Ror1特異性嵌合抗原受體及其應用

Ror1特異性嵌合抗原受體及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種ROR1特異性嵌合抗原受體及其應用。本發明所提供的ROR1特異性嵌合抗原受體，為自氨基端到羧基端依次由抗人ROR1的scFv、CD8α的鉸鏈區和跨膜區、CD28跨膜區和胞內區、CD3ζ胞內區串聯而成的蛋白質。該嵌合抗原受體修飾的T細胞對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用，有望在各類實體瘤和血液腫瘤治療中得到廣泛應用。
【專利說明】
R0R1特異性嵌合抗原受體及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物與醫藥技術領域，設及一種RORl特異性嵌合抗原受體及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著腫瘤免疫學理論和技術的發展，過繼細胞免疫治療近年來取得了長足的進 步，W嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)修飾T細胞為代表的腫瘤祀向免疫 治療的成就尤為突出，在體外和臨床試驗中表現出良好的祀向性、殺傷性和持久性，展示了 巨大的應用潛力和發展前景。雖然如此，但也存在腫瘤特異的祀抗原可選擇性不多，殺傷效 果不顯著，W及"細胞因子風暴"、"脫祀效應"等安全性問題，因此研究廣譜、高效、安全的新 一代腫瘤祀向免疫治療方法是細胞免疫治療未來的發展趨勢和必須解決的問題。
[0003] CAR-T治療的基本原理是通過使用特定生物工程方法使得體外培養的T細胞具有 一個針對祀分子的胞外單鏈抗體-跨膜蛋白-胞內信號區的結構，由于胞外的單鏈抗體直接 與腫瘤細胞上的祀分子作用，因此無MH邱良制性，大幅度提升過繼免疫治療的效果。CAR結構 主要由膜外抗原結合區、較鏈區和胞內信號傳導區=部分構成。膜外區是一段單鏈可變區 結構域(SCFv)，具有特異性識別并結合TAA的功能；較鏈區通常是由免疫球蛋白超家族組 成，如CD8、CD28等;胞內信號傳導區主要是由CD3復合體中的a連組成。近年來，隨著研究的 深入，發現在胞內的信號傳導區中加入共刺激分子如CD28或CD137,可W加強T細胞的抗腫 瘤活性，因此，出現了第二代及第S代的CAR。表達CAR的T細胞可W直接識別并結合腫瘤細 胞表面的TAA，CA時尋信號傳入T細胞內，促使T細胞合成并分泌細胞因子，如穿孔素、顆粒酶、 INF-丫和TNF-a等，從而發揮殺傷腫瘤細胞作用。CAR-T細胞將抗體-抗原特異性結合的能力 W及T細胞介導的殺傷功能結合于一體，發揮特異性抗腫瘤活性CAR-T技術應用的關鍵是確 定一種腫瘤相關的抗原，運種抗原在腫瘤細胞表面高表達，而在正常細胞表面無表達或者 低表達。
[0004] RORl基因最初是從成神經瘤細胞系中克隆得到的，隨后的研究發現其在胚胎發育 過程中高表達，尤其在調節胚胎的肌肉和骨骼發育方面起關鍵作用。近年來研究發現，在脂 肪組織中存在少量表達，而在膜腺、肺、少量B前體細胞階段也有極少量表達，其他正常細胞 幾乎不表達，但在多種腫瘤細胞中卻高度表達。運些腫瘤細胞包括乳腺癌、黑色素瘤、腎癌、 肺腺細胞癌、胃癌等實體瘤細胞W及某些血液腫瘤細胞。就血液腫瘤而言，在慢性淋己細胞 白血病蛋白的腫瘤特異性表達量最高，在髓細胞白血病，邊緣區淋己瘤細胞中也有較高表 達，此外，骨髓瘤、彌漫性大B細胞淋己瘤，兒童B系淋己性白血病等腫瘤細胞也表達RORl，因 此RORl是一種腫瘤特異性高，并在各類腫瘤中具有廣譜表達的較為理想的腫瘤祀抗原。
[0005] 嵌合抗原受體基因修飾T淋己細胞（chimeric antigen receptor modified T cell, CAR-T)是通過取病人自身T細胞進行嵌合抗原受體的基因修飾。CAR-T細胞能夠特異 識別腫瘤細胞標志物，從而引導T細胞祀向腫瘤。CAR-T細胞治療方式的優點是能夠克服諸 多原因造成的T細胞不應答問題，運些原因包括腫瘤祀點密度過低，T細胞表位HLA類型的限 制或者HLA表達量太低。而CAR-T細胞治療的難點在于其對祀點在腫瘤細胞上表達的特異性 要求非常高，否則容易造成T細胞持續激活而殺傷正常B細胞，或釋放大量細胞因子引起嚴 重副作用。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種RORl特異性嵌合抗原受體及其應用。
[0007] 本發明所提供的RORl特異性嵌合抗原受體，為自氨基端到簇基端依次由抗人RORl 的scFv、CD8a的較鏈區和跨膜區、CD28跨膜區和胞內區、CD3C胞內區串聯而成的蛋白質。
[0008] 其中，所述抗人RORl的SCFv中的輕鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列1的第 1-110位所示;所述抗人RORl的SCFv中的重鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列1的第 111-198位所示。進一步，所述抗人RORl的scFv的氨基酸序列如序列表中序列1所示。所述 CDSa的較鏈區和跨膜區的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述CD28跨膜區和胞內區的 氨基酸序列如序列表中序列3所示。所述CD3C胞內區的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0009] 進一步，所述RORl特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
[0010] 其中，序列5共由449個氨基酸組成，其中第1-198位為所述抗人RORl的SCFv的氨基 酸序列；第199-267位為所述CDSa的較鏈區和跨膜區的氨基酸序列；第268-336位為所述 CD28跨膜區和胞內區的氨基酸序列;第337-449位為所述CD3C胞內區的氨基酸序列。
[0011] 編碼所述RORl特異性嵌合抗原受體的基因也屬于本發明的保護范圍。
[0012] 其中，編碼所述抗人RORl的SCFv中的輕鏈可變區的基因的核巧酸序列如序列表中 序列6的第1-330位所示;編碼所述抗人RORl的SCFv中的重鏈可變區的基因的核巧酸序列如 序列表中序列6的第331-594位所示。進一步，編碼所述抗人RORl的SCFv的基因的核巧酸序 列如序列表中序列6所示。編碼所述CDSa的較鏈區和跨膜區的基因的核巧酸序列如序列表 中序列7所示。編碼所述CD28跨膜區和胞內區的基因的核巧酸序列如序列表中序列8所示。 編碼所述CD3C胞內區的基因的核巧酸序列如序列表中序列9所示。
[0013] 進一步，編碼所述RORl特異性嵌合抗原受體的基因的核巧酸序列如序列表中序列 10所示。
[0014] 其中，序列10共由1350個核巧酸組成，其中第1-594位為編碼所述抗人RORl的SCFv 的基因的核巧酸序列；第595-801位為編碼所述CDSa的較鏈區和跨膜區的基因的核巧酸序 列；第802-1008位為編碼所述CD28跨膜區和胞內區的基因的核巧酸序列；第1009-1350位為 編碼所述CD3gi內區的基因的核巧酸序列。
[0015] 含有所述基因的重組載體、表達盒、重組病毒或重組細胞也屬于本發明的保護范 圍。
[0016] 其中，所述重組載體為能夠表達所述RORl特異性嵌合抗原受體的重組慢病毒表達 載體;具體為將所述基因克隆到慢病毒表達載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP后得到的重組 質粒；更加具體的為將所述基因（序列10)插入到慢病毒表達載體PCDH-EF1-MCS-T2A- copGFP的多克隆位點XbaI和BamHI之間后得到的重組質粒。所述重組細胞為能夠表達所述 RORl特異性嵌合抗原受體的免疫效應細胞。所述重組病毒為能夠表達所述RORl特異性嵌合 抗原受體且能夠侵染免疫效應細胞的病毒。
[0017]具體的，所述免疫效應細胞可為細胞毒性T淋己細胞、NKT細胞、NK細胞或輔助性T 細胞。所述病毒為慢病毒、瘤疹病毒、巨隧細胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒 或艾滋病毒。
[001引本發明還提供了 RORl特異性CAR-T細胞的制備方法。
[0019] 本發明所提供的RORl特異性CAR-T細胞的制備方法，具體可包括在T細胞上表達所 述RORl特異性嵌合抗原受體的步驟。
[0020] 具體的，所述方法可包括如下步驟：（1)將能夠表達所述RORl特異性嵌合抗原受體 的重組表達載體A和PSPAX2質粒W及pMD2. G質粒轉染293T細胞，獲得病毒上清;所述重組表 達載體A為將所述基因克隆到慢病毒表達載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP后得到的重組質 粒；（2)用所述病毒上清感染T細胞，從感染后的細胞中獲得表達所述RORl特異性嵌合抗原 受體的T細胞。
[0021] 其中，步驟(1)中，所述重組表達載體A、所述PSPAX2質粒和所述PMD2.G質粒的摩爾 比具體可為4:2:1。在轉染293T細胞后的48-72小時可獲得所述病毒上清;得到所述病毒上 清后還可包括對所述病毒上清進行離屯、（如4°C 3000rpm離屯、IOmin)、過濾(如0.45WI1濾器過 濾）、再離屯、(如4°C50000g離屯、化)及濃縮(如10倍濃縮)的步驟。
[0022] 步驟(2)中，所述T細胞的可來源于外周血單個核細胞、腹水、胸腔積液或腫瘤組 織。采用所述病毒上清感染所述T細胞時，具體可為按照每1 X IO6T細胞加入含有1 X IO8P即 的病毒上清的量進行感染。在進行完所述感染后還可包括如下步驟：向感染體系中加入 Polybrene至終濃度為祉g/ml，然后置于32 °C，ISOOrpm離屯、1.化后轉入5 % C0237 °C解箱培 養2地，然后換液并Wl X lOVml的密度接種并加入rhIL-2W200IU/ml刺激培養。
[0023] 所述RORl特異性嵌合抗原受體或基因或重組載體或表達盒或重組病毒或重組細 胞在如下任一中的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0024] (a)制備用于治療腫瘤的產品；
[0025] (b)制備用于殺傷表達RORl蛋白的腫瘤細胞的產品。
[0026] 其中，所述腫瘤具體為與RORl蛋白表達異常（如RORl蛋白高表達)相關的腫瘤，具 體可選自如下中任一:乳腺癌、黑色素瘤、腎癌、肺腺細胞癌、胃癌等實體瘤細胞W及某些血 液腫瘤。在本發明中，所述腫瘤細胞具體為RORl陽性的腫瘤細胞，如MDA-MB-231、Raji和 K562/R0R1 細胞。
[0027] 在本發明中，所述產品具體可為藥物。
[0028] 本發明的有益效果:本發明采用抗人RORl SCFv基因序列，將其進行密碼子優化， 從NCBI GenBank數據庫中捜索到人CDSa信號膚基因，人CDSa較鏈膚基因、人CD28跨膜區和 胞內區基因，W及人CD3C胞內區基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受體hRORl SCFv- hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C 化 R0R1-CAR)基因片段，插入到慢病毒表達載體 pCDH-EFl-MCS- T2A-COPGFP中，構成抗人RORl-CAR表達質粒(pCDH-CAR質粒），利用該質粒與慢病毒包裝質 粒PSPAX2和PMD2.G在293T細胞中包裝病毒并感染T細胞，使T細胞表達該嵌合抗原受體。獲 得的CAR-T細胞在體外與RORl陽性的腫瘤細胞MDA-MB-231、Raj巧日K562/R0R1共培養，通過 流式細胞術、細胞毒性分析實驗W及化ISA檢測T細胞分泌的細胞因子，W證實該嵌合抗原 受體修飾的T細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷作用。利用該技術，可W將CAR分子精確地整合 到人T細胞基因組特定的"安全港"位點，不影響任何人體正常基因的給功能，因此本發明所 述的嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C可在各類實體瘤和血液腫瘤治 療中得到廣泛應用。
【附圖說明】
[OO巧]圖1為慢病毒表達載體pCDH-EF 1-MCS-T2A-COPGFP的質粒圖譜。
[0030]圖2為巧光顯微鏡觀察慢病毒感染T細胞后的綠色巧光表達情況。
[0031 ]圖3為流式細胞儀檢測慢病毒感染T細胞后的GFP陽性率。
[0032] 圖4為流式細胞儀檢測慢病毒感染后T淋己細胞的比例及表面CAR蛋白的表達情 況。
[0033] 圖5為CAR-T細胞的體外殺傷作用測定結果。
[0034] 圖6為化ISA檢測各祀細胞與CAR-T細胞共培養上清中細胞因子IFN-丫、TNF-CUlk 2的水平。其中，A為TNF-a檢測結果;B為IL-2檢測結果;C為IFN-丫檢測結果。
[0035] 圖7為CAR-T細胞的體內殺瘤活性檢測結果(腫瘤大小）。
[0036] 圖8為CAR-T細胞的體內殺瘤活性檢測結果(小鼠存活率）。
【具體實施方式】
[0037] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0038] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0039] 慢病毒表達載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP:普如汀生物技術(北京)有限公司產 品。該質粒能表達GFP，產生綠色巧光。該載體的質粒圖譜如圖1所示。
[0040] PSPAX2質粒:為優寶生物產品，產品貨號:VT1444。
[0041 ] pMD2.G質粒:為優寶生物產品，產品貨號:VT1443。
[0042] 293T細胞:為ATCC產品，其產品編號為CRk3216?。
[0043] MDA-MB-231細胞:為ATCC產品，其產品編號為HTB-26?。
[0044] Raji細胞:為ATCC產品，其產品編號為C化-86?。
[0045] K562細胞:為ATCC產品，其產品編號為C化-243?。
[0046] 實施例UhRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C表達質粒的構建
[0047] 一、hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C基因序列的確定
[004引從美國國立醫學圖書館網站化ttp: //www. ncbi . nlm. nih. gov/entrez )GenBank數 據庫中捜索到人CD8a較鏈區和跨膜區基因、人CD28跨膜區和胞內區基因，人CD3C胞內區基 因序列信息，W及抗人RORl SCFv基因序列，并將其進行密碼子優化，W保證在編碼氨基酸 序列不變情況下更適合人類細胞表達。
[0049] 其中，抗人RORl SCFv基因的核巧酸序列如序列表中序列6所示。人CDSa較鏈區和 跨膜區基因的核巧酸序列如序列表中序列7所示。人CD28跨膜區和胞內區基因的核巧酸序 列如序列表中序列8所示。人CD3C胞內區基因的核巧酸序列如序列表中序列9所示。
[0050] 將上述基因序列依次按人CDSa信號膚基因、抗人RORl SCFv基因、人CDSa較鏈區和 跨膜區基因、人CD28跨膜區和胞內區基因W及人CD3C胞內區基因序列進行連接，形成最終 完整的hRORl-CAR基因序列信息，具體如序列表中序列10所示。序列10共由1350個核巧酸組 成，其中第1-594位為編碼所述抗人RORl的SCFv的基因的核巧酸序列；第595-801位為編碼 所述CDSa的較鏈區和跨膜區的基因的核巧酸序列；第802-1008位為編碼所述CD28跨膜區和 胞內區的基因的核巧酸序列;第1009-1350位為編碼所述CD3C胞內區的基因的核巧酸序列。
[0化1]二、hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C表達質粒的構建
[0052] 全基因合成步驟一優化后的完整的hRORl-CAR序列(序列10,克隆到慢病毒表達載 體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP(簡稱pCDH-空載體）中，獲得抗人CD19-CAR表達質粒(命名為 pCDH-CAR質粒)和含有該質粒的D冊a菌液。具體操作如下：用限制性內切酶Xba巧郵amHI雙 酶切hRORl-CAR序列Ttctaga+序列10+GGATCC")，與經過同樣雙酶切的慢病毒表達載體 pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP相連，得到重組質粒。將重組質粒送上海英俊生物技術有限公司 進行測序，將測序結果與擬合成的hROR 1 -CAR序列比對W證實序列正確。測序引物為Sen S e 和Anti-sense。將經測序表明，在慢病毒表達載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP的酶切位點 甜a巧郵amHI之間插入序列表中序列10所示DNA片段的重組質粒命名為pCDH-CAR。
[0053] Sense:5 ' 一ctccac邑Cttt邑CCt邑accct邑ctt-3 '；
[0054] Anti-sense:5'一邑邑t邑at邑C邑邑cactc邑atctccat邑一3' O
[0055] S、包裝質粒和目的質粒的提取
[0化6] 將步驟二構建的pCDH-CAR質粒，W及pCDH-空載體、PSPAX2和pMD2 .G包裝質粒的菌 株在LB培養基中大量培養，采用北京天根生化科技有限公司的無內毒素質粒提取試劑盒 (DP117)提取質粒，W備感染。具體操作步驟如下：
[0057] 1、柱平衡步驟：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液 化，80(K)rpm離屯、2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液處理 過的柱子最好立即使用）。
[0058] 2、取100mL(根據培養菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200ml)過夜培養的 菌液加入離屯、管，室溫8000巧m離屯、3min收集細菌，盡量吸除上清。
[0059] 注意：菌液較多時可W通過幾次離屯、將菌體沉淀收集到一個離屯、管中，菌液量W 能夠充分裂解為佳，菌液過多會導致裂解不充分從而降低質粒的提取效率。
[0060] 3、盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。
[0061] 4、向留有菌體沉淀的離屯、管中加入8ml溶液PU請先檢查是否已加入RNase A)，使 用移液器或滿旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。
[0062] 注意:請務必徹底懸浮細菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解效果，導 致提取量和純度偏低。對于低拷貝質粒，加大菌體用量的同時按比例增加Pl、P2、P4的用量。
[0063] 5、向離屯、管中加入8ml溶液P2,立即溫和地上下翻轉6-8次，室溫放置5min。注意： 溫和地混勻，不要劇烈震蕩，W免污染基因組DNA。此時菌液應變得清亮粘稠，如果未變得清 亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。
[0064] 6、向離屯、管中加入8ml溶液P4,立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，至溶液出現 白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置IOmin左右。800化pm離屯、5-lOmin，使白色沉淀離至管底 (可適當增加離屯、時間），將全部溶液小屯、倒入過濾器CSl中（請避免倒入大量沉淀而阻塞過 濾器），慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50ml的管中（自備）。
[0065] 注意：加入溶液P4后應立即混勻，避免產生局部沉淀。如果離屯、后倒入過濾器CSl 中的溶液有白色沉淀也不會影響過濾。如果菌體過多（MOOml)，推薦延長離屯、時間至20- 30min。
[0066] 7、向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇(加入異丙醇過多容易導致RNA污染），上 下顛倒混勻后轉移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）。
[0067] 注意:過濾后濾液會損失，根據損失的不同請加入不同體積的異丙醇。吸附柱CP6 的最大容積為15ml，所W需要分2次過柱。
[0068] 8、室溫8000巧m離屯、2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。
[0069] 注意:將第7步中所得溶液分2次過柱，每次均按W上條件操作。
[0070] 9、向吸附柱CP6中加入IOml漂洗液PW(請先檢查是否已加入無水乙醇），SOOOrpm離 屯、2min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0071] 10、重復操作步驟9。
[0072] 11、向吸附柱CP6中加入3ml無水乙醇，室溫8000巧m離屯、2min，倒掉廢液。
[0073] 12、將吸附柱CP6重新放回收集管中，800化pm離屯、5min，目的是將吸附柱中殘余的 漂洗液去除。
[0074] 注意:漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)實驗。為確保下 游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP6開蓋，置于室溫放置數分鐘，W徹底驚干吸 附材料中殘余的漂洗液。
[0075] 13、將吸附柱CP6置于一個干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1- 2ml洗脫緩沖液TB，室溫放置5min，然后室溫8000巧m離屯、2min。將50ml離屯、管中的洗脫液全 部移入一個干凈的1.5ml離屯、管，-20°C保存。
[0076] 注意:為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟 13。
[0077] 實施例2、嵌合抗原受體hR0RlscFv-Mnge-TM-CD8a-CD28-CD3。區病毒修飾T細胞 的制備及其鑒定
[007引一、嵌合抗原受體hR0RlscFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3。區病毒修飾T細胞的制備
[0079] l、將實施例l構建的pCDH-CAR質粒W及包裝質粒pSPAX2和pMD2.G按4:2:l比例用 聚乙締亞胺轉染試劑(Sigma公司）轉染293T細胞，具體方法見PEI轉染試劑說明書。分別于 轉染后72小時收取病毒上清，于4°C，300化pm離屯、10分鐘后經0.45皿濾器過濾后，采用4°C SOOOOg化超速離屯、后進行10倍濃縮，將收集的病毒濃縮液轉入-80°C保存。
[0080] 2、T細胞的制備
[0081 ]取健康供者新鮮外周血，用Ficoll分離液和人T細胞富集抗體混合物(StemCell公 司）分離獲得較純的CD3+T cell(約占95% W上），具體操作步驟詳見RosetteSep T cell enrichment Cocktai 1說明書。用含10%FBS的RPMI1640培養基調整細胞濃度至1 X lOVml， 將細胞Wlml/孔接種至預先用抗人CD3和CD28抗體(eBioscience，用量為扣g/ml)包被的24 孔板，再加入500IU/ml重組人白細胞介素2(rhIL-2)，刺激培養2地后進行病毒感染。
[0082] 3、慢病毒感染T細胞及感染后T細胞的培養
[0083] 從-80°C中取出步驟1獲得的病毒濃縮液，按每IX IO6T細胞加入10化1病毒上清 (相當于1 X IO8PFU)，后加入化Iybrene至終濃度為祉g/mr混勻后，置于32°C，ISOOrpm離屯、 l.化后轉入5%C02,37°C解箱培養;將培養24h后的細胞W100 0巧ml0min離屯、換液，WlX l(yVml的密度接種于六孔板中，加入rhIL-2W200IU/ml刺激培養后，每2-3天換液一次，細 胞生長密度和rhIL-2用量同前;感染后96h，用巧光顯微鏡觀察T細胞的綠色巧光表達情況 并照相，結果見圖2。收集細胞后，1000巧m離屯、IOmin，PBS洗涂1次，用適量PBS重懸細胞置于 流式檢測管仲，用流式細胞儀檢測GFP陽性率，結果見圖3。
[0084] 二、流式細胞儀檢測感染后T淋己細胞的比例及表面CAR蛋白的表達
[0085] 離屯、收集感染后9加的待檢測細胞及對照組（WpCDH-空載體替代實施例1構建的 pCDH-CAR質粒），PBS洗涂1次后棄上清，按照抗體說明書加入相應檢測量的單抗(CD3由APC anti-human CD3標記，購自ebioscience，貨號：17-0037;CAR由Biotin anti-mouse IgG,F (ab'）2和APC/切TStr邱tavidin標記，其中CAR即為序列5所示的嵌合抗原受體hRORl scFv- hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C)，用于流式細胞儀檢測感染后T淋己細胞的比例及表面CAR蛋白 的表達情況。
[0086] 結果見圖4,由圖可見經重組慢病毒表達載體pCDH-CAR表達產物刺激后的T淋己細 胞成功獲得了表達RORl特異性嵌合抗原受體的T細胞，即為CAR-T細胞。
[0087] 實施例3、嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3。區病毒修飾T細胞 的體外殺瘤活性檢測
[008引一、多種腫瘤細胞系中RORl表達水平
[0089] 供試腫瘤細胞系：Ra j i、K562、K562/R0R1 (轉染了RORl 的K562細胞）、MDA-MB-231。
[0090] 將各供試腫瘤細胞系分別培養后，各取5 X IO5個細胞的細胞懸液，PBS洗涂2次后， 加入APC標記的抗人RORl單抗（eBioscience公司），W標記APC-isotype(eBioscience公司 產品）為對照組，冰上解育30min，采用流式細胞術檢測各種細胞系的RORl表達的水平。實驗 重復=次，結果取均值。
[0091] 結果顯示：1?3^'1、1(562/1?01?1、]\?^-]\?-231細胞系表達1?0則的百分率分別為69%、 90 % 和95 % ;而K562不表達RORl。
[0092] 根據不同的祀細胞分為四個實驗組:]\?^-]\?-231、1?曰^'1、1(562/1?01?1組(轉染了1?0尺1 的K562細胞)和K562細胞組，設置效應細胞對照組和祀細胞對照組。調整效應細胞CAR-T(實 施例2制備)和各組相應的祀細胞密度，分別為1 X 106/m巧日1 X lOVml，在各實驗組中按效祀 比化/T) 10:1往96孔板中加入效應細胞懸液和祀細胞懸液，總體積為20化L，放入37 °C，5 % 0)2培養箱中培養4她后每孔加入20化CCK-8，繼續解育化后上酶標儀檢測，于450nm波長處 讀取OD值，殺傷率=[1-(實驗組OD值-效應細胞對照組OD值)/祀細胞對照組OD值]X 100%。
[0093] 實驗同時設置W pCDH-空載體替代實施例1構建的pCDH-CAR質粒的對照組(NTD-T 組)。
[0094] 結果如圖 5 所示，由圖可見 WMDA-MB-231、Raji、K562/R0Rl(轉染了 RORl 的 K562 細 胞)為祀細胞時，CAR-T細胞對其殺傷作用明顯高于NTD-T組。而WK562為祀細胞時，CAR-T細 胞對其殺傷作用與NTD-T組類似，均較低。
[0095] 二、ELISA檢測各祀細胞與CAR-T細胞共培養上清中細胞因子IFN-丫、TNF-a、化-2 的水平
[0096] 實驗分組同上，每組設3個復孔。取出已包被抗體（IFN-丫，購自Abcam公司，貨號： (ab46551); TNF-a，購自Abcam公司貨號：181421;比-2，購自Abcam公司貨號：174444)的酶標 板，設置TMB空白顯色孔，依次加入0.1ml按一定倍數稀釋的標準品及用樣品稀釋液稀釋的 樣品。酶標板加上蓋，37°C反應90min。反應后用自動洗板機吸棄酶標板內的液體。分別將生 物素化的抗人IFN-丫、TNF-a、化-2抗體（同上)工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白顯色 孔除外），37°C反應60min，0.01M PBS洗涂3次。將ABC工作液按每孔0.1 ml依次加入(TMB空白 顯色孔除外），37°C反應30min，0.0IM PBS洗涂5次。按每孔90山依次加入TMB顯色液，37°C避 光反應20-25min，按每孔O. Iml依次加入TMB終止液，用酶標儀在450nm處測定OD值。根據標 準曲線計算共培養上清中IFN-丫、TNF-a、比-2細胞因子水平。實驗重復S次，結果取均值。
[0097] 結果表明：各祀細胞與CAR-T細胞共培養上清中TNF-a(圖6中A)、化-2(圖6中B)、 IFN-丫（圖6中C)細胞因子水平不表達RORl的K562細胞的共培養上清中的IFN-丫、TNF-a、 IL-2細胞因子水平相比較有顯著性升高（均P<0.01)。該結果表明，嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C修飾的T細胞（即CAR-T細胞)在表達RORl細胞系刺激下，能 夠分泌化1類細胞因子。
[0098] 實施例4、嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3。區病毒修飾T細胞 體內殺瘤活性檢測
[0099] 收集對數生長期的MDA-MB-231腫瘤細胞，調整細胞濃度于每只小鼠右側背部皮下 接種5 X IO6個細胞;待腫瘤體積達到300-400mm3時，計數CAR-T細胞(實施例2制備)濃度調整 至1 X IO8個/ml，尾靜脈注射小鼠 10化1/只，對照組注射未經嵌合抗原受體修飾的T淋己細 胞，于接種腫瘤細胞30天后，用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，計算腫瘤體積并統計生存率。
[0100] 實驗同時設置W pCDH-空載體替代實施例1構建的pCDH-CAR質粒的對照組(NTD-T 組)和未處理組。
[0101] 具體結果如圖7和圖8所示，由圖可見，與NTD-T組和未處理組相比，CAR-T組小鼠的 腫瘤大小得到有效控制，并且其存活率得到顯著提高。在實驗進行的30天內，NTD-T組和未 處理組小鼠均全部死亡，而CAR-T組小鼠仍100 %存活。
[0102] 綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，其中一個或更多個技術方 案中所記載的技術特征可W與任意的一個或多個技術方案相組合，運些經組合而得到的技 術方案也在本申請的保護范圍內。
【主權項】
1. RORl特異性嵌合抗原受體，為自氨基端到羧基端依次由抗人RORl的scFv、CD8a的鉸 鏈區和跨膜區、CD28跨膜區和胞內區、CD3G胞內區串聯而成的蛋白質。2. 根據權利要求1所述的RORl特異性嵌合抗原受體，其特征在于:所述抗人RORl的scFv 中的輕鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列1的第1-110位所示;所述抗人RORl的scFv中 的重鏈可變區的氨基酸序列如序列表中序列1的第111-198位所示;和/或 所述抗人RORl的scFv的氨基酸序列如序列表中序列1所示;和/或 所述CDSa的鉸鏈區和跨膜區的氨基酸序列如序列表中序列2所示;和/或 所述CD28跨膜區和胞內區的氨基酸序列如序列表中序列3所示;和/或 所述CD3G胞內區的氨基酸序列如序列表中序列4所示。3. 根據權利要求1或2所述的RORl特異性嵌合抗原受體，其特征在于：所述RORl特異性 嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中序列5所示。4. 編碼權利要求1-3中任一所述RORl特異性嵌合抗原受體的基因。5. 根據權利要求4所述的基因，其特征在于:編碼所述抗人RORl的scFv中的輕鏈可變區 的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第1-330位所示;編碼所述抗人RORl的scFv中的重 鏈可變區的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第331-594位所示;和/或 編碼所述抗人RORl的scFv的基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示;和/或 編碼所述CDSa的鉸鏈區和跨膜區的基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示;和/或 編碼所述CD28跨膜區和胞內區的基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示;和/或 編碼所述⑶3ζ胞內區的基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。6. 根據權利要求4或5所述的基因，其特征在于：編碼所述RORl特異性嵌合抗原受體的 基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。7. 含有權利要求4-6中任一所述基因的重組載體、表達盒、重組病毒或重組細胞。8. 根據權利要求7所述的重組病毒或重組細胞，其特征在于:所述重組細胞為能夠表達 權利要求1-3中任一所述RORl特異性嵌合抗原受體的免疫效應細胞； 所述重組病毒為能夠表達權利要求1-3中任一所述RORl特異性嵌合抗原受體，且能夠 侵染免疫效應細胞的病毒； 具體的，所述免疫效應細胞為細胞毒性T淋巴細胞、NKT細胞、NK細胞或輔助性T細胞;所 述病毒為慢病毒、皰疹病毒、巨噬細胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或艾滋病 毒。 9. RORl特異性CAR-T細胞的制備方法，包括在T細胞上表達權利要求1-3中任一所述 RORl特異性嵌合抗原受體的步驟； 具體的，所述方法包括如下步驟：（1)將能夠表達所述RORl特異性嵌合抗原受體的重組 表達載體A和pSPAX2質粒以及pMD2. G質粒共轉染293Τ細胞，獲得病毒上清;所述重組表達載 體A為將權利要求4-6中任一所述基因克隆到慢病毒表達載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP后 得到的重組質粒；（2)用所述病毒上清感染T細胞，從感染后的細胞中獲得表達所述RORl特 異性嵌合抗原受體的T細胞。10. 權利要求1-7中任一所述的RORl特異性嵌合抗原受體或基因或重組載體或表達盒 或重組病毒或重組細胞在如下任一中的應用： (a)制備用于治療腫瘤的產品； (b)制備用于殺傷表達RORl蛋白的腫瘤細胞的產品。
【文檔編號】C12N5/10GK105924533SQ201610550998
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月13日
【發明人】盧戌, 劉靜維, 楊照敏, 鄧麗娟, 劉雪松, 李京坡, 黃彩庭
【申請人】北京康愛瑞浩生物科技股份有限公司