一株甲基營養型芽孢桿菌zy3a及其在促進油麥菜生長上的應用
【專利摘要】本發明公開了一株甲基營養型芽孢桿菌ZY3A及其應用，該菌株的分類命名為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）ZY3A，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號：CCTCC NO:M2015547。本發明的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A可以在LB培養基上良好的生長。經過測量油麥菜株高可知甲基營養型芽孢桿菌ZY3A稀釋溶液能促進油麥菜生長。實驗室拮抗實驗表明，ZY3A具有明顯的拮抗效果，可見，甲基營養型芽孢桿菌ZY3A可以開發為微生物肥料，在促進油麥菜生長的以及抗病蟲害中具有廣泛的應用。CCTCC NO:M201554720150916
【專利說明】
一株甲基營養型芽孢桿菌ZY3A及其在促進油麥菜生長上的應用
技術領域
[0001]本發明屬于微生物肥料技術領域，具體涉及一株甲基營養型芽孢桿菌ZY3A及其在促進油麥菜生長上的應用。【背景技術】
[0002]芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性，產芽孢的細菌。芽孢桿菌屬于細菌界(fecteria)、厚壁菌門、芽抱桿菌和乳桿菌組(a/3c/ Zacto/?aci_/_/i)、芽抱桿菌綱、芽抱桿菌目、芽抱桿菌科(ifeci_/_/aceae)、芽抱桿菌屬以及其他21個近似屬，其中僅芽孢桿菌屬就包含200多種菌。而目前廣泛研究的芽孢桿菌指的即是芽孢桿菌屬的各種菌種。芽孢桿菌產生的芽孢抗逆性極強，芽孢桿菌本身營養需求簡單，對植物發育安全，更可以產生多種活性代謝物質，對土壤中多種病原細菌，病原真菌等具有拮抗作用，所以芽孢桿菌是開發微生物肥料和微生物農藥的重要菌種來源。[〇〇〇3]甲基營養型芽孢桿菌(ifeciDus ffietAj^/otrOjoAicus)是一類廣泛存在于土壤當中的好氧性細菌。它最先發現于水稻根系的土壤中。近期的研究表明，甲基營養型芽孢桿菌是解淀粉芽抱桿菌植物亞種a?7_/o_/i<7t/e/acie/3s st/fej0.j〇_/a/3tar腫)的同義詞。 根據目前的研究，許多甲基營養性細菌不僅可以促進土壤礦物及有機物的分解，為植物提供營養；同時還可以分泌IAA，Butanid1l等植物激素以及小分子氣調物質;此外，甲基營養性細菌還可以誘導植物提高自身抗病害能力(ISR)，并可以通過合成脂肽類，細菌素，抗菌蛋白等抑菌物質，以及形成生物菌膜(B1film)等物理屏障，而直接幫助植物抵御病原微生物。總的來講，甲基營養型芽孢桿菌(解淀粉芽孢桿菌植物亞種)是目前國內外公認的無毒安全的植物促生土壤細菌，也是目前我國使用量最為廣泛的微生物肥料菌種來源之一。甲基營養型芽孢桿菌不僅能夠促進植物生長，還可以幫助植物抵御病害，因此，分離篩選具有高效植物促生抗病活性的甲基營養型芽孢桿菌菌株，進而開發為微生物肥料，對于減少我國化學肥料，化學農藥的使用量，提升我國土壤質量，促進我國農林業的可持續發展來講， 具有十分重要的意義。[〇〇〇4] 油麥菜(Lactuca sativa var longifoliaf.Lam)也稱莜麥菜、生菜或者苦菜，是一年生或二年草本植物，屬于菊科萵苣屬的植物。油麥菜嫩芽和嫩梢均可食用而且味道鮮美，是常見的食葉蔬菜。油麥菜植株高25-100厘米。油麥菜的莖是單生直立，在莖的上部是圓錐狀花序的分枝，莖枝為白色。油麥菜的基生葉片和下部莖葉片比較大，葉片不分裂呈倒披針形、橢圓形或橢圓狀倒披針形;油麥菜葉片長6-15厘米，寬1.5-6.5厘米，葉片頂端為急尖、短漸尖或圓形，沒有葉柄；油麥菜葉片的邊緣呈波狀或者有細鋸齒并且向上的漸漸變小，油麥菜的圓錐花序分枝下部的葉片和圓錐花序分枝上的葉片非常小，葉片呈卵狀心形并且沒有葉柄，葉片的基部為心形或箭頭狀抱莖，邊緣全緣，葉片的上下兩面沒有毛。油麥菜的頭狀花序為多數或者極多數，在莖枝頂端排成圓錐花序。
[0005]油麥菜的種植歷史悠久。在公元50年就有了關于油麥菜的描述，中世紀時期一些作品中有許多關于油麥菜的描寫，其中包括草藥方面的應用。油麥菜最早可能來源于古埃及人從一些雜草中篩選出來優良的種植品種，由于油麥菜有肥大的肉質葉片，所以古埃及人將油麥菜用作食用蔬菜，并用其種子榨油。后來油麥菜被引種到了希臘和古羅馬地區，當地人將它命名為“萵苣”。從16-18世紀，油麥菜在歐洲發展出許多品種，通過18世紀中期的作品描述可以知道在當時油麥菜在花園中也有種植。后來油麥菜成為了歐洲和北美洲地區的蔬菜市場的主導者。到了 20世紀末，油麥菜成為在全世界都大規模種植和消費的蔬菜品種。
【發明內容】
[0006]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一株甲基營養型芽孢桿菌ZY3A，具有促進油麥菜生長中的應用能力。本發明的另一目的是提供上述甲基營養型芽孢桿菌ZY3A在促進油麥菜生長中的應用。
[0007]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為:一株甲基營養型芽孢桿菌ZY3A，其分類命名為甲基營養型芽孢桿菌 tAWotro/7Aicus)ZY3A，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO: M2015547;保藏時間2015.09.16，保藏地址為中國典型培養物保藏中心(中國.武漢.武漢大學)。
[0008]所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A在促進油麥菜生長中的應用。
[0009]所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A在抗油麥菜病害中的應用。
[0010]所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的培養物在促進油麥菜生長中的應用。
[0011]所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的培養物在抗油麥菜病害中的應用。
[0012]該甲基營養型芽孢桿菌ZY3A，于2011年9月中旬從南京菜園土壤中篩選分離所得， 其主要生物學特征:淺白色，不透明，菌落平坦而不隆起，略顯干燥，菌落邊緣不整齊;細菌呈桿狀，革蘭氏染色結果陽性。主要生理生化特性:在牛肉膏蛋白胨培養基上生長良好;接觸酶實驗呈陽性;過氧化氫酶活性測試呈陽性。[〇〇13] 甲基營養型芽孢桿菌ZY3A菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID N0.1所示，采用 BLAST(http:/www.ncb1.nlm.nih.gov)將菌株 16S rRNA 基因序列與GenBank 中序列進行比對，并選擇代表性的模式種構建系統發育樹。結果表明，ZY3A與Bacillus sp.Pc3和 Bacillus methylotrophicus strain YJ11-1-4相近度最高，確定該菌株為甲基營養型芽抱桿菌Bacillus methylotrophicus ZY3A〇[〇〇14]有益效果:與現有技術相比，本發明的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A可以在LB培養基上良好的生長。經過測量油麥菜株高可知甲基營養型芽孢桿菌ZY3A稀釋溶液能促進油麥菜生長。實驗室拮抗實驗表明，ZY3A具有明顯的拮抗效果，可見，甲基營養型芽孢桿菌ZY3A可以開發為微生物肥料，在促進油麥菜生長的以及抗病蟲害中具有廣泛的應用。【附圖說明】
[0015]圖1是甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的菌落形態圖；圖2是甲基營養型芽孢桿菌ZY3A革蘭氏染色結果圖；圖3是甲基營養型芽孢桿菌ZY3A促進油麥菜生長結果圖；圖4是甲基營養型芽孢桿菌ZY3A拮抗病原真菌實驗結果圖；上左:甲基營養芽孢桿菌 ZY3A對峙鐮刀菌;上右:解淀粉芽孢桿菌AK03對峙鐮刀菌；下左:甲基營養芽孢桿菌ZY3A 對峙擬絲核菌;下右:解淀粉芽孢桿菌AK03對峙擬絲核菌；圖5是甲基營養型芽孢桿菌ZY3A拮抗細菌實驗結果圖。【具體實施方式】
[0016]下面的具體實施例，可以使本領域技術人員更好地理解本發明。實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0017]實施例1:甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的活化培養用接種環取少量甲基營養型芽孢桿菌ZY3A菌種劃線于LB平板(胰蛋白胨10g，酵母粉 5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，去離子水1000mL)上，待表面菌液干后，倒置于37°C溫箱培養過夜，平板上長出菌落，菌落形態圖如圖1所示，淺白色，不透明，菌落平坦而不隆起，略顯干燥，菌落邊緣不整齊;細菌呈桿狀。檢測其重要理化性質，具體為:革蘭氏染色，陽性;接觸酶，陽性;過氧化氫酶，陽性;VP實驗，陽性;磷酸酶，陽性;淀粉水解，陽性;甘油，陽性;纖維素，陰性；明膠，陰性;吐溫20,陰性;吐溫60,陰性;果膠，陰性;葡萄糖，陽性;果糖，陽性;甘露糖，陽性;麥芽糖，陽性;乳糖，陽性；山梨糖醇，陽性;纖維二糖，陽性;鹿糖，陽性;梓檬酸酸鹽，陽性。
[0018]實施例2:甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的革蘭氏染色實驗試劑:結晶紫染色液，復紅染色液，碘液。
[0019]方法:1)涂片，取一塊干凈的載玻片，平放，在載玻片中央滴一小滴生理鹽水;用接種環無菌操作從瓊脂斜面上挑取適量菌苔;將挑取的菌苔沾入載玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。2)干燥，將涂好菌膜的載玻片平放在室溫下自然干燥。3)固定，將已干燥的涂有菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過2?3次。4)染色，將熱固定的細菌涂片平放于在載玻片架上，滴加草酸銨結晶紫，染色1分鐘后用清水洗去染色液。5)加碘液覆蓋涂面染約1分鐘，用清水沖洗。6)加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。 7)復紅染色液復染1分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。
[0020]革蘭氏染色結果如圖2所示，結果呈陽性。[0021 ]實施例3:甲基營養型芽孢桿菌ZY3A促進油麥菜生長以油麥菜為對象進行田間試驗。試驗地為上一年度發生過嚴重白菜根腐病的土壤。試驗共設6個處理，每個處理進行5次重復，每個重復包含20棵從盆缽中移植的油麥菜幼苗。 [〇〇22]方法:用接種環取少量甲基營養型芽孢桿菌ZY3A菌種劃線于LB平板(配方同上)， 過夜培養；待長出菌落之后，接種于培養基中(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水 1 OOOmL，pH7.0-7.5)，培養8h后獲得種子液;按2%體積接種種子液到發酵培養基(配方同種子培養基)中；在發酵罐中30 °C培養12h后，取培養液中備用。將甲基營養型芽孢桿菌ZY3A培養液，分別稀釋50倍、稀釋100倍、200倍、500倍、1000倍之后，和無菌培養基(CK)分別各取 100mL，灌根于油麥菜幼苗根部。除每天澆水之外不做其他田間管理，不噴施其他藥物。四周之后，收獲植株地上部分，烘干后稱重。[〇〇23] 結果如圖3所示，可以看出，當甲基營養型芽孢桿菌ZY3A稀釋50-1000倍時，對油麥菜的生長均有明顯促進作用。且在50-500倍區間，不同稀釋度沒有明顯差別，考慮到生產成本，菌液稀釋500倍是一個合適的施用濃度。
[0024]實施例4:甲基營養型芽孢桿菌ZY3A拮抗病原真菌試驗將冰箱保存的病原真菌(鐮刀菌和擬絲核菌)分別活化于TOA平板，然后用接種針挑取一小塊含有菌絲的瓊脂塊，置于新的PDA平板中央，培養三天。同上述方法，培養甲基營養芽孢桿菌ZY3A至OD600值約為1.0，吸取5uL培養液，點在前述TOA培養培養基的邊緣，每個平板點四處。將不具有病原真菌拮抗活性的解淀粉芽孢桿菌AK03,用同樣的方法點板，作為對照。
[0025]結果如圖4所示，與對照菌株AK3相比，甲基營養芽孢桿菌ZY3A對兩種病原真菌的生長均有明顯的抑制作用。
[0026]實施例5甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的拮抗細菌試驗，方法:1)獲得巨大芽孢桿菌(CJCL2 )的單菌落，液體培養約5h至其OD600值為1.0時停止培養， 將LB固體培養基121°C20min滅菌后置于65°C水浴鍋保存，在干凈平板中先加入lmL菌液，再加入20mL溫熱的LB固體培養基，趁熱輕輕搖晃使菌液均勻分布于平板中。冷卻后置于4°C 冰箱保存待用。[〇〇27] 2)同上述方法，獲得甲基營養細菌ZY3A的液體培養液，按1%的接種量再接種于 10mL LB液體培養基中，37°C搖床培養。在培養20 h和40 h之后分別吸取2 mL培養液置于離心管中，12000 rpm離心lOmin，然后取出上清液，用0.45um濾膜過濾除菌。將無菌濾液置于 4度冰箱保存待用。
[0028] 3)取制備好的巨大芽孢桿菌平板，用平板邊緣用打孔器打一系列小孔(直徑約 0.5mm)，取40uL待測菌株上清液于小孔中，待液體全部滲透至周圍瓊脂平板中，再重復添加一次，待濾液在此風干之后，37 °C溫箱培養過夜，觀察抑菌圈大小。
[0029]結果如圖5所示，對巨大芽孢桿菌的抑菌圈表明，甲基營養芽孢桿菌ZY3A具有潛在的抑制土壤病原細菌的功能。
【主權項】
1.一株甲基營養型芽孢桿菌ZY3A，其分類命名為甲基營養型芽孢桿菌tAWotro/7Aicus)ZY3A，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號:CCTCC NO: M2015547;保藏時間2015.09.16，保藏地址為中國典型培養物保藏中心(中國.武漢.武漢大學)。2.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A在促進油麥菜生長中的應用。3.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A在抗油麥菜病害中的應用。4.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的培養物在促進油麥菜生長中的應用。5.權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的培養物在抗油麥菜病害中的應用。6.—種制備權利要求1所述的甲基營養型芽孢桿菌ZY3A的培養物的方法，其特征在于: 配制培養基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH7.0-7.5;按2%體積接入ZY3A 的預培養物，在發酵罐中30°C培養12h后，獲得的培養液即為培養物;預培養物為用接種環 取少量甲基營養型芽孢桿菌ZY3A菌種劃線于LB平板，過夜培養所得到的菌落。
【文檔編號】A01N63/00GK105925504SQ201610338092
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】樊奔, 李昱龍, 陳晟, 陸鳴, 陸一鳴
【申請人】南京林業大學