一株短雙歧桿菌及其制備共軛亞油酸或共軛亞麻酸的應用
【專利摘要】本發明涉及一種短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)C11(CCFM683)及其用途。本發明短雙歧桿菌C11(CCFM683)能夠高效將游離亞油酸、亞麻酸分別轉化為更具生物活性的共軛亞油酸、共軛亞麻酸，可直接用于制備共軛亞油酸、共軛亞麻酸，也可用于生產富含共軛亞油酸、共軛亞麻酸的食品。CGMCC No. 1182820151204
【專利說明】-株短雙歧桿菌及其制備共輛亞油酸或共輛亞麻酸的應用 【技術領域】
[0001 ] 本發明設及一株篩選得到的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)Cll菌株，W及 該菌株在制備共輛亞油酸或共輛亞麻酸中的應用。 【【背景技術】】
[0002] 共輛亞油酸（Conjugated Iinoleic acid,CLA)是含有共輛雙鍵的十八碳二締酸 總稱，是亞油酸化inoleic acid, 18:2)的位置異構體和幾何異構體。最豐富、最常見的異構 體是順9，反11-化4(。9，111-化4)，亦被稱為瘤胃酸(咖1116111。日別(1)。此外，反10，順12-化八 (tlO，cl2-CLA)也是自然界含量相對較高的異構體。共輛亞油酸因其生物功能而受到關注， 不同的共輛亞油酸異構體具有不同的生理功能，其中c9，tll-CLA和tlO，cl2-CLA是公認的 最具生理活性的共輛亞油酸異構體，c9，tll-CLA最主要的功能在于抗癌、抗炎及免疫調節 等方面，而tlO，cl2-CLA對于減肥和脂質代謝方面的影響是非常顯著的。此外，t9，tll-CLA 也被報道具有抗炎等活性。
[0003] 共輛亞麻酸（Conjugated Iinolenic acid,CLNA)是由亞麻酸(Xinolenic acid, LNA)衍生而來具有共輛雙鍵的十八碳=締酸多種位置與幾何異構體的總稱，它具有多種營 養和保健功能，如抗癌、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化、降低體脂含量、膜島素抵抗、調節機體 免疫等多種營養和保健功能，已成為醫學、化學、營養學等領域的研究熱點。在共輛亞麻酸 的各種立體異構體中，。9，111，。15-化臟(化臟1)、19，111，。15-化臟(化臟2)、110，。12，。15- CLNA和c6，c9，tl I-CLNA等是被認為最具生物活性的異構體。
[0004] 天然的共輛亞油酸主要存在于瘤胃動物牛、羊等的乳脂及肉制品中，每克乳脂中 含量從2mg-25mg不等，且CLA含量隨奶牛年齡增長而增加。非天然來源的CLA主要通過人工 合成獲得。人工合成的CLA因其原料和合成方法不同，所得產品中各異構體的含量相差甚 遠。
[0005] 天然的共輛亞麻酸存在于自然界的一些植物種子如石惱巧、油桐巧、苦瓜巧、金盞 花巧、括樓和藍花搖巧等。然而，眾多含有共輛亞麻酸的植物種子中僅括樓巧可直接食用， 且植物種巧中的油脂成分很復雜，W植物巧油脂為原料實現共輛亞麻酸的分離與純化十分 困難。
[0006] 另一方面，現有技術通過堿處理亞麻酸異構化法也可產生共輛亞麻酸，但其產率 較低，且有試劑殘留，故至今尚未實現共輛亞麻酸的工業化生產。
[0007] 目前有研究發現通過微生物轉化CLAXLNA，特別有些乳酸菌具有共輛亞油酸和共 輛亞麻酸轉化能力，例如Gorissen等對30多株雙歧桿菌生物轉化CLA和共輛亞麻酸進行了 研究，在36株雙歧桿菌中發現6株可W產CLA或CLNA，6株雙歧桿菌中對兩種共輛脂肪酸的轉 化率最高的分別為53%、78% (Gorissen L,et al.Production of con化gated Iinoleic acid and conjugated!inolenic acid isomers by Bifidobacterium species[J].Appl Microbiol Biotechnol ,2010,87(6) :2257-2266.)。然而，所得脂肪酸的異構體并非Wc9, tl I-化A和tlO，cl2-化A或c9，tl I，cl5-化NA和t9，tl I，cl5-化NA為主。 【
【發明內容】
】
[0008] 本發明的目的是克服現有技術缺陷，獲得一株異常高產共輛亞油酸、共輛亞麻酸、 且轉化率更高、且產物中Wc9，tll-CLA和tl0，cl2-化A或c9，tll，cl5-化NA和巧，tll，cl5- CLNA為主的短雙歧桿菌菌株，且脂肪酸產物留存在發酵液中W易于分離純化。
[0009] 到本發明還提供上述菌株在產共輛亞油酸或共輛亞麻酸中的應用。
[0010] 為了實現W上目的，本發明提供一株短雙歧桿菌(Bif idobacterium breve)Cll， 該菌株已于2015年12月04日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，其保 藏號為CGMCC No. 11828。
[0011] 運株短雙歧桿菌Cl 1也被命名為CCFM683，留存于江南大學食品生物技術菌種保藏 中屯、。
[0012] 本發明的菌株經分離、篩選后，采用了包括細菌基因組DNA提取、16S rDNA特異引 物PCR擴增、擴增產物純化、DNA測序、序列比對等步驟進行種屬鑒定，鑒定為短雙歧桿菌，并 命名為短雙歧桿菌Cll (或CCFM683)。
[0013] 短雙歧桿菌Cl 1具有下述生物學特性：
[0014] 菌體特征:呈乳白色。
[0015] 菌落特征：在mMRS固體平板上菌落突起，光滑、圓形、乳白色、半透明、直徑為1~ 2mm
[0016] 生長特性:在37 °C恒溫厭氧的條件下，在MRS培養基中培養約24h達到對數末期。
[0017] 短雙歧桿菌是雙歧桿菌屬中的一種。雙歧桿菌屬共包含35個種，包括青春雙歧桿 菌、動物雙歧桿菌動物亞種、動物雙歧桿菌乳酸亞種（即乳雙歧桿菌）、兩歧雙歧桿菌、熊峰 雙歧桿菌、布姆雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈雙歧桿菌、豚雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、家兔雙歧 桿菌、齒雙歧桿菌、沒食子雙歧桿菌、雞雙歧桿菌、長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞 種、大雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、假長雙歧桿菌假長亞種、假長雙歧桿菌球 旋蟲亞種、小雞雙歧桿菌、細長雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等。
[0018] 由于雙歧桿菌屬種類繁多，同屬不同種的雙歧桿菌在形態、生理、代謝及生理功能 等多方面存在顯著差異，目前為止，尚未有研究發現短雙歧桿菌能夠轉化共輛脂肪酸，僅少 數同屬不同種的菌株具備較低轉化率。目前也尚未有研究確定導致差異的原因或機理。
[0019] 本發明還提供所述短雙歧桿菌Cll在制備共輛亞油酸中的應用，特別地將亞油酸 轉化為共輛亞油酸，特別是轉化為c9，tl I-CLA和tio，C12-CLA。
[0020] 本發明還提供所述短雙歧桿菌Cll在制備共輛亞麻酸中的應用，特別地將亞麻酸 轉化為共輛亞麻酸，特別是轉化為c9，tl 1，Cl5-化NA和t9，tl 1，Cl5-化NA。
[0021] 本發明還提供所述短雙歧桿菌Cll在制備富含共輛亞油酸、共輛亞麻酸的食品中 的應用。
[0022] 短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)Cll，該菌株于2015年12月04日在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國 科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 11828。 【【附圖說明】】
[0023] 圖I為本發明中短雙歧桿菌的分離、純化及保藏操作流程圖；
[0024] 圖2為本發明短雙歧桿菌B.breve C1UCCFM683)共輛亞油酸的轉化率；
[0025] (A)共輛亞油酸總濃度隨培養時間的變化
[0026] (B)培養72小時后培養液、胞內的共輛亞油酸的分布
[0027] 圖中：SA:硬脂酸，VA:異油酸，OA:油酸，LA:亞油酸，CLAl: c9，111-CLA，CLA2:巧， tIl-CLA
[0028] 圖3為本發明短雙歧桿菌B.breve C1UCCFM683)共輛亞麻酸的轉化率；
[0029] (A)共輛亞麻酸總濃度隨培養時間的變化
[0030] (B)培養72小時后培養液、胞內的共輛亞麻酸分布
[0031] 圖中：0A:油酸，LA:亞油酸，ALA:亞麻酸，化NAl:c9，tll，cl5-化NA,化NA2:巧，til, C15-化NA 【【具體實施方式】】
[0032] 下述實施例用于非限制性地解釋本發明的技術方案。
[0033] 在本發明中，如無特殊說明，用于說明濃度或比例的"％"或百分比均為重量百分 比。
[0034] 本發明設及W下培養基：
[0035] mMRS液體培養基:膜蛋白腺lOg、牛肉浸膏lOg、酵母粉5g、葡萄糖20g、巧樣酸氨二 錠2g、醋酸鋼5g、憐酸氨二鐘2g、屯水硫酸儀0.5g、一水合硫酸儘0.25g，吐溫801血與0.5g半 脫氨酸，加水至1000 mL。
[0036] mMRS固體培養基是在W上基礎添加W液體培養基總重計1.5%瓊脂得到的。
[0037] 實施例1:樣品的采集和雙歧桿菌的分離鑒定
[0038] 新生兒糞便樣品，采集于無錫市第九人民醫院。
[0039] 取Ig新生兒糞便樣品，梯度稀釋后涂布于mMRS固體培養基，置于厭氧環境下在37 °C下培養72h，觀察記錄菌落形態，挑去菌落劃線純化，然后在MMRS液體培養基中在37°C下 培養4她，所得菌落進行革蘭氏染色并記錄菌株形態，棄除菌落中的革蘭氏陰性菌株和革蘭 氏陽性球菌，挑選得到革蘭氏陽性桿菌，經過過氧化氨酶分析后棄除過氧化氨酶陽性菌株， 保留過氧化氨酶陰性菌株，W果糖-6-憐酸激酶檢測W棄除陰性菌株，所得均經過16S rDNA 測序鑒定為短雙歧桿菌，命名為短雙歧桿菌C11。所得短雙歧桿菌進行傳代培養，收集菌體 置于離屯、管中3000rpm離屯、IOmin洗涂，重復3次，所得菌體加入基體保護劑中進行凍存、保 藏。
[0040] 168扣麻擴增條件：951：5111111;35個循環（951：3〇3,551：3〇3,721：2111111);721： IOmin
[0041] 擴增引物：
[0042] 27F:(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）
[0043] 1492R:(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3'
[0044] 擴增產物純化和序列比對過程按文獻（Turroni F et al.Exploring the Diversity of the Bifidobacterial Population in the Human Intestinal Tract[J] .Appl Environ Microb.2009;75(6) :15:34-45)記載的方法進行。
[0045] 所得短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve Cl I (CCFM683))的基本特性見表1。
[0046] 表1短雙歧桿菌C1UCCFM683)的基本特性
[0047]
[004引實施例2:短雙歧桿菌Cl 1 (CCFM683)生物轉化共輛亞油酸 [0049]具體實驗如下：
[0化日]1、菌株活化
[0051]從-80°C冰箱取出保有短雙歧桿菌Cll的甘油管，取菌液劃線于mMRS固體培養基 上，厭氧環境下37°C培養4她。挑取長出的單菌落并接種于mMRS液體培養基中，厭氧環境下 37 °C培養4她，連續活化3代。
[0化2] 2、亞油酸母液的配制
[0化3] 稱取300mg亞油酸(LA)和200mg Tween-80溶于水并定容至IOmL,充分攬拌乳化后， 經0.45WI1無菌濾膜過濾除菌后保存于-20°C避光保存。
[0化4] 3、與亞油酸共培養
[0化日]將活化好的菌液按照2% (v/v)接種量接種至含0.64mg/mL LA(210iil前述亞油酸 母液）的IOmL mMRS液體培養基中，厭氧環境下37°C培養0、12、24、48、7化，同時W添加等量 亞油酸母液而不添加菌液的培養基為對照。培養后，將菌液移至離屯、管中，WSOOOrpm離屯、 5min，每份發酵產物各取3份3mL發酵液至干凈離屯、管待用，離屯、后所得菌體待用。
[0056] 4、脂肪酸提取
[0057] 提取發酵液中的脂肪酸：向每一支3mL發酵液中添加十屯燒酸(C17:0)至終濃度為 0.075mg/mL作內標，然后添加2mL異丙醇，充分振蕩30s ;再添加3mL正己燒，充分振蕩30s ; 500化pm離屯、3min，吸取正己燒層至干凈提脂瓶中，氮氣吹干得到脂肪酸。
[005引提取菌體中的脂肪酸：前述離屯、所得菌體用2mL鹽溶液（0.137mol/L NaCl, 7.Ommol/L K2HPO4,2.5mmoL/L K此P04)洗涂，4000rpm離屯、5min，重復洗涂步驟。再將菌體重 懸于2mL前述鹽溶液中，添加十屯燒酸C17:0至終濃度為0.0575mg/mL，按與發酵液相同的方 法進行脂肪酸提取及氮氣吹干，得到菌體中的脂肪酸。
[0059] 5、脂肪酸甲醋化
[0060] 向前述發酵液脂肪酸、菌體脂肪酸用氮氣吹干后分別加入40化L甲醇，充分振蕩混 勻后W15化L重氮甲燒試劑直接進行甲醋化，氮氣吹干后用ImL正己燒回溶，轉移至氣相瓶， 待進行GC-MS檢測。
[0061 ] 6、GC-MS 檢測
[0062] 島津氣相色譜儀(GC 2010plus)，氣相柱IUx-wax(30mX0.25mmX0.25皿），質譜儀 (島津叫tra QP2010)。
[0063] 程序升溫條件:初始150°C，W5°C/min的速率升溫至200°C，保持1 Omin，后W4°C/ min升溫至230°C，保持18min。采用分流進樣，進樣量化L，分流比50:1，氮氣為載氣。進樣器 溫度和檢測器溫度均為240°C。離子源220°C，強度為70eV。
[0064] 7、實驗結果
[0065] 所得脂肪含有:硬脂酸0.043mg/mL、油酸0.017mg/mL、異油酸0.005mg/mL、亞油酸 0.087mg/mL、CLA0.4703mg/mL。
[0066] 化A的積累過程中，短雙歧桿菌CCFM683在含有0.64mg/mL LA的mMRS中生長12h時 開始轉化CLA，隨著菌體生長共輛亞油酸的含量逐漸增加(24h、3化），培養36h后發酵液中共 輛亞油酸的濃度趨于飽和，如圖2-A所示。該菌對LA的最大轉化率為培養72h左右，CLA的總 含量達到了0.4703mg/mL，W底物LA總量計CLA的總轉化率為73.48%。
[0067] 經過脂肪酸分析，從CLA各異構體含量來看，所得發酵產物只含有CLAl和CLA2兩種 異構體。菌株在培養1化后開始轉化CLAl。隨著菌體生長，異構體CLAl在12h到3化內快速累 積，CLAl的含量在菌株培養36h后趨于飽和，而CLA2在菌株開始積累CLA時（24h)含量較低， 隨著培養時間的延長，該異構體的濃度也進一步增加。培養72h后，CLAl的濃度高達為 0.4392mg/mL，占總化A產量的93.39%。
[0068] 從培養7化后短雙歧桿菌C1UCCFM683)發酵液及菌體脂肪酸組成可發現，該菌對 LA的吸收與轉化率均極高，顯著高于現有技術。分析顯示，發酵液中僅剩少量的底物LA且菌 體內也幾乎未殘留尚未被轉化的LA。轉化得到的CLA絕大多數均處于發酵液中，菌體內存留 的量僅為〇.〇62mg/mL、顯著少于發酵液中的CLA濃度。該結果也表明絕大多數CLA產物均不 在胞內積累，而是被轉運至胞外，且CLA在發酵液中占總脂肪酸的比例超過75%，純度較高， 因此能夠有效簡化后期對發酵液中CLA的分離純化。
[0069] 實施例3:短雙歧桿菌Cl 1 (CCFM683)生物轉化共輛亞麻酸
[0070] 1、菌株活化
[0071] 從-80°C冰箱取出保有短雙歧桿菌Cll的甘油管，取菌液劃線于mMRS固體培養基 上，厭氧環境下37°C培養4她。挑取長出的單菌落并接種于mMRS液體培養基中，厭氧環境下 37 °C培養4她，連續活化3代。
[0072] 2、亞麻酸母液的配制
[0073] 稱取SOOmga-亞麻酸(a-LNA)和200mg Tween-80溶于水并定容至IOmL,充分攬拌乳 化后，經0.45WI1無菌濾膜過濾除菌后保存于-20°C，避光保存。
[0074] 3、與亞麻酸共培養
[0075] 將活化好的菌液按照2%(v/v)接種量接種至含a-LNA 0.3759mg/mL的IOmL mMRS 液體培養基中，厭氧環境下37°C培養0、12、24、36、48、72h，同時W添加等量亞麻酸而不添加 菌液的培養基為對照。培養后，將菌液移至離屯、管中，50(K)rpm，離屯、5min;取3份3mL發酵液 至干凈離屯、管待用。
[0076] 4、脂肪酸提取
[0077] 發酵液中脂肪酸的提取：向3mL發酵液中添加十屯燒酸（C17:0)至終濃度為 0.0767mg/mL作內標，然后添加2mL異丙醇，充分振蕩30s;再添加3mL正己燒，充分振蕩30s; 500化pm離屯、3min，吸收正己燒層至干凈提脂瓶中，氮氣吹干，得到發酵液中的脂肪酸。
[007引菌體中脂肪酸提取：前述離屯、所得菌體用2mL鹽溶液（含0.137mol/L NaCl, 7. Ommol/L K2HPO4，2.5mmoL/L KH2PO4)洗涂，4000rpm離屯、5min，重復洗涂步驟。所得菌體重 懸于2mL上述鹽溶液中，添加十屯燒酸(C17:0)至終濃度為0.0575mg/mL，按與發酵液相同的 處理方法進行脂肪酸提取及氮氣吹干。
[0079] 5、脂肪酸甲醋化
[0080] 向氮氣吹干后的樣品中加入4(K)化甲醇，充分振蕩混勻后W適量重氮甲燒試劑直 接進行甲醋化，氮氣吹干后用ImL正己燒回溶，轉移至氣相瓶，待進行GC-MS檢測。
[0081 ] 6、GC-MS 檢測
[0082] 島津氣相色譜儀(GC 2010plus)，氣相柱IUx-wax(30mX0.25mmX0.25皿），質譜儀 (島津叫tra QP2010)。程序升溫條件:初始溫度150°C，W5°C/min的速率升溫至200°C，保持 lOmin，然后W4°C/min升溫至230°C，保持18min。采用分流進樣，進樣量化L，分流比50:1，氮 氣為載氣。進樣器溫度和檢測器溫度均為240°C。離子源220°C，強度為70eV。
[0083] 7、實驗結果
[0084] 短雙歧桿菌Cll在含有0.3759mg/mLa-LNA的mMRS中生長1化時開始轉化化NA,隨著 菌體生長共輛亞麻酸的含量逐漸增加（24h、3化），培養3加后共輛亞麻酸的含量趨于飽和， 如圖3-A。該菌對LNA的最大轉化率為培養7化左右，化NA的總含量達到了0.3347mg/mL，W底 物a-LNA總量計其轉化率為89.04%。
[0085] 經過化NA各異構體含量分析，所得產物中只有化NAl和化NA2兩種異構體，即共輛 亞麻酸中最具有生物活性的。9，*11，。15-化魁和巧，*11，(315-化魁。菌株在培養1211后開始 轉化共輛亞麻酸，隨著菌體生長，異構體CLNAl在1化到36h內快速累積，CLNAl的含量在菌株 培養3加后趨于飽和，而化NA2在菌株開始積累化NA時（24h)含量較低，隨著培養時間的延 長，該異構體的濃度也進一步增加，最終化NAl濃度為0.3218mg/mL，化NA2濃度為0.0129mg/ ITlL O
[0086] 從培養7化的短雙歧桿菌C1UCCFM683)發酵液及菌體脂肪酸組成可W發現，該株 菌對a-LNA的吸收與轉化率均極高，顯著高于其他現有技術。且經過分析得知，發酵液中幾 乎沒有底物LNA剩余而且菌體內也僅剩極少量的LNA尚未被轉化，所轉化的CLNA絕大多數均 處于發酵液中，菌體內存留的量也非常少。且化NAl和化NA2在發酵液與菌體內的分布情況 基本一致，該結果也表明絕大多數的產物均不在胞內積累，而是被轉運至胞外，因此有利于 后期的進一步分離與純化。
【主權項】
1. 一株短雙歧桿菌(Bif idobacterium breve)Cl I，該菌株于2015年12日04日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC No. 11828。2. 權利要求1所述的短雙歧桿菌Cll在制備共輒亞油酸中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述短雙歧桿菌Cll將亞油酸轉化為共輒亞 油酸。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述共輒亞油酸是c9，tll-CLA和tl0，cl2-CLA05. 權利要求1所述的短雙歧桿菌Cll在制備共輒亞麻酸中的應用。6. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述短雙歧桿菌Cl 1將亞麻酸轉化為共輒亞 麻酸。7. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述共輒亞麻酸是c9，111，c 15-CLNA和t9， tll，cl5-CLNA〇8. 權利要求1所述的短雙歧桿菌Cll在制備富含共輒亞油酸、共輒亞麻酸的食品中的應 用。
【文檔編號】C12R1/01GK105925514SQ201610547034
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】楊波, 陳衛, 陳海琴, 趙建新, 張灝, 陳永泉
【申請人】江南大學