一種好氧反硝化假單胞菌及其應用
【專利摘要】假單胞菌(Pseudomonas sp.)HC?1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.11924，保藏日期為2015年12月24日。本發明所提供的假單胞菌(Pseudomonas sp.)HC?1具有較高的好氧反硝化性能，用于污水生物脫氮工藝總氮去除率高達88.2％，這些特點在水處理領域具有重大意義。CGMCC No.1192420151224
【專利說明】
-種好氧反硝化假單胞菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程、環境工程技術領域，設及一種好氧反硝化菌株及其應用，同 時提供運種菌株的脫氮效能。
【背景技術】
[0002] 當前，隨著國民經濟地迅速發展和城市化進程地不斷深入，城市生活和工業廢水 的排放總量也在逐年增加，農藥、化肥和合成洗涂劑等廣泛使用，使得水體中的營養物質濃 度不斷升高，其中氮是引起水體富營養化的主要原因之一。常規的生化處理工藝可W有效 地降低污水中的BOD和SS，但當污水中同時存在的N、P等營養物的時候，只能去除污水中30- 40 %的N元素，大量含氮污水將直接排入環境水體。
[0003] 傳統的生物脫氮包括好氧硝化和缺氧反硝化兩個過程:首先在好氧條件下，亞硝 酸鹽將氨氮氧化為亞硝酸鹽，而后硝酸菌將亞硝酸氮進一步氧化為硝酸氮；隨后在缺氧條 件下，反硝化菌將硝酸氮或亞硝酸氮還原成氣體氮或者化0。好氧反硝化具有W下優點：（1) 在有氧條件下進行反硝化，使得同步硝化反硝化(SND)成為可能；（2)硝化反應的產物可直 接成為反硝化反應的底物，避免了培養過程亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累對硝化反應的抑制， 加速了硝化和反硝化進程;同時，反硝化會補償硝化反應消耗的堿度，維持了反應系統pH值 穩定，降低了操作難度和運行成本；（3)大部分好氧反硝化菌適應性較強、生長速度快、產量 高并且對溶解氧濃度要求較低，反硝化速度快且徹底，適合治理大面積氮污染水域。因此， 好氧反硝化技術作為一種全新的脫氮技術備受研究者關注。
[0004] 然而，到目前為止，好氧反硝化菌株主要集中在Pseudomonas菌屬、Bacillus菌屬 和Aeromonas菌屬，菌種較為單一，且研究多集中在降解基因和降解機理方面，實際應效果 不佳。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一目的在于提供一種好氧反硝化效果好的假單胞菌。
[0006] 本發明的第二目的在于提供該假單胞菌在水處理中的應用。
[0007] 本發明的第=目的在于提供該假單胞菌在好氧反硝化水處理中的應用。
[000引為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為:一種假單胞菌，其分類命名 為假單胞菌(Pseudomonas SP. )HC-1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中屯、，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼 為100101，其保藏編號為CGMCC No.11924,保藏日期為2015年12月24日。
[0009] 假單胞菌(Pseudomonas SP.)肥-1的生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八 版操作，生理活性特征如下:假單胞菌(Pseudomonas SP. )HC-1為非發酵革蘭氏陰性菌，專 性需氧菌，生長溫度范圍25-42°C，最適生長溫度為25-30°C，特別是該菌在4°C不生長而在 42 °C可W生長;菌體長度為1.5-3. Own,寬度為0.5-0.祉m，單在，成對或偶爾成短鏈，菌體有 1-3根鞭毛，無芽抱;該菌株不需要有機生長因素；營養多樣化:單個菌株的生長可利用76- 82種或更多的不同有機化合物。
[0010]革蘭氏染色表現為陰性:對菌株進行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發 酵，產嗎I噪，V.P.測定，M.R.測定，明膠液化，淀粉水解，巧樣酸鹽利用，硝酸鹽還原等主要生 理生化指標試驗，結果如表1所示。
[0011 ] 表1假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1的生理生化指標
[0012]
[0013] 所述的假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1是在水處理中的應用。
[0014] 所述的假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1是在含氮廢水處理中的應用。
[0015] 具體應用方法，包括W下步驟:將權利要求1所述的假單胞菌(Pseudomonas sp.) 肥-1菌落接種于培養基中，在25°C-42°C下培養12-4化，得到的發酵液作為應用菌劑。
[0016] 優選地，所述好氧反硝化培養基配方為：下二酸鋼4.7g/L、憐酸氨二鋼7.9g/L、憐 酸二氨鐘1.5g/L、氯化錠0.3g/L、硫酸儀0.1 g/L、硝酸鐘1.5g/L、微量元素Iml，余量為水，pH =7.2~7.5;所述微量元素配方為:EDTA 50g/L、硫酸亞鐵5. Og/L、硫酸鋒2.2g/L、鋼酸錠 1. Ig/L、氯化巧5.5g/L、硫酸銅1.57g/L、氯化儘5.06g/L、氯化鉆1.61g/L，余量為水。
[0017]有益效果：
[001引本發明所提供的假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1具有較高的好氧反硝化性能， 用于污水生物脫氮工藝總氮去除率高達88.2%，運些特點在水處理領域具有重大意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1是假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1的生長曲線圖；
[0020]圖2是假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1對總氮的去除效能圖。
【具體實施方式】
[0021 ]下面結合實驗例詳細闡述本發明假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1的應用。
[0022] 本發明使用的好氧反硝化培養基配方為:下二酸鋼4.7g/L、憐酸氨二鋼7.9g/L、憐 酸二氨鐘1.5g/L、氯化錠0.3g/L、硫酸儀0.1 g/L、硝酸鐘1.5g/L、微量元素Iml，余量為水，pH =7.2~7.5;所述微量元素配方為:EDTA 50g/L、硫酸亞鐵5. Og/L、硫酸鋒2.2g/L、鋼酸錠 1. Ig/L、氯化巧5.5g/L、硫酸銅1.57g/L、氯化儘5.06g/L、氯化鉆1.61g/L，余量為水。
[0023] 所述硝酸鹽還原培養基配方為：牛肉膏3g/L、蛋白陳5g/L、KN03lg/L、pH7.4;經 12rC高壓蒸汽滅菌20min。
[0024] 實施例1
[0025] 假單胞菌，其分類命名為假單胞菌(Pseudomonas sp.化C-1，保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國 科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號為CGMCC No. 11924，保藏日期為2015 年12月24日。
[00%] 所述假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1是通過W下方式獲得的：
[0027] a.取SBR反應器運行穩定運行半個月的缺氧段末的活性污泥作為分離用泥；
[0028] b.采用稀釋混合平板法進行分離:對己分離出來的菌株在好氧條件下置于反硝化 培養基中進行脫氮試驗，同時輔助進行硝酸鹽還原產氣試驗及異染顆粒染色（亞甲基藍染 色法)檢驗。對于硝酸還原性為陽性并產氣，且在好氧條件下能降低T腳農度的細菌即為本發 明獲得的好氧反硝化菌。
[0029] 具體分離步驟為:從SBR反應器缺氧段末取IOmL活性污泥至裝有90mL無菌水的S 角瓶中，加入無菌玻璃珠;將=角瓶放入搖床中充分振蕩，使細菌呈單細胞狀態分散于水 中。然后，從S角瓶內的污泥菌懸液中取ImL懸液接入裝有9mL無菌水的試管內，得到10^1梯 度的菌懸液，繼續此步驟，依次得到l(T2、l(r3、l(r4……1(T 7梯度的菌懸液，各取ImL水樣放入 裝有含瓊脂的好氧反硝化培養基的培養皿種;待培養基快凝卻時倒入培養皿中，混勻，待培 養基凝固后倒置培養皿于30°C恒溫培養箱中培養2~3天后，分別選取不同形態、菌落清晰 的典型菌落，標記并挑取單個菌落在平板培養基上進行=區劃線分離，重復3~4次至菌落 特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉接到準備好的試管斜面上W備用;上述所有操作 均在無菌條件下進行。
[0030] C.對篩選得到的菌株進行分子鑒定，按W下步驟進行：
[0031] 提取菌株的DNA，經PCR擴增后，然后利用膠回收試劑盒（回收純化PCR產物，之后進 行克隆、轉化，篩選陽性克隆子菌落，經擴大培養后進行測序，測序結果位測得長度為 1450bp的序列，如序列表Seq ID No: 1所示，其序列提交至GenBank, W確定菌株的種屬關 系，最終確定為假單胞菌屬(Pseudomonas SP.)。通過結合菌體形態特征、生長條件、生理生 化鑒定結果其為假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1。
[0032] 所述的PCR擴增過程的具體步驟為：
[0033] 1化0?體系建立（2貼^:
[0034]
[0035] 2)PCR程序設定：
[0036] 預變性 95°C3min
[0037] 95 °C預變性5min，94°C變性Imin，58 °C復性30s，72 °C延伸3min，共30個循環，最后 72°C 延伸 lOmin;
[003引 3)引物序列：
[0039] 引物 1 5 ' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 '
[0040] 引物2 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 '。
[0041] d.對篩選得到的菌株進行生理生化鑒定，按W下步驟進行：
[0042] 菌株的生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版操作，鑒定結果為:假單胞 菌(Pseudomonas SP.)肥-1為非發酵革蘭氏陰性菌，專性需氧菌，生長溫度范圍25-42°C，最 適生長溫度為25-30°C，特別是該菌在4°C不生長而在42°C可W生長;菌體長度為1.5-3.化 m，寬度為0.5-0.祉m，單在，成對或偶爾成短鏈，菌體有1-3根鞭毛，無芽抱;該菌株不需要有 機生長因素;營養多樣化:單個菌株的生長可利用76-82種或更多的不同有機化合物。
[0043] 革蘭氏染色表現為陰性:對菌株進行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發 酵，產嗎I噪，V.P.測定，M.R.測定，明膠液化，淀粉水解，巧樣酸鹽利用，硝酸鹽還原等主要生 理生化指標試驗，結果如表1所示。
[0044] 素^ W段巧.胞苗 T PcPiiHnmrmg C cn HP-1 的化巧化仆；
[0045]
[0046] e.脫氮試驗
[0047] 對己分離出來的假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1在好氧條件下在反硝化培養基 中進行脫氮試驗，同時輔助進行硝酸鹽還原產氣試驗及異染顆粒染色(亞甲基藍染色法)檢 驗;對于硝酸還原性為陽性并產氣，并在好氧條件下能降低T腳農度的細菌，證明其為好氧反 硝化菌。
[004引具體試驗如下:將假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1按常規方法活化、富集培養。
[0049] 富集培養完成后，移取IOmL懸濁液至IOOmL好氧反硝化培養基中30°C 16化pm/min 條件下培養24h;培養完成后SOOOrpm離屯、IOmin，取上清液測定氨氮、硝態氮、亞硝氮及TN的 含量，結果見表2。
[0050] 表2含量測定結果
[0化1 ]
[0化2] 硝酸鹽還原產氣試驗：取假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1在固體瓊脂斜面上進 行培養后的菌種，接種在帶杜氏小管的硝酸鹽還原培養基中，每個菌株作2個平行試驗，同 時另外留2管不接種做對照。
[0053] 30°C恒溫培養，分別在I天、3天、5天后檢測結果:檢查杜氏小管內是否產氣，如有 氣泡表明有氮氣產生;在比色瓷盤中加入少量培養液，滴入1-2滴格里斯試劑A液(對氨基苯 橫酸0.5g; 10%左右稀醋酸150ml)和B液(a-苯胺0.1 g; 10%左右稀醋酸150ml;此0 20ml); 在對照管中同樣加入A液和B液各1-2滴。若溶液變為紅色、澄色或棟色等，表示有亞硝酸鹽 存在，為硝酸鹽還原陽性;如無紅色出現則可加入1-2滴二苯胺試劑(0.5g二苯胺溶于100mL 濃出S〇4,并加20ml蒸饋水稀釋，存于棟色瓶中），如不呈藍色反應則仍為陽性反應，若呈藍色 反應則為陰性反應。
[0化4] 實施例2假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1脫氮效能測定
[0055]本發明假單胞菌(Pseudomonas SP.)肥-1能W多種有機物為碳源，可用于污水生 物脫氮。對假單胞菌（Pseudomonas sp. )HC-1生物脫氮能力進行檢測，本發明假單胞菌 (Pseudomonas sp.)肥-1菌株進行如下功能驗證：
[0化6] 1)假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1生長曲線測定。
[0化7] 按照測定細菌生長曲線的標準方法對假單胞菌(Pseudomonas sp.化C-I的生長曲 線進行測定，每隔化取培養液，采用光電比濁法，在660nm波長處測定菌液的0D66Q(0ptical Density),然后經0.22pm微孔濾膜過濾，檢測濾液TN，pH值等指標。獲得假單胞菌 (Pseudomonas sp.)肥-1生長曲線如圖1所示。
[0化引從圖1中可W看出，假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1的生長曲線比較典型，潛伏 期較短，為化左右，運可能是因為假單胞菌(Pseudomonas sp.)HC-l的活性較強，且接種前 后的培養條件相似，接入后在較短時間內即可適應新的環境。菌株的對數生長期約為4- 1化，1化W后開始進入穩定期和衰亡期。
[0059] 2)假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1脫氮效能測定
[0060] 將假單胞菌(Pseudomonas SP.)肥-1按照常規方法活化，富集培養。富集培養完成 后移取IOml懸濁液至含有100mL不含瓊脂的好氧反硝化培養基的250ml錐形瓶中，在30°C 160巧m/min條件下培養24h。每隔化取培養液，800化pm離屯、IOmin，取上清液測定氨氮、硝態 氮、亞硝氮及TN的含量，結果如圖2所示。
[0061] 從圖2可W看出，菌株HC-I有良好的好氧反硝化效果。
[0062] -般來說傳統反硝化理論認為，由于溶解氧會與硝酸鹽氮競爭電子受體，溶解氧 (DO)的存在會對反硝化過程起到抑制作用，從而抑制反硝化的進行。但是，好氧反硝化理論 的提出轉變了傳統觀念，其理論認為由于菌體中存在周質硝酸鹽還原酶，因此菌株可利用 硝態氮和氧氣同時作為電子受體進行協同呼吸。綜上所述，假單胞菌(Pseudomonas sp.) HC-I為局效的好氧反硝化菌。
[0063] 本
【發明內容】
不僅限于上述各實施方式的內容，其中一個或幾個【具體實施方式】的組 合同樣也可W實現發明的目的。
[0064] 實施例3
[0065] 挑取假單胞菌(Pseudomonas sp.化C-I菌落，菌落接種于好氧反硝化培養基中，在 25°C下培養2地，得到的發酵液作為應用菌劑。該應用菌劑應用于含氮廢水處理，24h TN去 除率:87.2%。
[0066] 實施例4
[0067] 挑取假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1菌落，菌落接種于好氧反硝化培養基中，在 42°C下培養4她，得到的發酵液作為應用菌劑。該應用菌劑應用于含氮廢水處理，24h TN去 除率:88.5%。
[006引實施例5
[0069]挑取假單胞菌(Pseudomonas SP. )HC-1菌落，菌落接種于好氧反硝化培養基中，在 30°C下培養12h，得到的發酵液作為應用菌劑。該應用菌劑應用于含氮廢水處理，24h TN去 除率:88.0%。
【主權項】
1. 假單胞菌(Pseudomonas sp . )HC_1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，其保藏編號為CGMCC No. 11924,保藏日期為2015年12月24日。2. 權利要求1所述的假單胞菌在水處理中的應用。3. 權利要求1所述的假單胞菌在含氮廢水處理中的應用。4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于:包括以下步驟:將權利要求1所述的假單胞菌 (Pseudomonas sp. )HC_1菌落接種于好氧反硝化培養基中，在25°C_42°C下培養12_48h，得 到的發酵液作為應用菌劑。5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于：所述好氧反硝化培養基配方為：丁二酸鈉 4.78/1、磷酸氫二鈉7.98/1、磷酸二氫鉀1.58/1、氯化銨0.38/1、硫酸鎂0.4/1、硝酸鉀 1.5g/L、微量元素 Iml，余量為水，pH = 7.2~7.5;所述微量元素配方為:EDTA 50g/L、硫酸亞 鐵5.0g/L、硫酸鋅2.2g/L、鉬酸銨l.lg/L、氯化鈣5.5g/L、硫酸銅1.57g/L、氯化錳5.06g/L、 氯化鈷1.61 g/L，余量為水。
【文檔編號】C12R1/38GK105925508SQ201610396898
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】尹安偉, 范必平, 查正飛, 宋麗明
【申請人】揚州市海誠生物技術有限公司