一種利用蜜棗廢水作為培養基進行乳酸菌培養的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用蜜棗廢水發酵生產乳酸菌的方法，包括將無機鹽等物質加入到所述廢糖液中，配置成優化的發酵培養基，通過優化發酵條件，采用二階段降溫發酵，即得到發酵優化的方法，最終得到了高濃度的乳酸菌菌體。本發明的發酵方法直接以蜜棗廢水作為碳氮源，減少了發酵成本。
【專利說明】
-種利用蜜専廢水作為培養基進行乳酸菌培養的方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種蜜要(錢)加工廢水綜合處理及資源化的方法，尤其是蜜要加工廢 水綜合處理、蜜糖回收，燃煤鍋爐脫硫和要加工廢水聯合工藝的處理方法。
【背景技術】
[0002] 要樹是黃河流域最古老的樹種之一，距今已有數千年的栽培歷史。河北、河南、山 西、陜西、新疆等地是我國主要要產地。蜜要是傳統美味的消閑食品，且具有豐富的營養價 值，在國內外有著巨大的市場和良好的聲譽。蜜要加工能夠提高農產品附加值和帶動地方 經濟。但蜜要加工也是一個污染較大的行業，蜜要加工產生的高濃廢水和生產鍋爐煙塵污 染一直是困擾著企業進一步健康發展所面臨的難題。特別是一些蜜要加工小作坊生產廢水 的亂排造成周邊環境污染和環保部口的高度重視，使得蜜要(蜜錢)加工污染防治成為當地 環境污染治理的重要課題。
[0003] 蜜要加工廢水主要有原要的清洗廢水、設備和地面沖洗水等較低濃度廢水和蜜要 經糖煮后沖洗表面糖蜜的高濃廢水。高濃廢水主要成分是糖，除少部分回用W減少補充新 鮮水和原糖之外，大部分排掉。蜜要糖煮后的沖洗水COD高達19萬(mg/L)，經下水道與洗要 水和地面、設備清洗水混合成為外排的綜合廢水，其C0D = 60000mg/L。如此高濃廢水直接處 理勢必造成投資過高，企業難W承受。CN 103193358 A中公開了一種蜜要加工廢水的綜合 處理及資源化方法。采用分質處理蜜要加工廢水:高含糖廢水通過多效蒸發使糖分回收，不 僅大幅減輕污水處理負荷而且產生回收糖可觀的經濟效益;要清洗水、地面清潔污水和其 他生活污水匯總處理;此部分污水處理與燃煤鍋爐煙氣脫硫同步運行，利用污水中的有機 污染物作為營養源生物脫硫的同時，污水也得到一定程度的處理、水溫上升---有利后繼的 生化處理。上述生化處理出水經生物碳深度處理再經微濾和RO反滲透雙膜處理，降低出水 鹽度達到鍋爐軟化水要求，進一步減少蜜要加工廢水排放量和傳統鍋爐用水軟化酸堿的消 耗和排放。該方法操作復雜，資源消耗量巨大也不實用。
[0004] 使用微生物來處理廢水在現有技術中已經有了很多例子。比如，中國人民大學于 2012年10月3日申請的、發明名稱為"利用一株光合細菌處理淀粉廢水并實現廢水資源化的 方法"、公布號為CN102701460A的發明專利申請，針對淀粉加工廢水采用光合細菌發酵，并 收集菌體實現資源化，其所用的光合細菌是球形紅細菌，采用的淀粉廢水特指為利用玉米、 馨類等加工淀粉產生的廢水，該污水濃度極高，COD為8000-30000mg/l，為了增加菌劑的濃 度，該發明專利申請引入高濃度蘋果酸(400mg)，增加了生產成本，該發明專利申請還沒有 詳細說明控制雜菌問題。另外，發明名稱為"利用光合細菌處理食品加工廢水并實現資源化 的方法"的CN103058387B掲示其所用光合細菌為沼澤紅假單胞菌(戊食品加工廢水特指為 糧蜜廢水、酒糟廢水、果膠廢水W及牛奶制品廢水，廢水濃度極高，其COD為8000-30000mg/l， 該發明專利申請中投加小分子碳源物質到終濃度為160-2000mg及小分子氮源物質到終濃 度為55-lOOOmg/l。但是針對蜜要廢水進行處理的實例并不多，應用也不廣泛。
[0005] CN 104026507 A中公開了一種利用蜜要廢糖液生產要果的方法，包括W下步驟： I)將巧樣酸錠，化抽K)4及碳酸巧依次加入到所述廢糖液中，配置成培養基;2)將所述培養基 進行滅菌，然后再加入木醋桿菌種子液，在25~30°C的溫度下，靜置培養5~10天，即得到所 述要果。本發明是利用丟棄的紅要汁液，利用其作為培養基來生產一種食品原料一一要果。 由于要汁液中營養高，可W直接作為碳源，減少碳源成本。CN 103695352 A中公開了一種針 對大要加工廠廢水采用微生物發酵工藝制造水質處理劑的方法，所用水質處理劑中的微生 物成分包括枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、乳酸菌，用量為2~70%。利用上述微生物進行污 水處理的工藝流程為:針對廢水予W自然沉降，收集液體，按比例加入微生物在30~50°進 行有氧發酵，并予W充氣;在-發酵終點后再加入焦糖進一步發酵，然后再加入枯草芽抱桿 菌，直至發酵至終點，分裝成品即可。本發明技術解決了大要加工廠廢水處理問題，生產出 產品能用于農業、水產養殖、海洋赤潮、淡水，從而實現污水處理零排放。上述產品能廣泛應 用于農業、水產養殖、湖泊水華、海洋赤潮的治理。該方法能夠使得資源最大化的得到利用。
[0006] 乳酸菌生長的營養要求較高，其培養基組成除了必須含有充足的碳源、氮源、無機 鹽外，幾乎每種乳酸菌都有其特殊的生長因子需求，如維生素、小分子氨基酸、核酸衍生物 等，因此國內外培養乳酸菌制劑使用的培養基(乳清粉、各種奶粉、MRS培養基等）的原料均 十分昂貴。另外，乳酸菌在生長過程中分泌有機酸類代謝產物，抑制菌體增殖，運些都直接 影響乳酸菌的高密度培養。目前乳酸菌飼料W青膽飼料的形式較為常見，東北農業大學的 劉飛（劉飛；范麗萍等.乳酸菌發酵青膽對奶牛產奶量及乳成分的影響.家畜生態學報， 2006,27(4) :38-40)等W玉米乳桿菌和堅強腸球菌發酵玉米青膽，在第30天青膽飼料成熟 后測得乳桿菌活菌含量為4X107CFU/g鮮樣，發酵周期較長，活菌含量低。
[0007] 迄今為止，已報導的乳酸菌的制備幾乎都是利用W葡萄糖、蛋白腺、酵母膏、無機 鹽、微量元素、維生素等為原料合成的培養基來進行發酵的，如中國專利《乳酸菌生物飼料 添加劑的制備方法》(專利號= 201010122147)、《一種飼用乳酸菌高密度發酵培養基及其發 酵方法K專利號201110116555)，中國專利申請《乳酸菌的一種高密度培養方法》（申請號 200710004941.2 .)、《一種乳酸菌高密度培養方法》（申請號200910057650)，W及《高效乳酸 菌直投式發酵劑的研制》譚歡.[J].湖南農業科學，2012,（9) :102-104,107等文都使用了上 述方法，培養后液體中乳酸菌計數均可達109c化/ml W上，但是原料成本高，原料成本占到 發酵成本的30 %-50% ;并且還要對培養基進行全程滅菌，同時還要恒溫到36°C或42°C進行 培養，能源消耗也高;此外發酵廢液的處理也非常復雜。偶見用生物質原料如渡蘿皮、平茹 浸汁和馬鈴馨汁來進行增菌的報道，《新型乳酸菌增菌培養基研究》杜磊等[J]乳業科學與 技術，.2012,35(1)4-7.)此方法除具有需要滅菌、恒溫等能源消耗高之缺點外，還存在原料 來源不穩定、不易保存等缺陷。因此，在我國還沒有實現乳酸菌的工業化生產。
[000引綜上所述，本發明首次提出W蜜要廢水為主要原料，經優化培養基配方，并W液態 發酵工藝培養乳酸菌，生產高附加值的活菌飼料，本發明的關鍵在于W蜜要廢水替代傳統 乳酸菌培養所使用的高成本原料，降低乳酸菌培養成本，同時使飼料活菌含量達到規定要 求。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是通過生物資源轉化的手段，將蜜要廢水經微生物發酵制成富含活 性乳酸菌的高檔飼料，并進行大規模工業化生產。
[0010] 本發明的技術方案:一種利用蜜要廢水培養乳酸菌及生產乳酸活菌飼料的方法， 采用飼用乳酸菌為培養菌株，W蜜要廢水為主要原料，經培養基的優化，采用二次分段液態 發酵的方式，制成乳酸菌含量高的飼料產品；
[0011] 其中蜜要廢水的COD高達90000mg/L。
[0012] 菌種:植物乳桿菌，購自生合生物科技(南京)有限公司。
[0013] 液態發酵培養基Wg/L計:蜜要廢水中直接添加 KsHP化.3此0 1.5g/L、乙酸鋼2g/L、 巧樣酸S錠5g/L、MgS〇4.7出0 1.5g/L、MnS〇4.H2〇 0.5g/L、維生素 Bi9.5mg/L和吐溫-80 3.51111/1，9巧直6.2-6.6，121°(：滅菌2〇111111;
[0014] 發酵培養條件：（1)將冷凍保藏的植物乳桿菌接種于MRS液體培養基中，于37°C培 養12小時，連續活化S代后，作為種子液；（2)蜜要廢水中直接添加KsHP化.3此0 1.5g/L、乙 酸鋼2g/L、巧樣酸S錠5g/L、MgS〇4.7出0 1.5g/L、MnS〇4.出0 0.5g/L、維生素Bi 9.5mg/L和吐 溫-80 3.5ml/L，pH值調至6.6;(3)按4乂八％的接種量將步驟（1)的種子液接種于步驟(2)的 發酵培養基中于33°C，轉速30巧m振蕩培養；（4)當發酵培養基的抑值降至5.別寸，流加使用 液態發酵培養基配制的IOmol/L化0田容液使培養基的pH值穩定在6.6，發酵過程中不通氣， 于30°C，轉速25rpm條件下降溫二次發酵12小時，獲得的植物乳桿菌發酵液中活菌數達8* l〇WCFU/mlW上。
[0015] 本發明的有益效果:本發明選用蜜要廢水為主要生產原料，培養飼用乳酸菌，使廢 物資源化，降低生產乳酸菌的成本。本發明優化了乳酸菌的培養基成分，并采用液態二階段 發酵的方式，高密度培養飼料用乳酸菌，在較短的時間內即可實現菌落個數lO^c化/mL。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1.發酵培養基的優化
[0017] 使用蜜要廢水，分別與K2冊化.3此0、乙酸鋼、巧樣酸S錠、MgS化.7此0、MnS〇4.此0、 維生素Bi和吐溫-80分別進行正交實驗，檢測最佳的混合比例，從而實現最優的發酵效果； [001引通過驗證，發現培養基的配方為蜜要廢水中直接添加K2HP化.3出0 1.5g/L、乙酸鋼 2g/L、巧樣酸S錠5g/L、MgS04.7出0 1.5g/L、MnS04.出0 0.5g/L、維生素Bi 9.5mg/L和吐溫- 80 3.5ml/L，抑值6.2-6.6的時候，乳酸菌的發酵效果最好，因此選取該培養基配方為最佳 的發酵培養基配方。
[0019] 實施例2發酵條件的優化
[0020] 1、菌株的活化
[0021 ]將冷凍保藏的植物乳桿菌接種于MRS液體培養基中，于37°C培養12小時，連續活化 =代后，作為種子液;活化=代之后，菌株的活性最好，比活化一代或者二代的菌株的活性 都有大幅度的提局。
[0022] 2、發酵條件的選擇
[0023] 接種量對乳酸菌生長的影響：合適的接種量既要縮短發酵周期，又要保證菌體能 正常生長。接種量過低會延長發酵周期，過高又會造成菌體提前老化。實驗證明：10%的接 種量能使活菌含量達到理想水平，同時發酵周期也不是太長。
[0024] 初始pH值對乳酸菌生長的影響:抑值過高或過低都不利于乳酸菌的大量生長，通 過實驗確定植物乳酸菌生長的最適pH為6.6。
[0025] 發明人列舉如下六種具體的方法，如下所述：
[0026] 方法(1)，W10%的接種量將種子液接入液態發酵培養基中，接種前先測定種子液 OD值，接種好后置于37°C培養箱中靜置培養1她~24h，測活菌數。
[0027] 方法(2)，W4%的接種量將種子液接入液態發酵培養基中，接種前先測定種子液 OD值，接種好后置于37°C培養箱中靜置培養1她~24h，測活菌數。
[0028] 方法(3)，W10%的接種量將種子液接入液態發酵培養基中，接種前先測定種子液 OD值，接種好后置于33°C培養箱中靜置培養1她~24h，測活菌數。
[0029] 方法(4)，按10%的接種量將種子液接種于發酵培養基中于33°C，接種前先測定種 子液OD值，轉速30rpm振蕩培養;當發酵培養基的pH值降至5.別寸，流加使用液態發酵培養基 配制的lOmol/L化OH溶液使培養基的pH值穩定在6.6，發酵過程中不通氣，于30°C、轉速 25巧m條件下降溫二次發酵12小時，測活菌數。
[0030] 方法(5)，按10%的接種量將種子液接種于發酵培養基中于33°C，接種前先測定種 子液OD值，轉速30rpm振蕩培養;當發酵培養基的pH值降至5.別寸，流加使用液態發酵培養基 配制的lOmol/L化OH溶液使培養基的pH值穩定在6.6，發酵過程中不通氣，于33 °C，轉速 25巧m條件下二次發酵12小時，測活菌數。
[0031] 方法(6)，按10%的接種量將種子液接種于CN 104004679 B中公開的發酵培養基 中于33°C，接種前先測定種子液OD值，轉速30rpm振蕩培養；當發酵培養基的pH值降至5.8 時，流加使用液態發酵培養基配制的lOmol/L NaO田容液使培養基的抑值穩定在6.6，發酵過 程中不通氣，于30°C、轉速25巧m條件下降溫二次發酵12小時，測活菌數。
[0032] 活菌檢測采用平板菌落計數法。
[0033] 結果如下：
[0034]
[0035]
[0036] 從W上結果可W看出，采用本發明的發酵培養基W及相應的二階段降溫發酵策略 可W使得發酵之后產生的菌落總數得到較大幅度的提高。比現有技術的發酵方法都要優 越。
[0037] 實施例3處理后廢水指標
[0038] 將發酵后的發酵液經離屯、，收集菌體后，采用《重銘酸鹽法(GB11914-89)》測定 C0D，分光光度法測定色度。結果為COD去除98.3%，色度去除96.5%。大大降低了廢水的處 理條件。具有較好的處理效果。
[0039] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可W對之作一些修改或改進，運對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的運些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種乳酸菌發酵的方法，其特征在于采用培養基進行乳酸菌進行發酵。2. -種液態發酵培養基，其特征在于各組分以g/L計：在蜜棗廢水中直接添加 K2HP〇4.3H20 1.5g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三銨5g/L、MgS〇4.7H20 1.5g/L、MnS〇4.H20 0.5g/ 1、維生素出9.511^/1和吐溫-80 3.51111/1，？!1值6.2-6.6。3. -種利用蜜棗廢水進行乳酸菌發酵的方法，包括：（I)將冷凍保藏的植物乳桿菌接種 于MRS液體培養基中，于37°C培養12小時，連續活化三代后，作為種子液；（2)蜜棗廢水中直 接添加 Κ2ΗΡ〇4· 3H20 1 · 5g/L、乙酸鈉2g/L、檸檬酸三銨 5g/L、MgS〇4.7H20 1 · 5g/L、MnS〇4.H20 0.5g/L、維生素 B1 9.5mg/L和吐溫-80 3.5ml/L，pH值調至6.6;(3)按扣八％的接種量將步 驟（I)的種子液接種于步驟(2)的發酵培養基中于33°C，轉速30rpm振蕩培養；（4)當發酵培 養基的pH值降至5.8時，流加使用液態發酵培養基配制的lOmol/L NaOH溶液使培養基的pH 值穩定在6.6，發酵過程中不通氣，于30°C，轉速25rpm條件下降溫二次發酵12小時。
【文檔編號】C12R1/25GK105925515SQ201610551933
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月14日
【發明人】蘇永鵬
【申請人】貝嘉美（天津）生物技術研發有限公司