一種假單胞菌及其應用
【專利摘要】本發明涉及假單胞菌技術領域，特別涉及一種摩氏假單胞菌(Pseudomonas mosselii)。其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12222。其對水稻稻瘟病、水稻惡苗病、水稻紋枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病的病原菌具有抑菌效果。CGMCC No. 1222220160317
【專利說明】
-種假單胞菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及假單胞菌（Pseudomonas)技術領域，特別設及一種摩氏假單胞菌 (Pseudomonas mosselii)。
【背景技術】
[0002] 真菌病害嚴重危及全球糧食安全，植物病害中有70%-80%是病原真菌的侵染所 導致。水稻稻攝病(Magnaporthe cxryzae)在全球85個國家中的爆發，造成了10%-35%的糧 食損失，甚至一些真菌類病害還導致了嚴重的動植物死亡和滅絕。化學防治是目前防治真 菌病害最有效的措施，我國每年化學農藥的使用量為50-60萬噸，對環境和生態帶來了嚴重 的污染和危害，在一些國家和地區化學殺菌劑已經被限制使用。而生物防治因其見效快、殺 菌譜廣、環境友好和不易產生抗性等特點，具有廣闊的應用前景。
[0003] 用于生物防治的微生物種類主要有細菌、真菌、放線菌和病毒。然而，近年來，隨著 生防細菌的發掘和研究，尋找新的具有病原真菌括抗作用的細菌難度越來越大，但是篩選 新的具有病原真菌括抗作用的細菌仍然具有重要的科學價值的實用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有技術的不足之處，結合我國的種植資源，從云南麗江中分離得到 了眾多細菌菌株，并對運些細菌的16S rDNA進行測序分析，W確定運些細菌種屬分類關系。 并利用其對病原真菌括抗能力等進行檢測分析，旨在獲得高效廣譜的生防菌，W期為植物 真菌病害的防治提供材料。
[0005] 因此，本發明提供了 一種假單胞菌(Pseudomonas )，其保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC No. 1 2222。具體地該假單胞菌 (Pseudomonas)為摩氏假單胞菌（Pseudomonas mosselii)。
[0006] 一種如本發明的假單胞菌CGMCC No. 12222的應用。
[0007] 在一個【具體實施方式】中，所述假單胞菌用于防治水稻稻攝病、水稻惡苗病、水稻紋 枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一種。
[000引在一個【具體實施方式】中，所述假單胞菌用于保護植物;所述植物主要指的是農作 物;所述農作物可W為水稻。
[0009] 一種對本發明的假單胞菌CGMCC No. 12222進行遺傳改良后得到的工程菌。其中， 由于該工程菌是W本發明的假單胞菌CGMCC No. 12222為祀標，而且采取的手段一般是向其 中轉入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，該工程菌仍然為假單胞菌，特別是應為摩 氏假單胞菌。另外，該工程菌可W為提高了對上述病害活性的工程菌。還可W為兼具其他病 蟲害活性W及獲得了其他特性的工程菌株。
[0010] 一種如本發明的工程菌的應用。
[0011] 在一個【具體實施方式】中，所述工程菌用于防治水稻稻攝病、水稻惡苗病、水稻紋枯 病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一種。
[0012] 在一個【具體實施方式】中，所述工程菌用于保護植物;所述植物主要指的是農作物； 所述農作物可W為水稻。
[0013] -種包含如本發明的假單胞菌的組合物。其中的假單胞菌可W包括本發明的野生 菌株CGMCC No. 12222,也可W包括對本發明的野生菌株CGMCC No. 12222進行遺傳改良后得 到的工程菌。所述組合物可W為固態形式，也可W為液態形式。所述組合物還可W包含與本 發明的假單胞菌具有增效作用的其他物質，所述其他物質可W是微生物來源抑菌活性物 質，也可W是抑菌化合物。所述組合物進一步可W包括與本發明的假單胞菌相配合的輔劑、 增稠劑和/或分散劑，例如所述輔劑可W選自棉子油、藍麻油、桐油、液體石蠟、豆油、A1、A2、 鄰苯二甲酸二甲醋、鄰苯二甲酸二下醋等;增稠劑有膨潤上、硬脂酸侶、QH凝膠、龍膠粉、F1、 黃原膠等:分散劑有拉開粉、NNO、LFS、Bl、碳黑等。
[0014] -種如本發明的組合物的應用。
[0015] -種如本發明所述的組合物在防治水稻稻攝病、水稻惡苗病、水稻紋枯病、水稻立 枯病和水稻稻曲病中的至少一種中的應用。
[0016] -種如本發明所述的組合物在保護植物中的應用;所述植物主要指的是農作物； 所述農作物可W為水稻。
[0017] -種包含如本發明的假單胞菌的農藥制劑。其中的假單胞菌可W包括本發明的野 生菌株CGMCC No. 12222,也可W包括對本發明的野生菌株CGMCC No. 12222進行遺傳改良后 得到的工程菌。所述農藥制劑可W為固態形式，也可W為液態形式。所述農藥制劑還可W包 含與本發明的假單胞菌具有增效作用的其他物質，該物質可W是微生物來源抑菌活性物 質，也可W是抑菌化合物。所述農藥制劑進一步可W包括與本發明的假單胞菌相配合的輔 劑、增稠劑和/或分散劑，例如所述輔劑可W選自棉子油、藍麻油、桐油、液體石蠟、豆油、AU A2、鄰苯二甲酸二甲醋、鄰苯二甲酸二下醋等;增稠劑有膨潤±、硬脂酸侶、QH凝膠、龍膠粉、 Fl、黃原膠等:分散劑有拉開粉、NNO、LFS、Bl、碳黑等。
[0018] -種如本發明的農藥制劑的應用。
[0019] -種如本發明所述的農藥制劑在防治水稻稻攝病、水稻惡苗病、水稻紋枯病、水稻 立枯病和水稻稻曲病中的至少一種中的應用。
[0020] -種如本發明所述的農藥制劑在保護植物中的應用；所述植物主要指的是農作 物;所述農作物可W為水稻。
[0021] 在本發明中，術語"保護"的意思是通過預防和/或治療祀標生物產生的病蟲害等， 從而使祀標生物免于或減輕遭受所述病蟲害的為害。例如通過使用所述假單胞菌預防和/ 或治療水稻的稻攝病。
【附圖說明】
[0022] 圖1為假單胞菌BSOll對時培養法抑制水稻稻攝病的效果圖。其中，A為空白對照，B 為BSOll的抑菌實驗。
[0023] 圖2為假單胞菌BSOll對時培養法抑制水稻惡苗病的效果圖。其中，A為空白對照，B 為BSOll的抑菌實驗。
[0024] 圖3為假單胞菌BSOll的16S rDNA構建的系統發育樹。
【具體實施方式】
[0025] W下通過優選的實施例的形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不 構成對本發明的限制。
[0026] 本發明篩選的一株假單胞菌被定名為BSOll，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC No. 12222，保藏日期為2016年3月17日，保 藏地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。其系統分類為摩氏 假單胞菌（Pseudomonas mosselii)。
[0027] 病原菌：5種供試病原真菌水稻稻攝病（Magnapo;rthe oryzae)、水稻惡苗病 (Fusarium moniliforme)、水稻紋枯病（Rhizoctonia solani Kiihn)、水稻立枯病 (F'usarium graminearum Schw.)和水稻稻曲病（Ustilaginoidea Oiyzae)由本實驗室保 藏。
[002引邸固體培養基配方:蛋白腺20g，K2HP04 15g，甘油10g，MgS04 15g，瓊脂15g，蒸饋水 1000ml，抑7.2。常規滅菌后使用。
[0029] PDA固體培養基配方:馬鈴馨200克，葡萄糖20克，瓊脂15克，蒸饋水1000毫升，自然 pH。常規滅菌后使用。
[0030] 相對抑菌率（％ )=(對照菌落半徑一處理菌落半徑)/對照菌落半
[0031] 實施例1
[0032] 1、±壤樣品的采集
[0033] 從云南麗江濤源山區隨機采取±樣。去除表面±壤，采集5-20cm深處的±樣約 SOOg，分裝標記后帶回實驗室。
[0034] 2、菌株的分離
[0035] 采用±壤稀釋法分離，稱取IOgi壤倒入裝有玻璃珠的90ml無菌水=角瓶中，此為 1〇-1的稀釋液，振蕩IOmin后，吸取Iml至新的裝有90ml無菌水的=角瓶中，振蕩混勻，此為 1〇-2的稀釋液，按此方法繼續稀釋成1〇-4，1〇-5，1〇- 6的稀釋液。吸取1〇-4、1〇-哺1〇-6稀釋液100 加入到KB固體培養基平板上，每個梯度3次重復，涂布均勻，倒置于28°C培養箱中培養 2地，然后將典型菌落在KB培養基平板上劃線純化2-3次后得到單菌落。將純化后的單一菌 株接種KB培養基斜面上，4 °C保存，供生測試驗使用。最后獲得的其中一株菌定名為BSO11。
[0036] 3、菌株BSOll的抑菌譜
[0037] 1)采用平板對時法，將水稻稻攝病菌在PDA固體培養基上活化后，用6mm打孔器沿 著菌絲邊緣打菌餅備用。取其中一個菌餅，菌絲面朝下，接種到新的PDA培養基中央，在離指 示菌等距離(2.5cm)處劃線接入純化后的假單胞菌菌株(劃線長度3cm)，接S個平板作為重 復，同時W不接假單胞菌而只接稻攝病菌的平板為對照。28°C進行對時培養，分別在第5天 和第7天后觀察并記錄，抑菌情況見圖1。
[003引第五天測量受BSOll括抗生長的稻攝病菌的生長半徑分別為0.72cm，0.65cm和 0.7畑1，對照稻攝病菌的生長半徑為2.7畑1，2.7cm和2.75cm，S次重復取平均值后根據上述 相對抑菌率（％ )公式計算得到BSOll對稻攝病菌的相對抑菌率為74.8%。
[0039] 2)采用平板對時法，將水稻惡苗病菌在固體PDA培養基上活化后，同樣用6mm打孔 器沿著菌絲邊緣打菌餅備用。取其中一個菌餅，菌絲面朝下，接種到新的PDA培養基中央，在 離指示菌等距離(2.5cm)處劃線接入純化后的菌株BSOll(劃線長度3cm)，接S個平板作為 重復，同時W不接假單胞菌而只接指示菌的平板為對照。28°C進行對時培養，5天后觀察并 記錄，抑菌情況見圖2。
[0040] 測量受BSOll括抗生長的稻攝病菌的生長半徑分別為1.65cm，1.64cm和1.65畑1，對 照稻攝病菌的生長半徑為3. Ocm，2.95cm和3. Ocm，S次重復取平均值后根據上述相對抑菌 率（％ )公式計算得到BS014對稻攝病菌的相對抑菌率為45.2%。
[0041] 3)采用平板對時法，將水稻紋枯病菌在固體PDA培養基上活化后，同樣用6mm打孔 器沿著菌絲邊緣打菌餅備用。取其中一個菌餅，菌絲面朝下，接種到新的PDA培養基中央，在 離指示菌等距離(2.5cm)處劃線接入純化后的菌株BSOll(劃線長度3cm)，接S個平板作為 重復，同時W不接假單胞菌而只接指示菌的平板為對照。28°C進行對時培養，5天后觀察并 記錄。結果表明本發明細菌菌株BSOll對水稻紋枯病菌具有一定抑菌效果。
[0042] 4)采用平板對時法，將水稻立枯病菌在固體PDA培養基上活化后，同樣用6mm打孔 器沿著菌絲邊緣打菌餅備用。取其中一個菌餅，菌絲面朝下，接種到新的PDA培養基中央，在 離指示菌等距離(2.5cm)處劃線接入純化后的菌株BSOll(劃線長度3cm)，接S個平板作為 重復，同時W不接假單胞菌而只接指示菌的平板為對照。28°C進行對時培養，5天后觀察并 記錄。結果表明本發明細菌菌株BSOll對水稻立枯病菌具有一定抑菌效果。
[0043] 5)采用平板對時法，將水稻稻曲病菌在固體PDA培養基上活化后，同樣用6mm打孔 器沿著菌絲邊緣打菌餅備用。取其中一個菌餅，菌絲面朝下，接種到新的PDA培養基中央，在 離指示菌等距離(2.5cm)處劃線接入純化后的菌株BSOll(劃線長度3cm)，接S個平板作為 重復，同時W不接假單胞菌而只接指示菌的平板為對照。28°C進行對時培養，5天后觀察并 記錄。結果表明本發明細菌菌株BSOll對水稻稻曲病菌具有一定抑菌效果。
[0044] 4.菌株BSOll的16S rDNA測序及序列分析
[0045] 參照分子克隆中提取革蘭氏陰性細菌的所述方法提取BSOll基因組DNA。用細菌 16S rDNA通用引物：27F:5'_agagtttgatcctggctcag-3'（如SEQ ID No.l所示）和 1492R: 5'-。旨旨1:1曰。。1:1旨1:1:曰。旨曰。1:1：-3'（如沈〇10齡.2所示）擴增85011的168扣臟序列。50山的反 應體系包括：10 X PCR緩沖液扣1，dNTP(2.5mM)4 山，27F(20皿）化1，1492R(20皿）1山，TaqDNA 聚合酶（5IU)0.2扣1，DNA模板(50ng/iil)化1，d地2〇補充至SOiil ePCR擴增條件：94度3min預 變性，94度45sec，58度45sec，72度90sec，共30個循環，72度IOmin終延伸。得到的1.4kb左右 多片段，經試劑盒純化進行TA克隆，轉化大腸桿菌得到的克隆子，經過菌液PC閲金證正確后 送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得序列為1408bp(如SEQ ID No.3所示）。所測 序列提交EzBioCloud網站進行同源性比較，采用MEGA6.0構建系統發育樹（圖3)。根據圖3的 系統發育樹可知，本發明的BSOll的系統分類為摩氏假單胞菌(Pseudomonas mosselii)。
【主權項】
1. 一種假單胞菌(Pseudomonas)，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏編號為CGMCC No. 12222。2. -種對權利要求1所述的假單胞菌進行遺傳改良后得到的工程菌。3. -種組合物，所述組合物包含如權利要求1所述的假單胞菌和/或如權利要求2所述 的工程菌。4. 一種農藥制劑，所述農藥制劑包含如權利要求1所述的假單胞菌和/或如權利要求2 所述的工程菌。5. 如權利要求1所述的假單胞菌、如權利要求2所述的工程菌、如權利要求3所述的組合 物以及如權利要求4所述的農藥制劑中的至少一種的應用。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述假單胞菌用于防治水稻稻瘟病、水稻 惡苗病、水稻紋枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一種。7. 根據權利要求5或6的應用，其特征在于，所述假單胞菌用于保護植物。8. 根據權利要求7的應用，其特征在于，所述植物為農作物。9. 根據權利要求8的應用，其特征在于，所述農作物為水稻。
【文檔編號】C12N1/20GK105925501SQ201610302453
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月9日
【發明人】馮國忠, 吳麗娟, 陳國慶, 嚴清
【申請人】中國水稻研究所