馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，屬于農業微生物領域。本發明依次通過TSA復蘇凍干種子、在TSA瓊脂斜面一級中培養、在TSB培養基進行二級種子培養、在無血清和葡萄糖的加富胰酪蛋白培養基中厭氧發酵，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度抗原。本發明通過不添加任何血清和葡萄糖、厭氧發酵培養的方法，進行工業放大生產研究，發酵抗原含量無降低，發酵過程中不用調整通氣、控制溶氧，抗原含量高，工藝參數容易控制，減少補料；較現有發酵工藝穩定、生長速度快，易于實現馬鏈球菌抗原的大規模高密度培養。同時提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保護效果。
【專利說明】
馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝
技術領域
[0001] 本發明設及農業微生物技術領域，特別設及一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高 密度發酵培養工藝。
【背景技術】
[0002] 馬鏈球菌獸疫亞種根據蘭氏分群屬于C群鏈球菌，該菌可引起多種動物感染，臨床 癥狀表現為敗血癥、腦膜炎、關節炎等，一般呈地方流行性。隨著集約化養豬業的發展，中國 豬鏈球菌病時有發生。流行病學調查表明，除豬鏈球菌2型外，馬鏈球菌獸疫亞種仍是中國 各地豬鏈球菌病的主要病原。目前控制該病的主要手段仍是疫苗，主要有弱毒疫苗、滅活 苗。
[0003] 馬鏈球菌弱毒菌株ST171是生產鏈球菌弱毒活疫苗的專用菌株，對其培養及研究 局限于大瓶培養和普通發酵活菌低的特點。馬鏈球菌獸疫亞種為兼性厭氧型微生物，生長 過程中需要血清和葡萄糖作為營養物質，但是運些異源物質的殘存會使疫苗存在安全隱 患。普通發酵工藝要隨著發酵的進行不斷調整通氣量，控制溶氧，同時需要添加2~5%的血清 和1 %的葡萄糖。
【發明內容】
[0004] 為了彌補現有技術的不足，本發明提供了一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密 度發酵培養工藝。本發明通過不添加任何血清和葡萄糖、厭氧發酵培養的方法，進行工業放 大生產研究，發酵抗原含量無降低，發酵過程中不用調整通氣、控制溶氧，抗原含量高，工藝 參數容易控制，減少補料;較現有發酵工藝穩定、生長速度快，易于實現馬鏈球菌抗原的大 規模高密度培養。
[0005] 本發明的技術方案為： 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，包括步驟： 1) 取凍干的發酵種子菌用活化培養基活化，至單菌落長出； 2) 挑取單菌落至一級種子培養基，培養12-16小時，得一級種子； 3) 取一級種子并接種于二級種子培養基，培養至ODsgg值達到0.4-0.6，得二級種子； 4) W 1%-3%接種量將二級種子液轉接至發酵罐中的發酵培養基進行發酵種子培養;調 節pH至7.2 ±0.2,關閉進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為50- 150rpm;當ODs日日值達到一定數值時停止發酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度 抗原;所述發酵培養基為加富膜酪蛋白培養基。
[0006] 作為優選方案，還包括步驟5)，將發酵種子培養收獲的菌液Wl%-3%的接種量接種 至體積更大的發酵罐中進行擴大培養，擴大培養的培養基也為加富膜酪蛋白培養基，擴大 培養的工藝條件為：pH 7.2 ± 0.2，罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為50-150巧m;當ODsoo 值達到1.5-1.卵寸停止發酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度抗原。
[0007] 作為優選方案，步驟1)中，所述活化培養基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養基。
[000引作為優選方案，步驟2)中，所述一級種子培養基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養 基。
[0009] 進一步地，步驟3)中，所述二級種子培養基為添加有3-8%成牛血清的TSB培養基。
[0010] 進一步地，步驟3)中，W1-3 ml TSB液體洗涂一級種子培養基的瓊脂斜面，將一級 種子接種于二級種子培養基，然后于36-38°C ,50-15化pm條件下，搖床震蕩培養3-4h。
[0011] 作為優選方案，所述發酵種子菌為馬鏈球菌獸疫亞種ST171株。
[0012] 作為優選方案，所述擴大培養所用發酵罐的體積為200-40化，所述發酵種子培養 所用發酵罐的提交為8-20L。
[0013] 本發明的有益效果為： 本發明通過不添加任何血清和葡萄糖、厭氧發酵培養的方法，進行工業放大生產研究， 發酵抗原含量無降低，發酵過程中不用調整通氣、控制溶氧，抗原含量高，工藝參數容易控 審IJ，減少補料;較現有發酵工藝穩定、生長速度快，易于實現馬鏈球菌抗原的大規模高密度 培養。同時提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保護效果。
[0014]
【附圖說明】
[0015] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可 W根據運些附圖獲得其他的附圖。
[0016] 圖1為普通發酵工藝與本發明發酵工藝發酵生長曲線對比圖；曲線A代表本發明發 酵工藝；曲線B代表普通發酵工藝。
【具體實施方式】
[0017] W下各實施例中所用TSA培養基W及TSB培養基購自美國抓公司；加富膜酪蛋白培 養基購自山東陽谷蛋白僑潤辦事處潤蠢蛋白廠。
[001引實施例1 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發酵種子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培養基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養12-16小時，得一級種子； 3) W2 ml TSB液體洗涂添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 5%成牛血清的TSB培養基，然后于37°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養3-地，培養至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W2%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至IOL發酵罐中的發酵培養基(加富膜酪蛋白 培養基)進行發酵種子培養;采用IOM的氨氧化鋼調節抑至7.2±0.2，12rC滅菌30min，關閉 進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm;培養4小時后開始取樣 測定ODs日日值和活菌計數，5小時活菌數達到63億cfu/mL ODs日日值達到1.7時停止發酵，收獲菌 液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度抗原。
[0019] 實施例2 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發酵種子菌，在添加有7%成牛血清的TSA培養基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有7%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養12-16小時，得一級種子； 3) W3 ml TSB液體洗涂添加有7%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 7%成牛血清的TSB培養基，然后于38°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養3-地，培養至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W3%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至1化發酵罐中的發酵培養基(加富膜酪蛋白 培養基)進行發酵種子培養;采用IOM的氨氧化鋼調節抑至7.2±0.2，12rC滅菌30min，關閉 進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm;培養4小時后開始取樣 測定ODs日日值和活菌計數，5小時活菌數達到62億cfu/mL ODs日日值達到1.別寸停止發酵，收獲菌 液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度抗原。
[0020] 實施例3 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發酵種子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培養基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養12-16小時，得一級種子； 3) W2 ml TSB液體洗涂添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 5%成牛血清的TSB培養基，然后于37°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養3-地，培養至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W2%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至IOL發酵罐中的發酵培養基(加富膜酪蛋白 培養基)進行發酵種子培養;采用IOM的氨氧化鋼調節抑至7.2±0.2，12rC滅菌30min，關閉 進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm; 5) 當當步驟4)中發酵種子培養至ODsoo值達至IjO.4-0.6時，取步驟4)發酵罐中的菌液，W 2%(V/V)的接種量轉接至30化發酵罐中的發酵培養基(加富膜酪蛋白培養基)進行擴大培 養;采用1OM的氨氧化鋼調節pH至7.2 ± 0.2，12 rC滅菌30min，關閉進氣閥和出氣閥，保持罐 體正壓0.03-0.05Mpa，攬拌速度為10化pm;培養4小時后開始取樣測定ODs日日值和活菌計數，5 小時活菌達到70億Cf u/mL ODsoo值達到1.7時停止發酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種 發酵高密度抗原。
[0021] 對比例1 一種馬鏈球菌獸疫亞種普通發酵工藝，包括步驟： 1)取凍干的馬鏈球菌獸疫亞種ST171株發酵種子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培養基 活化12-16小時，至單菌落長出； 2巧陳單菌落至添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，培養12-16小時，得一級種子； 3) W2 ml TSB液體洗涂添加有5%成牛血清的TSA瓊脂斜面，將一級種子接種于添加有 5%成牛血清的TSB培養基，然后于37°C，100巧m條件下，搖床震蕩培養3-地，培養至ODso日值達 到0.4-0.6,得二級種子； 4) W2%(V/V)的接種量將二級種子液轉接至IOL發酵罐中的發酵培養基(加富膜酪蛋白 培養基)進行發酵種子培養，添加5%成牛血清和1%的葡萄糖;采用IOM的氨氧化鋼調節pH至 7.2±0.2，121°(：滅菌30111111，控制溶氧在10~50%，攬拌速度為10化9111;培養4小時后開始取樣 測定ODs日日值和活菌計數，6小時活菌數達到61億cfu/ni; ODs日日值達到1.7時停止發酵，收獲菌 液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度抗原。
[0022] 實施例1(本發明發酵工藝)所得發酵抗原與對比例1(普通發酵工藝)所得發酵抗 原分別配制疫苗進行21-28日齡仔豬免疫，免疫后28天按照《中華人民共和國獸用生物制品 規程》(2000年版）的《豬敗血性鏈球菌病活疫苗制造及檢驗規程》進行效力檢驗，對照豬免 疫相同劑量的侶膠生理鹽水稀釋液，結果如表1所示。
[0023]
由表1可知，本發明發酵工藝所得抗原的免疫原性明顯改善，提高了疫苗的保護效果。
[0024] 實施例1(本發明發酵工藝)與對比例1(普通發酵工藝)發酵生長曲線對比圖如圖1 所示；由圖1可知，本發明發酵工藝較現有普通發酵工藝穩定、生長速度快，易于實現馬鏈球 菌抗原的大規模高密度培養。
【主權項】
1. 一種馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在于，包括步驟：I) 取凍干的發酵種子菌用活化培養基活化，至單菌落長出；2)挑取單菌落至一級種子培養基， 培養12-16小時，得一級種子;3)取一級種子并接種于二級種子培養基，培養至OD 6qq值達到 0.4-0.6，得二級種子;4)以1%-3%接種量將二級種子液轉接至發酵罐中的發酵培養基進行 發酵種子培養;調節pH至7.2 ± 0.2，關閉進氣閥和出氣閥，保持罐體正壓0.03-0.05Mpa，攪 拌速度為50-150rpm;當OD6qq值達到一定數值時停止發酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞 種發酵高密度抗原;所述發酵培養基為加富胰酪蛋白培養基。2. 如權利要求1所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在于， 還包括步驟5)，將發酵種子培養收獲的菌液以1%-3%的接種量接種至體積更大的發酵罐中 進行擴大培養，擴大培養的培養基也為加富胰酪蛋白培養基，擴大培養的工藝條件為:PH 7.2 ± 0.2，罐體正壓0.03-0.05Mpa，攪拌速度為50-150rpm;當OD6qq值達到1.5-1.9時停止發 酵，收獲菌液，得到馬鏈球菌獸疫亞種發酵高密度抗原。3. 如權利要求1或2所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在 于:步驟1)中，所述活化培養基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養基。4. 如權利要求1或2所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在 于:步驟2)中，所述一級種子培養基為添加有3-8%成牛血清的TSA培養基。5. 如權利要求4所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在于： 步驟3)中，所述二級種子培養基為添加有3-8%成牛血清的TSB培養基。6. 如權利要求5所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在于： 步驟3)中，以1-3 mL TSB液體洗滌一級種子培養基的瓊脂斜面，將一級種子接種于二級種 子培養基，然后于36-38 °C，50-150rpm條件下，搖床震蕩培養3-4h。7. 如權利要求1所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在于： 所述發酵種子菌為馬鏈球菌獸疫亞種ST171株。8. 如權利要求2所述馬鏈球菌獸疫亞種無血清厭氧高密度發酵培養工藝，其特征在于： 所述擴大培養所用發酵罐的體積為200-400L，所述發酵種子培養所用發酵罐的提交為8-20L〇
【文檔編號】C12R1/46GK105925517SQ201610575429
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月21日
【發明人】朱杰, 王楠, 牛成明, 董新榮
【申請人】山東濱州沃華生物工程有限公司