一種高硫酸化硫酸軟骨素及其制備方法與應用

一種高硫酸化硫酸軟骨素及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明涉及一種高硫酸化硫酸軟骨素及其制備方法與應用。所述高硫酸化硫酸軟骨素，分子量為100～800KDa，硫酸化度在0.7～1.43，二糖組成為：O?unit，C?unit，A?unit，E?unit。該高硫酸化硫酸軟骨素是由美洲大赤魷的軟骨中提取出的富含E?unit的硫酸軟骨素，其具有特異二糖組成、糖鏈排列、分子量的DG?CS。通過實驗證明該高硫酸化硫酸軟骨素具有很好的抗腫瘤轉移活性。
【專利說明】
-種高硫酸化硫酸軟骨素及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種高硫酸化硫酸軟骨素及其制備方法與應用，特別設及一種巨型銳 魚軟骨來源天然新型高硫酸化硫酸軟骨素的制備及其在抗腫瘤方面的應用，屬于生物技術
技術領域。
【背景技術】
[0002] 硫酸軟骨素(簡稱CS)是一種酸性黏多糖，廣泛存在于牛骨、豬骨、雞骨、整魚骨、銳 魚骨中，屬于糖胺聚糖的一種，是一種天然來源的生物大分子。其基本組成單位是D-葡萄糖 醒酸和N-乙酷-D-氨基半乳糖通過0-1，3糖巧鍵連結而成的二糖（一461加曰01一36曰1魁姐1 自然界中大多數的CS是WN-乙酷-D-氨基半乳糖的4位或6位發生硫酸化的形式存在 的，我們分別稱之為CS-A、CS-C。除了CS-A、CS-C外，根據D-葡萄糖醒酸和N-乙酷-D-氨基半 乳糖硫酸化模式不同還存在包括〔5-0^5-6、〔5-0、〔5-1(等在內的多種異構體[2]^5-4^5- C、CS-O、CS-E的結構式化下所示：
[0003]
[0004] 值得一提的是CS-E是硫酸軟骨素中的重要一員，其富含N-乙酷-D-氨基半乳糖C-4 位和C-6位發生硫酸化的高硫酸化二糖單位巧-unit)，使其帶有大量負電荷，形成特定的分 子結構。運種特性更利于其與細胞因子、生長因子、趨化因子、細胞粘附分子、脂蛋白特異性 結合，進而調節神經生長、生長因子信號轉導、創傷愈合、感染、腫瘤細胞遷移W及腫瘤細胞 增值等生理或病理過程W。從而在抗腫瘤細胞轉移、促進神經突觸生長、刺激軟骨細胞合成 II型膠原中發揮關鍵作用，對癌癥、關節炎、神經痛等疾病有很好的預防、輔助治療作用W。
[0005] 癌癥是導致全球死亡率的一個重要原因。癌癥之所W是人類久攻不下的難題，與 其自身的病癥特性有很大的關系，其中最為棘手的是癌細胞可不斷遷移并侵入正常組織形 成新的轉移灶。研究發現在運一過程中腫瘤細胞硫酸軟骨素的含量、組成、分子大小及分子 結構與相應的正常組織有明顯差異。而運種差異是腫瘤細胞遷移、侵入正常組織的先決條 件。所W根據腫瘤細胞的運一特性，硫酸軟骨素的抗腫瘤研究已經成為國內外研究的熱點。 深入研究發現硫酸軟骨素抗腫瘤活性對硫酸軟骨素硫酸化模式、分子量等都有嚴格要求， 其中E-un i t的含量最為關鍵。商品化的CS-E的E-un i t含量在60 %左右，硫酸化度約1.5，分 子量范圍為50~140kDa，但是其價格昂貴，且生產工藝主要集中于日本。國內關于提取富含 E-unit的硫酸軟骨素的研究文獻寥寥無幾，僅有的報道中制備出的CS硫酸化度僅有0.5左 右最重要的是制備運種CS-E的原料來自一種名為太平洋權皺魚（Todarodes F*acificus)的小型銳魚，但是Todarodes Pacificus軟骨含量很少無法形成大量生產，并且 近年來隨著海洋污染加劇Todarodes Pacifi州S漁獲量逐年遞減，價格上升。
[0006] 中國專利文獻CN1563098A(申請號200410006223.5)公開了一種制備硫酸軟骨素 的方法，該方法包括W下步驟:A.將卡拉膠分解為分子量為1-4萬，優選2-3萬的卡拉膠寡 糖;B.將銳魚骨用15%到飽和的強堿液處理，然后用酸中和，收集膠體;C.將步驟A制得的卡 拉膠寡糖、步驟B制得的膠體和氨基葡萄糖在酸性條件下反應，再純化，獲得硫酸軟骨素。該 方法采用強堿處理，從而導致獲得的硫酸軟骨素的硫酸化程度較低，而且引入的卡拉膠，不 利于硫酸軟骨素的純化，導致硫酸軟骨素純度低，相關應用價值大幅下降。
[0007] 因此尋找富含E-unit硫酸軟骨素的新原料，不僅可W緩解太平洋權皺魚的生存壓 力更能拓寬富含E-unit硫酸軟骨素原料來源。研究發現不同種屬動物體內所存在的硫酸軟 骨素亞型的含量、種類各不相同，同一動物因年齡、組織部位的不同硫酸軟骨素的種類、含 量也在不斷變化。運一發現為制備不同種類的硫酸軟骨素提供了很好的理論基礎。一般來 說，在牛的喉骨、雞軟骨、嫁魚軟骨中CS-A含量最高，可達76.2-90%;整魚翅軟骨中CS-D的 含量最為豐富，而在其它整魚軟骨中CS-C含量最高，可達72.9%;銳魚軟骨來源CS中E-unit 含量最高，可達60 %。
[000引美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)生長周期短、產量大、價格便宜，而軟骨骨質硬無 法食用，一般作為廢料丟棄。對美洲大赤銳的軟骨進行研究利用，目前還未有相關報道。

【發明內容】

[0009]本發明針對現有技術的不足，提供一種高硫酸化硫酸軟骨素及其制備方法與應 用。該高硫酸化硫酸軟骨素是由美洲大赤銳的軟骨中提取出的富含E-unit的硫酸軟骨素， 其具有特異二糖組成、糖鏈排列、分子量的DG-CS。通過實驗證明該高硫酸化硫酸軟骨素具 有很好的抗腫瘤轉移活性。
[0010] 術語說明
[0011] 0-unit是指:不發生硫酸化的硫酸軟骨素(CS)二糖單位。
[0012] c-unit是指:N-乙酷-D-氨基半乳糖C-6位發生硫酸化的硫酸軟骨素（CS)二糖單 位。
[0013] A-unit是指:N-乙酷-D-氨基半乳糖C-4位發生硫酸化的硫酸軟骨素（CS)二糖單 位。
[0014] E-unit是指:N-乙酷-D-氨基半乳糖C-4位和C-6位發生硫酸化的硫酸軟骨素（CS) 二糖單位。
[0015] 本發明的技術方案如下：
[0016] 一種高硫酸化硫酸軟骨素，分子量為100~800邸a，硫酸化度在0.7~1.43，二糖組 成如下，均為質量百分比： 0-unit 3.9'、-10%; C-unit 11.8--35%;
[0017] A-unil 30 -37.7%; E-unil i9--46.6%。
[0018] 根據本發明優選的，所述高硫酸化硫酸軟骨素分子量為623.2KDa，硫酸化度在 1.43，二糖組成如下，均為質量百分比： 0-unit 3.9%; C-Linit 11.8%；
[0019] A-unh 37.7%； E-unit 46.()%。
[0020] 上述高硫酸化硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：
[0021] (1)將美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)軟骨粉碎后加入有機溶劑進行脫水脫脂，干 燥，制得脫脂軟骨；
[0022] (2)向步驟（1)制得的脫脂軟骨中加水浸沒處理，固液分離，向沉淀中加入酶反應 緩沖液，混合均勻，調pH 5.0~9.0，加入蛋白酶在40~70°C酶解反應24~96h，滅活酶，固液 分離，取液體，制得酶解粗液；
[0023] 所述蛋白酶黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶與其他蛋白酶的混合;蛋白酶的加入 量為脫脂軟骨干重的1%〇~5%〇,黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的質量百分含量為20~100%;
[0024] (3)將步驟(2)制得的酶解粗液經除蛋白后，調抑至7.0~10.0,然后加入酶解粗液 質量百分比1~10%的化AC固體，溶解，加入乙醇使體系中乙醇的體積終濃度達到50 %~ 85%，固液分離，取沉淀，制得初級多糖；
[0025] (4)將步驟(3)制得的初級多糖溶解于水中，經陰離子交換樹脂純化，WO~2.5M氯 化鋼溶液濃度梯度洗脫，收集洗脫峰，醇沉，固液分離，超濾，干燥，制得高硫酸化硫酸軟骨 素。
[0026] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，有機溶劑為丙酬或無水乙醇，有機溶劑的加 入量為沉淀體積的2~4倍;脫水脫脂的時間為4~24h，次數為2~4次。
[0027] 根據本發明優選的，所述步驟(2)中，處理條件為:在60~100°C處理10~30min。
[0028] 根據本發明優選的，所述步驟(2)中，酶反應緩沖液為氯化巧棚酸緩沖液，氯化巧 濃度為5~IOmM,棚酸濃度為50~IOOmM, pH7.0~9.0。
[0029] 根據本發明優選的，所述步驟(2)中，其他蛋白酶為鏈霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶和/ 或膜蛋白酶混合酶;鏈霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶、膜蛋白酶為普通市售產品，如可購自Sigma 公司。
[0030] 根據本發明優選的，所述步驟(2)中，黑曲霉蛋白酶為普通市售產品，如可購自TCI 公司。
[0031] 根據本發明優選的，所述步驟(2)中，酶解反應過程中，還包括兩次蛋白酶補加步 驟，每次不加量均為上次加酶量的0.4~0.6倍，第一次補加時間為酶解反應6~2地，第二次 補加時間為酶解反應12~48h。
[0032] 根據本發明優選的，所述步驟(2)中，滅活酶條件為沸水浴中靜置5~20min。
[0033] 根據本發明優選的，所述固液分離均為離屯、，條件為5000~lOOOOrpm/min離屯、5~ 20min〇
[0034] 根據本發明優選的，所述步驟(3)中，除蛋白的具體步驟如下：
[0035] 按步驟(2)制得的酶解粗液體積的2~10%加入S氯乙酸(TCA)，離屯、，取上清液， 加入乙酸抽提=氯乙酸，去除乙酸。
[0036] 根據本發明優選的，所述步驟(4)中，陰離子交換樹脂純化的具體條件為初級多糖 溶解于水中，濃度為lOmg/ml，加入硫酸軟骨素重量40~80%的陰離子交換樹脂室溫解育 0.5~化，Wo~2.5M氯化鋼溶液濃度梯度洗脫分別洗脫3倍柱體積，收集洗脫峰。
[0037] 根據本發明優選的，所述步驟(4)中，醇沉的乙醇體積濃度為50%~85%;超濾膜 的截留分子量為IOkDaW上;干燥溫度為不超過80°C。
[0038] 上述高硫酸化硫酸軟骨素在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0039] 有益效果
[0040] 1、本發明首次公開了美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)可W作為富含E-unit硫酸軟 骨素的原料來源制備高硫酸化硫酸軟骨素。由于美洲大赤銳生長周期短、產量大、價格便 宜，而軟骨骨質硬無法食用，一般作為廢料丟棄，因此不僅可W極大的擴大硫酸軟骨素的原 料來源，而且可W變廢為寶，減少環境污染；
[0041] 2、本發明從美洲大赤銳軟骨中提取的高硫酸化硫酸軟骨素，在二糖組成、分子量 等方面與已知的CS-E顯著不同。抗腫瘤實驗表明，本發明所制備獲得的美洲大赤銳硫酸軟 骨素(簡稱DG-CS)，在體內其具有很強的抗腫瘤轉移活性，在體外可W與多種生長因子相互 作用，為研發新型抗腫瘤糖類藥物提供了原料和理論基礎；
[0042] 3、本發明所述的高硫酸化硫酸軟骨素的制備方法較傳統制備方法，不需要堿處理 步驟，反應條件溫和、酶用量少、易形成工業化生產，制得的高硫酸化硫酸軟骨素成本低，市 場價值高，而且抗凝血活性低不會引發體內溶血等副作用，可用于醫藥研發、疾病治療、科 學研究等領域；
[0043] 4、本發明所述制備方法制得的高硫酸化硫酸軟骨素收率可W達18~20%，純度可 W達到95% W上。
【附圖說明】
[0044] 圖1為質量濃度為1%的DG-CS經Nano化OP K5600分析200-800nm全波長掃描圖。
[0045] 圖2為DG-CS經化ondroteinase B(Sigma)Xhondroteinase ABC(Sigma)、 r肥La S e、Hy a 1 ur on i da S e生物酶降解后經HPLC分析圖譜。
[0046] 圖3為本發明制備的DG-CS分子量檢測圖譜。
[0047] 圖4為本發明制備的DG-CS經CSase AB邱華解后二糖組成圖譜。
[004引圖5為本發明制備的DG-CS素抗凝血、抗血栓活性的檢測圖譜。
[0049] 圖中：A為本發明制備的DG-CS與精品肝素化P)的抗FII活性，B為本發明制備的DG- CS與精品肝素化P)的抗FXa活性。
[0050] 圖6為本發明制備的硫酸軟骨素抗腫瘤轉移活性統計分析柱狀圖。
[0051] 圖7為本發明制備的硫酸軟骨素與腫瘤相關生物大分子生長因子相互作用圖譜。
[0052] 圖中：A:堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，B:肝細胞生長因子化GF)，C:選擇素-L (SE化），D:選擇素-E (沈LE)，E:選擇素-P (沈LP)。
【具體實施方式】
[0053]下面結合實施例進一步全面公開本發明如何實施的技術方案，運些實施例不能理 解為是為了限制發明的應用范圍。發明人已盡力保證實驗中各種數據的準確性，但實驗上 的一些偏差在所難免。常規方法不再特殊說明。
[0化4] 生物原料來源
[0055]美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)軟骨購置于山東濟南維爾康水產品批發市場； [0化6] 實施例1
[0057] -種高硫酸化硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟：
[005引（1)將化g美洲大赤銳(Dosidi州S Gigas)軟骨粉碎后加入3倍體積無水乙醇脫水、 脫脂2地，過濾，重復脫水、脫脂步驟3次，然后50°C烘干稱重，制得脫脂軟骨；
[0059] (2)向步驟（1)制得的脫脂軟骨中加水浸沒，100°C水浴處理30min，冷卻到室溫過 濾，向沉淀中加入20倍體積氯化巧棚酸緩沖液(0.1 M棚酸，IOmM氯化巧袖8.0)混勻，加入原 料干重2%〇的黑曲霉蛋白酶(購自TCI公司），于60°C反應72h，每隔24h補加1次酶，加酶量依 次遞減為上次加酶量的0.5倍，共加2次，100 °C滅酶活IOmin，800化pm/min離屯、IOmin，取液 體，制得酶解粗液；
[0060] (3)向步驟(2)制得的酶解粗液中按質量百分比為5%的比例加入TCA(S氯乙酸）， 800化pm/min離屯、IOmin去沉淀得上清，所得到的上清中加入等體積乙酸抽提殘余TCA，攬拌 吹氣除去乙酸，加入化OH調節pH至8.0;然后加入酶解粗液質量5%的化AC固體，混勻，加入 乙醇使體系中乙醇的體積終濃度達到80%，800化pm/min離屯、IOmin取沉淀，制得初級多糖；
[0061] (4)將步驟(3)制得的初級多糖溶解于水中，濃度為lOmg/ml，加入硫酸軟骨素溶液 重量60%的A98陰離子交換樹脂(購自德國朗盛公司）室溫解育O.化，Wo. 5M，IM，2M氯化鋼 溶液分別洗脫3倍柱體積，收集洗脫峰，2M氯化鋼洗脫液合并醇沉，用孔徑為IOkDa超濾膜超 濾脫鹽，35 °C干燥，制得高硫酸化硫酸軟骨素。
[0062] 實施例2、DG-CS的純度分析
[0063] 2.1蛋白和糖胺聚糖含量分析
[0064] 利用巧挫反應、BCA蛋白測定試劑盒、全波長掃描等技術手段檢測制備得到的DG- CS純度，發現樣品中蛋白含量低于2%，在280nm附近蛋白吸收峰極小，如圖1所示；由巧挫反 應測得糖胺聚糖含量在97 % W上，回收率為20 %。
[0065] 2.2其它糖胺聚糖含量分析
[0066] 眾所周知，利用生物酶底物專一性等性質可W確定多糖樣品種類。硫酸軟骨素裂 解酶Oiomlroteinase ABC主要降解硫酸軟骨素，硫酸皮膚素裂解酶Chomlroteinase B可專 一性降解硫酸皮膚素(DS)，由中國專利文獻CN103923899A(專利號201410160095.3)公開的 糖胺聚糖裂解酶巧化ase可降解硫酸軟骨素（CS)和透明質酸化A) ,Hyaluronidase來源于 Streptomyces曲日1山"〇1八;[(3113專一降解HA。為了進一步確定所制備的美洲大赤銳硫酸軟 骨素的純度，我們利用化on化Oteinase B(購自Sigma公司）、化on化Oteinase ABC(購自 Sigma公司），Hyaluronidase(購自Sigma公司Kr肥Lase等酶在各自最適反應條件下處理樣 品，然后進行冊LC分析。HPLC分析條件為凝膠柱：Superdex? peptide 10/300G1^;流動相： 0.2M NH祖C03;流速:0.4血/min;檢測條件：島津紫外檢測器(SPD-20A)檢測結果如圖2所示。
[0067] 分析發現所制備樣品不能被畑ondroteinase B、Hyalu;ronidase降解，但可被 化on化Oteinase ABCjH化ase降解而產物無顯著差異，證明樣品為CS且不含DS、HA等糖胺 聚糖。
[0068] 實施例3DG-CS的分子量分析
[0069] 平均分子量分別為11.6KD、48.服D、147邸、273邸、409.8KD的葡聚糖標準和實施例 1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS(質量濃度1 % )，分別取10化1進行HPLC分析。
[0070] 冊 LC 分析條件為凝膠柱：Ultrahydrogel? 100 7.8 X SOOmm(Water);流動相： 0.02MNa2HP04,0.02M化H2P04,0.02%NaN3，pH7.0;流速:0.6mL/min;檢測條件：島津示差 檢測器(RID-IOA)。
[0071] 結果如圖3所示，根據圖3可W計算出制備DG-CS平均分子量在623.2KD左右。
[0072] 實施例4DG-CS的二糖組成分析
[0073] (1)多糖降解
[0074] 將質量濃度為1 %的實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS樣品，與CSase ABC、5倍緩沖液（250mM Tris-肥l，250mM NaAC，PH 8.0)^及水按1:2:7(體積比）的比例混 合后，共，在最適溫度和最適pH下反應化條件下反應，離屯、濃縮儀上干燥。
[0075] (2)HPLC 分析
[0076] 二甲亞諷，冰醋酸，氯基棚氨化鋼和2-氨基苯甲酯胺按質量比14:6:1:1混合，取扣 1加入到W上的降解體系中，65°C反應化，反應物用=氯甲燒抽提6次，干燥處理，用水溶解， 取SOiil進行HPLC分析。
[0077] 檢測器：島津巧光檢測器RF-20A，柱子：YMC-Pack polyamin II column(250 X 4.6mm ID),流動相：1M Na出P〇4，16mM Na出P〇4,流速：lml/min。
[0078] 洗脫梯度如表1所示：
[0079] 表 1
[0080]
[0081] 結果如圖4所示，由圖4可W看出，經本發明制備的DG-CS主要由基本組成單位〇- unit(GlcA-GalNAc)、C-unit(GlcA-GalNAc(6S))、A-unit(GlcA-GalNAc(4S))、E-unit (GlcA-GalNAc(4S，6S))組成。
[0082] W圖4的結果，利用HPLC積分計算出DG-CS中各種基本組成單元所占的含量所示。 W此為根據，進而計算出DG-CS硫酸化度在1.43W上，具有高硫酸化度的特點。實施例1制得 的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS與商品化CS-E二糖組成、硫酸化度、分子量比較如表2所示。
[0083] 表 2
[0084]
[0085] 由上述結果可W看出，實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS與商品化CS-E二 糖組成、硫酸化度、分子量存在顯著差異，是一種新型富含E-unit的高硫酸化CS。
[00化]實施例5、DG-CS抗凝血活性檢測
[0087] 根據藥典，檢測實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS與標準肝素化抗FXa、抗 FIIa活性，結果如表3所示。
[0088] 表 3
[0089]
[0090] 由表3可W看出，實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS具有很低的抗FXa、抗 FIIa活性，分別為0.9U/mg、20U/mg，遠遠低于精品肝素（東營天東制藥有限公司貨號 KH1411048A)221U/mg、22抓/mg可有效避免體內溶血等副作用。
[0091] 實施例6、DG-CS抗腫瘤活性的檢測
[0092] (1)培養腫瘤細胞:乳腺癌細胞株4T1在含10 %胎牛血清，lOOU/ml青霉素、IOOiig/ ml鏈霉素雙抗，2mM非必需氨基酸、2mM k谷氨酷胺的DMBl培養液于37°C，5%C〇2培養箱傳 代培養；
[0093] (2)收集細胞:待培養足夠量的細胞后，用PBS清洗4T1腫瘤細胞，加入0.25 %膜蛋 白酶-6014在37°(：消化5-10111111，加入細胞培養液101111，懸浮洗涂細胞，1000巧111/111111離屯、 5min棄上清液，重復2次，離屯、收集細胞用適量PBS重懸；
[0094] (3)取IOiil單細胞懸浮液，用PBS 10倍稀釋，用細胞計數板在倒置顯微鏡下計數；
[0095] (4)用PBS重懸4T1腫瘤細胞到終濃度2 X IO6個/ml待用；
[0096] (5)對小鼠分別尾部側靜脈注射PBS、50yg實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG- CSaOOiig實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CSJO化g實施例1制得的高硫酸化硫酸軟 骨素06-〔5、10化旨精品肝素，10-60111111后經尾靜脈注射腫瘤細胞20化1/小鼠，4周后解剖小 鼠統計小鼠體內實體瘤個數，檢驗抗腫瘤效果，結果如圖6所示。
[0097] 與已有的抗腫瘤藥物精品肝素相比DG-CS具有相當的抗腫瘤效果，最佳用藥劑量 為10化g/只。計算抗腫瘤遷移活性：
[0098] (對照組平均每肺腫瘤個數一10化g實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS實 驗組平均每肺腫瘤個數)/對照組平均每肺腫瘤個數X 100%
[0099] 經計算，高硫酸化硫酸軟骨素抗腫瘤遷移活性為77 %。
[0100] 實施例8、新型CS與生長素、生長因子相互作用
[0101] 利用Biacore-T200系統將生物素化的DG-CS固定在親和素修飾的CM5忍片上，選擇 素(P-選擇素a-選擇素、E-選擇素）（來自于北京義翅神州生物技術有限公司）、生長因子 (堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、生長因子化GF)、等）（來自于北京義翅神州生物技術有 限公司）經皿S-EP，pH 7.4緩沖液與高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS相互作用，結果如圖7所示， 通過Biacore-T200分析軟件得出各蛋白分子與高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS作用的一些參數 如表4所示。
[0102] 表4DG-CS與蛋白分子相互作用
[0103]
[0104] 由表4可W看出，實施例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS與HGF、bFGF有很好的 結合作用，說明可能在CS抑制腫瘤轉移過程中是通過與HGF、bFGF等相互作用進而調節細胞 信號轉導來實現的。
[0105] 實施例9黑曲霉蛋白酶，木瓜蛋白酶質量比1:1混合酶制備高硫酸化硫酸軟骨素
[0106] (1)將Ikg美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)軟骨粉碎后加入加入3倍體積丙酬或無 水乙醇脫水、脫脂2地，3次后50°C烘干稱重，制得脫脂軟骨；
[0107] (2)向步驟（1)制得的脫脂軟骨中加水浸沒，100°C水浴處理30min，冷卻到室溫過 濾，過濾分離，向沉淀中加入20倍體積氯化巧棚酸緩沖液(0.1 M棚酸，IOmM氯化巧pH8.0)混 勻，加入原料干重2%。的混合酶(黑曲霉蛋白酶與木瓜蛋白酶按質量比1:1混合，均為普通市 售產品），于60°C反應72h，每隔2地補加1次酶，加酶量依次遞減為上次加酶量的0.5倍，共加 2次，100 °C滅酶活IOmin，8000巧m/min離屯、IOmin，取上清，制得酶解粗液；
[0108] (3)向步驟（2)制得的酶解粗液中按質量百分比為5%的比例加入TCA(S氯乙 酸），，離屯、去沉淀得上清，所得到的上清中加入等體積乙酸抽提殘余TCA，加入化OH調節pH 至8.0;然后加入酶解粗液質量5 %的NaAC固體，混勻，加入乙醇使體系中乙醇的體積終濃度 達到80% ,8000巧m/min離屯、IOmin，取沉淀，制得初級多糖；
[0109] (4)將步驟(3)制得的初級多糖溶解于水中，濃度為lOmg/ml，加入硫酸軟骨素溶液 重量60%的A98陰離子交換樹脂室溫解育O.化，WO. 5M，IM，2M氯化鋼溶液分別洗脫3倍柱體 積，收集洗脫峰，2M氯化鋼洗脫液合并醇沉，800化pm/min離屯、IOmin收集沉淀，蒸饋水溶解 后用孔徑為IOkDa超濾膜超濾，35°C干燥，制得高硫酸化硫酸軟骨素。
[0110] 對實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行純度、回收率檢測，方法同實施 例2,實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS純度、回收率分別為95%、17%。
[0111] 對實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行分子量檢測，方法同實施例3，實 施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS分子量為467.2kDa。
[0112] 對實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行二糖組成分析，方法同實施例4， 實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素二糖組成為：
[0113]
[0114]
[0115] 對實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行抗凝血檢測方法同實施例5,實 施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素抗FXa、抗FIIa活性，分別為0.3U/mg、12U/mg;
[0116] 對實施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行抗腫瘤實驗方法同實施例6,實 施例9制得的高硫酸化硫酸軟骨素抗腫瘤遷移活性為65%。
[0117] 對比例1用傳統制備方法利用美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)軟骨制備硫酸軟骨 素
[0118] 按照傳統制備方法用美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)軟骨制備硫酸軟骨素，具體 方法參見(方旭波，陳小娥，余輝，宋茹(2009).銳魚硫酸軟骨素糖蛋白的分離純化和鑒定. 中國食品學報.09(4): 103-108.)。
[0119] 對對比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行純度、回收率檢測，方法同實施 例2，對比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS純度、回收率分別為90%、18%。
[0120] 對對比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行分子量檢測，方法同實施例3,對 比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS分子量為90.8kDa。
[0121] 對對比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行二糖組成分析，方法同實施例4， 對比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素二糖組成為：
[0122]
[0123] ________
[0124] 對對比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素DG-CS進行抗腫瘤實驗，方法同實施例6,對 比例1制得的高硫酸化硫酸軟骨素抗腫瘤遷移活性不顯著。
[0125] 說明書中設及的參考文獻
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【主權項】
1. 一種高硫酸化硫酸軟骨素，其特征在于，分子量為100~SOOKDa，硫酸化度在0.7~ 1.43，二糖組成如下，均為質量百分比： O-unit 3.9^" 10%： C--unii 11.8 ~35%; A-unii 30 ~37,7%; E-unit 19 ~46.6%。2. 如權利要求1所述的高硫酸化硫酸軟骨素，其特征在于，所述高硫酸化硫酸軟骨素分 子量為623.2KDa，硫酸化度在1.43,二糖組成如下，均為質量百分比： O-unit 3.9%； C-unil 丨丨.8%; A-unii 37.7%； E-unit 46.6% 〇3. 權利要求1或2所述高硫酸化硫酸軟骨素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將美洲大赤魷(Dosidicus Gigas)軟骨粉碎后加入有機溶劑進行脫水脫脂，干燥， 制得脫脂軟骨； (2) 向步驟（1)制得的脫脂軟骨中加水浸沒處理，固液分離，向沉淀中加入酶反應緩沖 液，混合均勻，調pH 5.0~9.0，加入蛋白酶在40~70°C酶解反應24~96h，滅活酶，固液分 離，取液體，制得酶解粗液； 所述蛋白酶黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶與其他蛋白酶的混合;蛋白酶的加入量為 脫脂軟骨干重的1%。~5%。，黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的質量百分含量為20~100% ; (3) 將步驟(2)制得的酶解粗液經除蛋白后，調pH至7.0~10.0,然后加入酶解粗液質量 百分比1~10%的NaAC固體，溶解，加入乙醇使體系中乙醇的體積終濃度達到50%~85%， 固液分離，取沉淀，制得初級多糖； (4) 將步驟(3)制得的初級多糖溶解于水中，經陰離子交換樹脂純化，以0~2.5M氯化鈉 溶液濃度梯度洗脫，收集洗脫峰，醇沉，固液分離，超濾，干燥，制得高硫酸化硫酸軟骨素。4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)中，有機溶劑為丙酮或無水 乙醇，有機溶劑的加入量為沉淀體積的2~4倍;脫水脫脂的時間為4~24h，次數為2~4次。5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，處理條件為:在60~100 °C 處理 10~30min; 優選的，所述步驟(2)中，酶反應緩沖液為氯化鈣硼酸緩沖液，氯化鈣濃度為5~10mM， 硼酸濃度為50~100mM，pH7.0~9.0。6. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，其他蛋白酶為鏈霉蛋白 酶E、木瓜蛋白酶和/或胰蛋白酶混合酶； 優選的，所述步驟(2)中，酶解反應過程中，還包括兩次蛋白酶補加步驟，每次不加量均 為上次加酶量的0.4~0.6倍，第一次補加時間為酶解反應6~24h，第二次補加時間為酶解 反應12~48h。7. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，滅酶活條件為沸水浴中 靜置5~20min; 優選的，所述固液分離均為離心，條件為5000~lOOOOrpm/min離心5~20min。8. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)中，除蛋白的具體步驟如 下： 按步驟(2)制得的酶解粗液體積的2~10%加入三氯乙酸(TCA)，離心，取上清液，加入 乙醚抽提三氯乙酸，去除乙醚。9. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，陰離子交換樹脂純化的 具體條件為初級多糖溶解于水中，濃度為l〇mg/ml，加入硫酸軟骨素重量40~80%的陰離子 交換樹脂室溫孵育0.5~2h，以0~2.5M氯化鈉溶液濃度梯度洗脫分別洗脫3倍柱體積，收集 洗脫峰； 優選的，所述步驟(4)中，醇沉的乙醇體積濃度為50%~85%;超濾膜的截留分子量為 lOkDa以上;干燥溫度為不超過80°C。10. 權利要求1或2所述高硫酸化硫酸軟骨素在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/737GK105924544SQ201610323540
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】李福川, 王慶彬, 彭春娥, 陳翔雪, 韓乃寒
【申請人】山東大學