植株有效 成分樹皮素等類黃酬化合物的含量，從而同時提高艾納香的產量和品質。
【具體實施方式】
[0049] 下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，W更好地理解本發明。
[0050] 步驟1，選用艾納香(Blumea balsamifera DC)葉片作為試驗材料，采用TR化〇1法 提取總RNA，其含量及質量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0化1] 步驟2，^總1?酷為模板，采用化1(日1?日公司生產的？'1111日5。'191了《1318付日11(1。0魁 Synthesis Kit進行反轉錄獲得cDNA。
[0052] 步驟3, W該cDNA為模板，根據NCBI上其他植物CHS基因保守區域，設計簡并引物 對，進行PCR擴增，簡并引物對為：
[0053] PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0054] PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
[0055] 反應體系為:PCR反應總體積為50iU，1.5mmol/L MgCl2,4種dNTP各200皿ol/L，引 物各 150ng，l.抓！"aq plus DNA polymerase(高保真），100ng cDNA。
[0化6] PCR反應條件為：
[0化7]
[005引步驟4，PCR產物回收后與pGEM-T easy Vector連接，連接產物轉化E. COli JM109 感受態細胞，采用藍白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得抓- C服基因片陳?
[0化9]
[0060]
[0061] 步驟5，根據上述抓-C服基因片段設計3 '和5 '末端快速擴增(RACE)引物對；
[0062] 66-(：服基因 5'尺4〔6引物:〔4〔4466口'4 1'〔44641666，
[0063] 66-(：服基因 3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1'。
[0064] 步驟6:采用SMART? race Kit提供反轉錄引物，W總RNA為模板，進行反轉錄，合成 RACE 第一鏈 cDNA:
[00化]3'-RACE-Ready cDNA反應體系：Total RNA liig，3'-RACE CDS Primer:化1，補 dd出0至終體積扣I;
[0066] 5'-RACE-Ready cDNA反應體系：Total RNA liig，3'-RACE CDS Primer 化1，BD SMART II? Oligonucleotide TC溫育2min，補dd出0至終體積化I。
[0067] 將各反應體系混勻后，短暫離屯、，于70°C溫育2min，迅速于冰中冷卻2min，短暫快 速離屯、后，在反應管中加入下列試劑：5X First-Strand Buffer 2iil，DTT liil，dNTP Mix 1 ]il，BD PowerScript Reverse Transcriptase 化1，加 d地2〇補至lOyl，混勻，短暫離屯、，42 。(:溫育化，加入10化I Tricine-EDTA緩沖液稀釋反應產物;72°C加熱10min，4°C保存備用。 [006引步驟7,采用3'和5'末端快速擴增(RACE)引物對，WRACE第一鏈CDNA為模板進行快 速擴增。
[0069] 5，-&3'-RACE PCR反應體系：TaKaRa Ex Taq(SUAU)O.化1，IOx Ex Taq Buffer (Mg2+plus)扣l，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4山，3'-RACE-Ready cDNA 化1，GSP(10皿ol/ L)化1，1]口]?(10義）541，(1地2〇補充至50山。
[0071]
[0070] PCR厲獻簽化.
[0072]
[0073] 步驟8，PCR產物經檢測、回收、亞克隆和測序。獲得抓-CHS基因3 '和5 '末端序列，并 進行拼接。
[0074] 步驟9,根據上述拼接序列，于化-CHS基因開放閱讀框(ORF)兩端設計全長CDNA擴 增引物對：
[0075] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0076] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0077] 進行抓-C服基因全長序列的克隆：
[007引反應體系為:PCR反應總體積為50iU，1.5mmol/L 1旨(：12,4種(1腫?各200皿01/1，弓| 物各 150ng，l.抓！"aq plus DNA polymerase(高保真），100ng cDNA。
[0079] PrRl^歷義化擊.
[0080]
[0081 ] PCR產物經檢測、回收、亞克隆和測序，獲得化-CHS基因全長序列SEQ ID NO: 1，其 編碼的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
[0082] W上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限 制于W上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和 替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1. 一種從艾納香中獲得的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示。2. -種權利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS編碼的蛋白質，其特征在于:其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. -種權利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的克隆方法，其特征在于:包括 以下步驟： (1) 從艾納香葉片中提取總RNA; (2) 以總RNA為模板進行反轉錄獲得cDNA; (3) 設計簡并引物對，進行PCR擴增，回收PCR產物，其中，簡并引物對為： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl：TCACCCACCT CGTATTTTGC； (4) PCR產物與pGEM-T easy Vector連接，連接產物轉化E.coli JM109感受態細胞，采 用藍白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得Bb-CHS基因片段； (5) 以總RNA為模板，采用SMART? RACE Kit提供的反轉錄引物合成RACE第一鏈cDNA;根 據獲得Bb-CHS基因片段設計3 '和5 '末端快速擴增引物對，以RACE第一鏈cDNA為模板進行快 速擴增，其中，3 '和5 '末端快速擴增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT; (6) 步驟(5)得到的PCR產物經檢測、回收、亞克隆和測序，獲得Bb-CHS基因3 '和5 '末端 序列，并進行拼接； (7) 根據上述拼接序列，于Bb-CHS基因開放閱讀框兩端設計全長cDNA擴增引物對，進行 全長序列的克隆，其中全長cDNA擴增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。4. 根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(5)中5 ' -&3 ' -RACE PCR反應體系 為：TaKaRa Ex Taq(5U/yl)0.4yl;10x Ex Taq BufTer，Mg2+plus 5yl;dNTP Mixture各 2 · 5mmo 1/L，4μ1; 3 ' -RACE-Ready cDNA ΙμL; GSP，lOymol/L，ΙμL; UPM，IOx，5μ1; ddH20補充至 50μ1〇5. 根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(7)中Bb-CHS基因全長序列的克 隆的反應體系為:PCR反應總體積為50μ1，1.5mmol/L MgCl2，4種dNTP各200ymol/L，引物各 150ng，1.5U Taq plus DNA polymerase，高保真，IOOng cDNA。6. 根據權利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟（1)中采用TRNzol法提取總RNA; 步驟（2)中米用TaKaRa公司生產的PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反 轉錄獲得cDNA。7. -種用于克隆權利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的簡并引物對，其特 征在于，所述簡并引物對為： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC。8. -種用于克隆權利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的3 '和5 '末端快速擴 增引物對，其特征在于，所述3 '和5 '末端快速擴增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT。9. 一種用于克隆權利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的全長cDNA擴增引物 對，其特征在于，所述全長cDNA擴增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。10. -種用于克隆權利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的引物組，其特征在 于，所述引物組包括簡并引物對、3'和5'末端快速擴增引物對、以及全長cDNA擴增引物對， 其中， 所述簡并引物對為： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl：TCACCCACCT CGTATTTTGC； 所述3 '和5 '末端快速擴增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT; 全長cDNA擴增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
【文檔編號】C12N15/10GK105925546SQ201610309822
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月11日
【發明人】官玲亮, 龐玉新, 夏奇峰, 于福來, 黃梅, 胡遠鵬, 胡璇, 謝小麗
【申請人】中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所