嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、car138-nkt細胞及其制備方法和應用

嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、car138-nkt細胞及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CAR138-NKT細胞及其制備方法和應用，所述嵌合抗原受體為CD138ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串聯的大鼠生長激素信號肽、CD138ScFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域。采用本發明的CAR138-NKT細胞與CD138陽性的骨髓瘤細胞共培養時，對骨髓瘤細胞具有很好的特異殺傷活性。
【專利說明】
嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CAR138-NKT細胞 及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于腫瘤生物制品領域，具體地，設及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重組表達載體、工程化CD138祀向性的NKT細 胞（CAR138-NKT細胞）及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞（MT)是一種特殊類型的T淋己細胞亞群，具有T細胞和NK細胞細 胞兩重性質。NKT細胞能表達T細胞的TCR與NK細胞的NKR-Pl兩種受體，在TCR和NKR介 導下，NKT細胞能夠產生大量的比-4及INF 丫，對腫瘤細胞發揮細胞殺傷作用。NKT細胞通 過自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結合，發揮抗體依賴性的細胞介導的細胞毒作用 (ADCC，antibody-dependent cell-mediated 巧totoxicity)。但在抗體依賴的細胞介導的 殺傷作用過程中，由于抗體能與祀細胞上的相應抗原表位特異性結合，NKT細胞可殺傷任何 已與抗體結合的祀細胞，因此抗體與祀細胞上的抗原結合是特異性的，但NKT細胞對祀細 胞的殺傷作用是非特異性的。另外，通常情況下，輸注的NKT細胞在患者體內半衰期為2周 左右，有效期短暫，需要反復多次輸注。而且，NKT細胞本身缺少特異性抗體，不足W在腫瘤 周圍或者瘤巢中富集，制約了 NKT細胞對惡性腫瘤的祀向治療。再者，研究表明，NKT細胞 并不是對所有的腫瘤都有殺傷效果，且對部分腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待 提高，NKT細胞對腫瘤干細胞的免疫監視目前仍然存在爭議。
[0003] 多發性骨髓瘤（Multiple myeloma, MM)是漿細胞異常增生的B細胞惡性腫瘤，W 骨髓中積聚大量的惡性漿細胞并分泌單克隆免疫球蛋白為特征。骨髓瘤細胞表面表達一系 列的粘附分子如CD138。CD138是一種屬于跨膜粘蛋白聚糖家族成員，與骨髓微環境中的生 長因子和基質成分相結合，介導多發性骨髓瘤細胞的粘附和歸巢。隨著對CD138研究的逐 步深入，人們發現CD138在機體的損傷修復及腫瘤的生長、遷移中都起了關鍵作用。目前 CD138被認為是漿細胞最特異的表面標志物，研究顯示，CD138分子在B細胞惡性腫瘤中的 表達非常復雜，在MM患者骨髓和外周血中的漿細胞表達，而骨髓中的造血前體細胞或淋己 細胞不表達。CD138分子水平的升高可W作為骨髓瘤預后不良的有效指標，并且當MM細胞 呈現調亡時，膜表面CD138分子表達下調或丟失，可反映MM患者體內腫瘤細胞的負荷。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是為了克服現有技術中NKT細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高的缺陷，提供一種嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和 重組表達載體、工程化CD138祀向性的NKT細胞（CAR138-NKT細胞）及其制備方法和應用。
[0005] 本發明的發明人在研究中意外發現，采用本發明的嵌合抗原受體 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞與CD138陽性的多發性骨髓瘤細胞共培養時， 對多發性骨髓瘤細胞具有很好的特異殺傷活性。
[0006] 因此，為了實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C，包括串聯的大鼠生長激素信號膚、CD138ScFv、 CD8的較鏈區化inge區）和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域。
[0007] 第二方面，本發明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第=方面，本發明提供了含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 第四方面，本發明提供了一種工程化CD138祀向性的NKT細胞，所述NKT細胞是上 述嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞。
[0010] 第五方面，本發明提供了一種工程化CD138祀向性的NKT細胞的制備方法，所述方 法包括：
[0011] 包裝攜帶pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒 濃縮液；利用得到的病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 G。
[0012] 第六方面，本發明提供了上述方法制備得到的工程化CD138祀向性的NKT細胞。
[0013] 第屯方面，本發明提供了上述工程化CD138祀向性的NKT細胞在制備用于治療腫 瘤的制劑中的應用。
[0014] 在與CD138陽性的多發性骨髓瘤細胞共培養時，本發明的嵌合抗原受體 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞，即工程化CD138祀向性的NKT細胞能夠特 異性結合CD138抗原，增強免疫細胞祀向識別骨髓瘤細胞表面CD138抗原的能力，加強對 CD138陽性骨髓瘤細胞的特異殺傷活性。本發明的工程化CD138祀向性的NKT細胞為治療 CD138陽性的多發性骨髓瘤提供了一種新的選擇，具有良好的產業應用前景。
[0015] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予W詳細說明。
【附圖說明】
[0016] 圖1為流式細胞術對分離培養的NKT細胞表型分析的結果。 陽017] 圖2為本發明的慢病毒表達載體pWP化-CD8-CD137-CD3 C的限制性內切酶MluI/ NdeI雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0018] 圖3為本發明的慢病毒表達載體pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的限制性內 切酶BamHI/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0019] 圖4為本發明的慢病毒表達載體pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的結構示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0020] 圖5為流式細胞術檢測含有嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的病毒濃 縮液對NKT細胞的感染效率。
[0021] 圖6為流式細胞術檢測嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細 胞（CAR138-NKT細胞）表型鑒定的結果。
[0022] 圖7為本發明的CAR138-NKT細胞對CD138陽性的多發性骨髓瘤細胞的殺傷作用 的細胞毒性分析圖。
【具體實施方式】
[0023] W下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0024] 本發明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C，包括串聯的大鼠生長激素信號膚、CD138單鏈抗體 CD138ScFv、CD8的較鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域。 陽0巧]優選情況下，嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C由大鼠生長激素信號 膚、CD138ScFv、CD8的較鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構 域串聯構成。進一步優選地，嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更進一 步優選地，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[00%] 本發明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優選情況下，所述基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，進一步優選地，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核巧酸序列如 沈QID NO. 2所示。
[0027] 本發明提供了含有上述基因的重組表達載體。優選情況下，重組表達載體為慢病 毒表達載體。對于慢病毒表達載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉染包裝細胞 如293T包裝細胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的 NKT細胞即可，優選情況下，慢病毒表達載體為pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0028] 對于慢病毒表達載體pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的制備方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術人員能夠想到的各種方法，優選情況下，慢病毒表達載體 pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3C的制備方法包括W下步驟：
[0029] (1)從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區和跨膜區、CD137的胞 內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域，并克隆至載體pWP化-G評中，構建得到 pWP化-CD8-CD137-CD3C ;
[0030] 似合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD138ScFv的核巧酸序列，并克隆至 pWP化-CD8-CD137-CD3 C中，經測序驗證后得到序列正確的pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137- CD3 C。 陽03U 步驟（1)中，對于從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區和跨膜區、CD137的 胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域的方法沒有特別的限定，可W為本領域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，NKT細胞可W通過分離人靜脈血中的單個核細胞， 然后進行培養獲得。
[0032] 具體地，得到pWP化-CD8-CD137-CD3 C的方法可W包括：提取NKT細胞的總RNA， 逆轉錄獲得NKT細胞cDNA，W得到的NKT細胞CDNA為模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)進行PCR擴增獲得CD8基因的hinge區和跨膜區（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)進行PCR擴增獲得CD137基因的胞內信號結構域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5(SEQID NO. 15)和 P6(SEQID NO. 16)進行 PCR擴增獲得 CD3 C 基 因的胞內信號結構域（SEQID NO. 5)，將獲得的PCR產物分別進行雙酶切，然后與Mlul/Ndel 雙酶切后的慢病毒表達載體pWP化-GFP連接。
[0033] 步驟（2)中，對于合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD138ScFv的核巧酸序列的方 法沒有特別的限定，可W為本領域常用的各種方法，例如可W通過全基因合成技術合成。
[0034] 具體地，得到序列正確的pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的方法可 W包括：通過全基因合成技術合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD138ScFv融合基 因的核巧酸序列（SEQID NO. 8)，克隆至載體pGSI中，得到pGSI-CD138ScFv ;然后 將pGSI-CD138ScFv進行BamHI/MluI雙酶切，與用BamHI/MluI雙酶切后的步驟 (1)得到的重組質粒PWP化-CD8-CD137-CD3 C連接，經測序鑒定，得到序列正確的 pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C。其中，大鼠生長激素信號膚的核巧酸序列如沈QID NO. 6所示，CD138ScFv核巧酸序列如沈QID NO. 7所示。
[0035] 本發明還提供了一種工程化CD138祀向性的NKT細胞，所述NKT細胞是由上述嵌 合抗原受體 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C 修飾的 NKT 細胞（即 CAR138-NKT 細胞）。
[0036] 本發明還提供了一種工程化CD138祀向性的NKT細胞的制備方法，該方法包括：包 裝攜帶pWP)(L-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的病毒 濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0037] 對于包裝攜帶pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒的方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術人員常用的各種方法，優選情況下，將慢病毒表達載體 pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3C 與輔助質粒（如 psPAX2、pMD2. G)共轉染 293T 包裝細 胞，轉染48-7化時收集病毒上清，離屯、、過濾，在濾液中添加5 XPEGeooo-NaCl進行混勻，離 屯、后棄上清，沉淀用0-4°C預冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。 陽03引本發明的方法中，還包括通過如下方法制備NKT細胞：
[0039] (1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階 段培養；
[0040] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養的細胞進行第二階段培養。
[0041] 優選情況下，所述第一階段培養的實施方式包括：將單個核細胞培養于第一 NKT 細胞培養液中，所述第一 NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、CD3單克隆抗體、白介 素-2和白介素-15 ;進一步優選地，第一 NKT細胞培養液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為 30-70ng/mU和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mU和/或所述白介素-15的濃度為 30-70ng/mL〇
[0042] 優選情況下，所述第二階段培養的實施方式包括：將所述第一階段培養的細胞培 養于第二NKT細胞培養液中，所述第二NKT細胞培養液中含有NKT細胞培養基和白介素-2 ; 進一步優選地，第二NKT細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0043] 對于MT細胞培養基沒有特別的限定，可W為本領域常用的各種用于培養MT細 胞的培養基，例如可W為GT-T551培養基。 W44] 在制備NKT細胞時，對于第一階段培養和第二階段培養的條件沒有特別的限定， 可W為本領域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養箱中進 行培養。本領域技術人員可W對培養的時間進行適應性調整，此為本領域技術人員所公知， 在此不再寶述。 W45] 本發明制備得到的NKT細胞中，CD3+細胞平均比率〉90%，CD3 +CD8+細胞占總CD3 + 細胞的平均比率〉7〇%仰3+〔056+細胞占總〔03+細胞的平均比率〉15%。
[0046] 對于感染NKT細胞的方法沒有特別限定，可W為本領域常用的各種方法，優選情 況下，該方法包括：
[0047] (1)在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培 養；
[0048] (2)在CD3單克隆抗體、白介素 -2和白介素 -15存在下，將所述第一階段感染培養 的細胞進行第二階段感染培養。
[0049] 優選地，所述第一階段感染培養的實施方式包括：將NKT細胞培養于第S NKT細 胞培養液中，所述第S NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介 素-2 ;進一步優選地，第S NKT細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0050] 優選地，所述第二階段感染培養的實施方式包括：將所述第一階段感染培養的細 胞培養于所述第一 NKT細胞培養液中。第一 NKT細胞培養液的具體組成可參見前述相應內 容，在此不再寶述。
[0051] 在感染NKT細胞時，對于第一階段感染培養和第二階段感染培養的條件沒有特別 的限定，可W為本領域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養 箱中進行培養。本領域技術人員可W對培養的時間進行適應性調整，此為本領域技術人員 所公知，在此不再寶述。
[0052] 具體地，感染NKT細胞的方法包括：取IX IO7-SX IO7個NKT細胞，棄掉舊的培養 液，加入2-4血新鮮GT-l'SSl培養液，再加入200-400 y L病毒濃縮液、2-4 y L 1 X 10 Smg/ 血魚精蛋白和終濃度為300-70011/血的比-2，置于30-37°(：、飽和濕度為3-6%的〇)2培養 箱中感染12-1化后，棄培養液，將細胞轉至未包被的培養瓶中，加入20-50mL的GT-T551培 養基，再加入終濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-7化g/ml的CD3單克隆抗體和終 濃度為30-7化g/mL的白細胞介素15,于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養箱中培養 12-1她，獲得嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞。
[0053] 進一步優選地，感染NKT細胞的方法還包括：
[0054] (3)先在白介素 -2存在下，將所述第二階段感染培養的細胞進行體外誘導，待細 胞的密度為80-90%時，再在CD3單克隆抗體、白介素 -2和白介素 -15存在下，將細胞進行 擴增培養。
[0055] 優選情況下，所述體外誘導的實施方式包括：將所述第二階段感染培養的細胞培 養于所述第二NKT細胞培養液中，所述擴增培養的實施方式包括：將細胞培養于所述第一 NKT細胞培養液中。第一 NKT細胞培養液和第二NKT細胞培養液的具體組成可參見前述相 應內容，在此不再寶述。
[0056] 具體地，感染NKT細胞的方法還包括：將第二階段感染培養后獲得的慢病毒感染 的NKT細胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養液進行體外誘導，待細胞的密 度為80-90%時將細胞轉入細胞培養袋中，隔1.5-2.5天加入比-2的終濃度為300-70011/ mL、CD3單克隆抗體的終濃度為30-7化g/ml、白細胞介素-15的終濃度為30-7化g/mL的 新鮮GT-T551培養液進行擴增培養并將細胞擴增至總量為1 X 109-2X IO9個細胞。經過 本發明的慢病毒對祀向CD138抗原的嵌合抗原受體進行NKT細胞感染，其感染效率高達 30% -60%，而獲得的CAR138-NKT細胞，其CD3+CD56+細胞占總CD3 +細胞的比率在15% W 上。
[0057] 嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞表達的嵌合抗原受體 的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領域技術人員應該理解的是，嵌合抗原受 體前體蛋白由大鼠生長激素信號膚、CD138ScFv、CD8的hinge區和跨膜區、CD137的胞內信 號結構域和CD3 C的胞內信號結構域串聯構成，蛋白質翻譯后在細胞內粗面型內質網切除 信號膚后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于MT細胞的細胞膜上。該嵌合 抗原受體的蛋白氨基酸序列對應的基因編碼序列如SEQID NO. 2所示。該嵌合抗原受體W 基因CD8的hinge區和跨膜區及CD137和CD3 C的胞內信號結構域串聯而成的結構為信號 傳導結構域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對應的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0058] 本發明還提供了上述方法制備得到的工程化CD138祀向性的NKT細胞。
[0059] 本發明還提供了工程化CD138祀向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的 應用。優選情況下，腫瘤是CD138陽性的腫瘤，進一步優選地，所述腫瘤為CD138陽性的多 發性骨髓瘤。
[0060] 本發明的應用中，對于用于治療CD138陽性的腫瘤的制劑的組成沒有特別的限 定，只要含有本發明所述CARl38-NKT細胞或是由CARl38-NKT細胞制備而成即可，制劑的具 體組成和制備方法為本領域技術人員所公知，在此不再寶述。 W61] 實施例
[0062] W下的實施例將對本發明作進一步的說明，但并不因此限制本發明。
[0063] W下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規方法。下述實施例中所 用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到，其中：
[0064] NKT細胞培養基GT-T551購自TaKaRa公司。 陽0化]淋己細胞分離液購自T抓公司。
[0066] CD3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購自TaKaRa公司。
[0067] 重組人蛋白干擾素 -丫、重組人白介素 2、重組人白介素 15均購自protech公司。 W側總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（Prkn茲1沒聯?服DNA Polymerase)、T4 DNA 連接酶購自 TaKaRa 公司。
[0069] Reve;rtAid?First Strand cDNA Synthesis Kit 購自 F'ermentas 公司。
[0070] Bgl II、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V購自 F'ermentas 公司。
[0071] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、質粒小提試劑盒均購自天 根生化科技有限公司。
[0072] pWP化-GFP、PSPAX2、pMD2. G 均購自 Addgene 公司。
[007引 pGSI購自北京天一輝遠生物科技有限公司。
[0074] Transl-Tl Phage Resistant化學感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公 司。
[00"75] Lipofectamine?2000 Transfection Reagent 轉染試劑購自 Invitrogen 公司。 陽076] 293T包裝細胞購自美國ATCC。
[0077] 陽Geooo-NaCl中陽G6000終濃度為25. 5質量％，化Cl終濃度為1. 2M，PEG6000和 化Cl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。 陽07引胎牛血清購自德國PAA公司。 陽0巧]骨髓瘤細胞系A266購自美國ATCC。
[0080] 5-簇基巧光素班巧酷亞胺醋購自上海譜振生物科技有限公司。
[0081] 膜聯蛋白V-R陽試劑盒購自美國抓公司。
[0082] 所有引物均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。 陽08引實施例1NKT細胞的制備
[0084] (I)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋己細胞分離液，通過密度梯度離屯、方 法分離獲得單個核細胞（PBMCs)。 陽0化]似PBMCs洗S次后，采用含有0. 6體積％的人自體血清的NKT細胞培養基 GT-巧51調整細胞終濃度為2 X IO6個細胞/mL ;將細胞接種于預先經過終濃度為10 y g/mL 的retronectin包被的75cm2細胞培養瓶中。然后在培養基里加入終濃度為500U/mL的重 組人白介素2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素-15,在37°C、飽和濕度 為5 %的C〇2培養箱中培養。
[0086] (3)培養第4天，將細胞轉移至未包被的培養瓶中，每2天按照細胞生長數量加入 NKT細胞培養基GT-T551，控制細胞濃度為1 X IO8個細胞/mU并加入終濃度為500U/ml的 重組人白介素2 ;培養至第12天，得到NKT細胞，流式細胞術對NKT細胞表型進行分析。結 果見圖 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3+CD8+:90. 99% ;CD3+CD56+:24. 12% ;CD8+CD56+:24. 63%。
[0087] 實施例2慢病毒表達載體pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的構建
[0088] (1) NKT 細胞 cDNA 的制備
[0089] 離屯、沉淀實施例1培養得到的NKT細胞，用總RNA提取試劑盒RNAisoReagent提 取細胞的總RNA，-80°C保存備用。提取的總RNA用逆轉錄試劑盒RevedAid?First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄得MT細胞cDNA，-20°C保存備用。
[0090] (2)慢病毒質粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的制備
[0091] 設計并合成如下引物序列（其中，下劃線標記為保護堿基，方框為酶切位點）： [00921
陽09引 W步驟（1)中NKT細胞CDNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR擴增，得到長28化P 的CD8的hinge區和跨膜區，核巧酸序列如SEQIDN0. 3所示，兩端分別含有MluI和Bgl II酶 切位點和保護堿基；用引物P3和P4進行PCR擴增，得到長146bp的CD137胞內信號結構域， 核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點及保護堿基；用引 物P5和P6進行PCR擴增，得到長359bp的CD3 C的胞內信號結構域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，兩端分別含有EcoRI和NdeI酶切位點及保護堿基。各步PCR擴增反應體系相 同，W擴增CD137胞內信號結構域為例，進行PCR擴增，PCR反應條件參照PnmeSTAR'" 服DNA Polymerase的說明書，反應體系巧O JiL)如下：
[0094]雙蒸水：32. 5 Ul 陽0巧]5 X 反應 buf f er : 10 y L
[0096] dNTP 混合物（每種 2. 5mM) :4 y L
[0097] P3 (IOmM)=Iy L
[0098] P4 (IOmM) : 1 y L
[0099] NKT 細胞 cDNA (200ng/ul) : 1 y L 陽 100] Pii貓eSTA民I' HS DNA Polymerase :0. SyL 陽101] 將上述PCR產物用1 %的瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進 行DNA片段回收。得到片段后分別進行雙酶切反應，酶切產物用普通DNA產物純化試劑盒 回收備用。
[0102] 慢病毒表達載體pWP化-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產物經1 %的瓊脂糖凝膠進 行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、 CD3 C片段通過T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化化ansl-Tl Phage Resistant化學感受 態細胞，37°C培養1化后挑取單克隆，37°C，250巧m培養1化后用質粒小提試劑盒提取質 粒。提取的質粒經限制性內切酶MluI和NdeI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2,其中，Ml : DNA分子量標記D15000 ;1泳道：質粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段；2泳道：質粒 pWP化-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（75化P) ;M2 :DNA分子量標記D2000。將鑒定正確的質 粒送北京天一輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結果正確的 重組質粒命名為pWP化-CD8-CD137-CD3C，其中，CD8的hinge區和跨膜區的核巧酸序列如 SEQID NO. 3所示，CD137的胞內信號結構域的核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，CD3 C的胞 內信號結構域的核巧酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0103] (3)慢病毒質粒 pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C 的制備
[0104] 全基因合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD138ScFv融合基因的核巧酸序列， 序列如SEQID NO. 8所示，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，其5'端含有BamHI、 kozak序列，3'端含有MluI酶切位點，將前述融合基因克隆在質粒pGSI中，命名為 pGSI-CD138ScFv。質粒經BamHI/MluI雙酶切，酶切產物經1 %瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段備用。 陽105] pWP)(L-CD8-CD137-CD3 C質粒經限制性內切酶BamHI/MluI酶切，酶切產物經1 % 瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含 有大鼠生長激素信號膚和CD138ScFv的DNA片段通過T4 DNA連接酶進行連接，具體方法見 說明書。將連接產物轉化化ansl-Tl Phage Resistant化學感受態細胞，37°C培養1化后 挑取單克隆，37°C，250rpm培養1化后，用質粒小提試劑盒提取質粒。提取的質粒經限制性 內切酶BamHI/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結果如圖3所示，其中，Ml :DNA分子量標記D15000 ; 1泳道：質粒pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段（1122化P) ;2泳道：質粒 pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3C 的酶切片段（1552bp) ; ;M2:DNA 分子量標記 D2000。 將鑒定正確的質粒送北京天一輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將 測序結果正確的重組質粒命名為pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C，其結構示意圖如圖 4所示，其中包括大鼠生長激素信號膚（核巧酸序列如SEQID NO. 6所示）、抗CD138單鏈 抗體（核巧酸序列如SEQID NO. 7所示）、CD8的hinge區和跨膜區及CD137的胞內信號結 構域和CD3 C的胞內信號結構域，其中，該嵌合抗原受體W基因CD8的hinge區和跨膜區 及CD137和CD3 C的胞內信號結構域串聯而成的結構為信號傳導結構域，其氨基酸序列如 SEQID NO. 9所示，對應的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。
[0106] 實施例3嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞的制備 陽107] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0108] 用分光光度計分別測定慢病毒表達質粒pWP化-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C 和輔助質粒PSPAX2、PMD2.G的濃度，S種質粒W 4:2:1的質量比用 Lipofectamine?2000Transfection Reagent轉染試劑共轉染293T包裝細胞。分別在轉染 4化、7化時收集病毒上清于50血EP管中，4°C，2000g離屯、lOmin，轉移兩次得到的上清至新 EP管中，用4. 5 ym濾器過濾病毒上清進濾的病毒上清與5XPEG6000-NaCl按照4:1的體 積比混勻，4°C靜置化，然后4°C，1000 Og離屯、20min，棄上清，沉淀用1血的4°C預冷的無菌 PBS溶解，即得嵌合抗原受體的病毒濃縮液，按每管100 y L進行分裝，-80°C保存備用。
[0109] 按照上述方法，利用慢病毒表達質粒pWP化-GFP和輔助質粒PSPAX2、pMD2. G共轉 染293T包裝細胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0110] (2)慢病毒感染NKT細胞及感染后細胞的擴增培養 陽11U 取實施例1的在75cm2培養瓶中培養的IX 10 7個NKT細胞，棄掉舊的培養液，加入 2血新鮮NKT細胞培養基GT-T551、200 y L步驟（1)得到的病毒濃縮液、2 y L 1 X 10 6mg/mL 魚精蛋白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5 %的C〇2培養箱中 感染12小時后，棄培養液。同時用表達GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液對NKT細胞進行 同步感染（得到的NKT細胞稱為CART-GFP細胞），用于計算該病毒的感染效率。將感染后 的細胞轉至未經CD3和retronectin包被的75cm2培養瓶中，加入20血的NKT細胞培養基 GT-T551，再加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的CD3單克隆抗體 和終濃度為50ng/mL的重組人白介素15,于37°C、飽和濕度為5%的C〇2培養箱中培養1她， 得到的NKT細胞稱為CAR138-NKT細胞。用相同的方法制備CAR138-T細胞燈細胞的制備 方'法參貝胥文南犬：Yajin邑 Zhan邑，et al. Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal Cell Carcinoma after Radical Nephrectomy. Clinical Study, 2013 中 2. 4 部分CIK細胞的制備方法）。用流式細胞術檢測該病毒的感染效率，結果如圖5所示， CAR138-NKT細胞的感染效率為46. 75 %。 陽11引 （3)體外誘導擴增CAR138-NKT細胞群
[0113] 將上述培養后的NKT細胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細胞培 養基GT-T551進行體外誘導，待細胞的密度為85%時將細胞轉入細胞培養袋中，隔2天加 入重組人白介素2的終濃度為500U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介 素15的終濃度為50ng/mL的新鮮NKT細胞培養基GT-T551進行擴增培養，待細胞擴增到總 量為1. 5 X 1〇9個細胞左右后，采用流式細胞儀對感染的細胞群體進行鑒定，細胞表型一般 達到CD3陽性細胞比例> 90% ;CD3CD8雙陽性細胞比例〉70% ;CD3CD56雙陽性細胞比例 〉15%，結果見圖 6，CD3+:93. 94% ;CD3+CD4+:6. 44% ;CD3+CD8+:86. 65% ;CD3+CD56+:61. 49% ; CD8+CD56+:55. 62%。
[0114] 實施例4 CAR138-NKT細胞對骨髓瘤細胞殺傷作用的細胞毒性分析
[0115] 分別取實施例3中制備的CAR138-NKT細胞、CAR138-T細胞和實施例1中培養的 NKT細胞接種于96孔板，用5-簇基巧光素班巧酷亞胺醋（WS巧進行染色，與骨髓瘤細胞 系A266 W效祀比（殺傷細胞：祀細胞）5:1,10:1，20:1,40:1的比率進行共培養，經過24小 時的共培養后，將細胞用膜聯蛋白V-RPE試劑盒染色，同時設置對照組分別為未加入免疫 細胞殺傷處理的骨髓瘤細胞系A266,并將細胞用膜聯蛋白V-RPE試劑盒染色。流式細胞 術對細胞調亡進行檢測，細胞調亡的量根據下面的公式計算：調亡率=(對照-樣品）/對 照X100%，對照為未加免疫細胞殺傷處理的細胞存活數目；樣品為加入相對應的效祀比 (殺傷細胞：祀細胞）的免疫細胞殺傷處理的細胞存活數目，見圖7。由圖7可知，嵌合抗 原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞對骨髓瘤細胞具有特異殺傷活性，且 CARl38-NKT細胞的特異殺傷活性明顯優于CARl38-T細胞和NKT細胞。
[0116] W上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中 的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可W對本發明的技術方案進行多種簡單變型，運 些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0117] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛 盾的情況下，可W通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0118] 此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可W進行任意組合，只要其不違背本 發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【主權項】
1. 一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，包括串聯的大鼠生長激素信號肽、CD138ScFv、CD8的鉸鏈區 和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3 ζ的胞內信號結構域；優選地，所述嵌合抗原受 體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，進一步優選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。2. 編碼權利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優選地，所述基因具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，進一步優選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. 含有權利要求2所述的基因的重組表達載體，優選地，所述重組表達載體為慢病毒 表達載體，進一步優選地，所述慢病毒表達載體為pWPXL-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。4. 一種工程化CD138靶向性的NKT細胞，其特征在于，所述NKT細胞是由權利要求1所 述的嵌合抗原受體修飾的NKT細胞。5. -種工程化⑶138靶向性的NKT細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 包裝攜帶pWPXL-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到 的病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體⑶138ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。6. 根據權利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過如下方法制備NKT細胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階段 培養；優選地，所述第一階段培養的實施方式包括：將單個核細胞培養于第一 NKT細胞培養 液中，所述第一 NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介 素-15 ;進一步優選地，第一 NKT細胞培養液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/ mL ； (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養的細胞進行第二階段培養；優選地，所 述第二階段培養的實施方式包括：將所述第一階段培養的細胞培養于第二NKT細胞培養液 中，所述第二NKT細胞培養液中含有NKT細胞培養基和白介素-2 ;進一步優選地，第二NKT 細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。7. 根據權利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培養； 優選地，所述第一階段感染培養的實施方式包括：將NKT細胞培養于第三NKT細胞培養液 中，所述第三NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2 ;進 一步優選地，第三NKT細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL ; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養的細 胞進行第二階段感染培養；優選地，所述第二階段感染培養的實施方式包括：將所述第一 階段感染培養的細胞培養于所述第一 NKT細胞培養液中。8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養的細胞進行體外誘導，待細胞的 密度為80-90%時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行擴增 培養；優選地，所述體外誘導的實施方式包括：將所述第二階段感染培養的細胞培養于所 述第二NKT細胞培養液中，所述擴增培養的實施方式包括：將細胞培養于所述第一 NKT細胞 培養液中。9. 權利要求5-8中任意一項所述方法制備得到的工程化CD138靶向性的NKT細胞。10. 權利要求4或9所述的工程化CD138靶向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤的制 劑中的應用，優選地，所述腫瘤是CD138陽性的腫瘤，進一步優選地，所述腫瘤為CD138陽性 的多發性骨髓瘤。
【文檔編號】C12N5/10GK105924529SQ201510671753
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年10月13日
【發明人】韓為東, 伍志強, 代漢仁, 王瑤, 王曉慧, 劉洋
【申請人】中國人民解放軍總醫院