一種緊密連接免疫原多肽及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種緊密連接免疫原多肽，屬于抗癌疫苗領域；一種緊密連接免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列為SEQ ID NO：1，增強T細胞免疫應答。該氨基酸序列為全新的序列，采用化學合成所述的多肽；本發明的緊密連接免疫原多肽用于卵巢癌腫瘤免疫細胞技術中的免疫原，增強T細胞免疫應答。本發明的有益效果在于為全新的序列，可用于卵巢癌腫瘤免疫細胞技術中的免疫原，能（1）促進T細胞，（2）促進CD8+免疫應答，（3）能與T細胞表面的MHC有效的特異性結合，（4）在荷瘤小鼠體內，能抑制卵巢癌腫瘤的生長。
【專利說明】
-種緊密連接免疫原多化及其應用
技術領域
[0001] 本發明是有關抗癌疫苗領域。具體來說，本發明設及用作抗癌疫苗的緊密連接免 疫原的優化多膚，增強T細胞免疫應答。
【背景技術】
[0002] 卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子 宮體癌而列居第=位。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位。卵巢惡性腫瘤中W 上皮癌最多見。目前，卵巢惡性腫瘤因病理類型不同而治療方案不同，多用手術治療聯合化 療等綜合治療。但對于中、晚期的患者，療效欠佳。
[0003] 腫瘤細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免 疫抗癌的新型治療方法。它是運用生物技術和生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞進行 體外培養和擴增后回輸到病人體內的方法，來激發或增強機體自身免疫功能，從而達到治 療腫瘤的目的。腫瘤細胞免疫療法是繼手術、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術。
[0004] Claudin-4蛋白是細胞間緊密連接的骨架蛋白。研究發現，claudin-4在原發性卵 巢癌中呈顯著高表達，其升高的程度與卵巢癌組織分級和臨床分期呈正相關。Claudin-4在 卵巢上皮性癌和黏液性囊腺癌等主要的卵巢癌中表達均上調，但在正常卵巢細胞和卵巢囊 腺瘤中無過表達，表明它的表達與惡性腫瘤相關，并且它的高表達與腫瘤惡性程度呈正相 關。claudin-4是惡性卵巢癌的標記物，可W作為腫瘤疫苗的特異性免疫原。然而，claudin- 4由209個氨基酸殘基組成，分子量較大，較難得到純度高的claudin-4。運樣，不僅會給后期 的特異性T細胞免疫帶來困難，而且會導致患者的自身免疫。因此，本發明提供了一種特異 性強，純度較高的小分子多膚作為免疫原。
【發明內容】
[0005] 發明目的
[0006] 本發明提供一種緊密連接免疫原多膚，可用于腫瘤細胞免疫的免疫原，增強T細胞 免疫應答，具有分子量小、特異性免疫原性強的特點。
[0007] 技術方案
[000引本發明的技術方案在于提供一種緊密連接免疫原多膚，序列為MASM化MMVTG GWAASG化LLGG化化CNCPPRTDKPYSAKYYYSAASSAAASNKK(SEQ ID NO: 1)。采用化學合成所述的 多膚。本發明的緊密連接免疫原多膚用于卵巢癌腫瘤免疫細胞技術中的免疫原，能增強T細 胞免疫應答。
[0009] 有益效果
[0010] 本發明的緊密連接免疫原多膚，為全新的序列，為Claudin-4的類似多膚，可用于 卵巢癌腫瘤免疫細胞技術中的免疫原。有益效果在于（1)促進T細胞，（2)促進CD8+免疫應 答，（3)能與T細胞表面的MHC有效的特異性結合，（4)在荷瘤小鼠體內，能抑制卵巢癌腫瘤的 生長。
【具體實施方式】 [00川實施例1
[0012]采用化學合成方法合成多膚：多膚用化OC化學方法合成。合成反應從C端向N端進 行，Rink介質（可在Advanced化enfTech公司購得)上有自由氨基，按C端向N端的順序將各個 氨基酸連接。每一步連接過程中，氨基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍于介質上自由 氨基的皿TU，冊化，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的連接反應之后，都用一個化晚/醋酸/ N-甲基咪挫的混合物來封閉未連接的自由氨基。每次氨基酸的連接反應之后，下一個氨基 酸連接之前，都要把介質上的化OC-基團去掉，去Fmoc-基團使用含20 %贓晚的二甲基甲酯 胺。最后，當所有氨基酸殘基順序連接之后，多膚用98%=氣乙酸從介質上切割下來。應用 上述化學條件可合成并獲得多膚，純度大于95%，序列為 MASMGLMMVTGGWAAS化化LGGG1XLCNCPPRTDKPYSAKYYYSAA SSAAASNKK，該序列為可用于腫瘤 細胞免疫的免疫原。
[001引實施例2
[0014] 用腫瘤模型檢測緊密連接免疫原多膚的體內活力。
[0015] 6-8齡雌性巧7BL/6小鼠，小鼠隨機分成4組，每組10只。（1)空白組；（2)實施例1免 疫原多膚低劑量組；（3)實施例1免疫原多膚中劑量組；（4)實施例1免疫原多膚高劑量組。建 立卵巢癌腫瘤模型，在接種卵巢癌腫瘤細胞后的第3、5、7天，分別進行免疫。方案為:空白組 加入相同體積的溶劑，實驗組實施例1多膚(上海生工吉爾合成)設3個劑量:5、10、20mg/Kg， 在腫瘤周圍多點注射。28天后，觀察小鼠存活數量，計算存活率。結果顯示，緊密連接免疫原 多膚可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，（1)空白組；（2)實施例1免疫原多膚低 劑量組；（3)實施例1免疫原多膚中劑量組；（4)實施例1免疫原多膚高劑量組依次的存活率 依次為25.2% ,74.1% ,77.3% ,82.6%。
[0016] 實施例5
[0017] 應用競爭性受體-配體親和法測試多膚與MHC的結合能力：將實施例1得到的多膚 與HLA各型的結合能力由競爭性受體-配體親和法判斷。將固定濃度為50WHO1/L的標記I25I 的MH邱良制性多膚W及不同濃度（1-50皿ol/L)的MHC試劑盒(所述的MHC試劑盒為HLA試劑 盒，購自購自上海泛柯生物科技有限公司），在反應體系中形成兩種復合物，即待測多膚MHC 復合物和I25I標記多膚復合物。待測多膚與I25I標記多膚競爭與MHC的結合。用超過濾(產品 型號Microcon 30，Amicon公司）分離游離多膚和多膚MHC復合物，然后測定多膚MHC復合物 的I25I放射量，將此放射量與沒有競爭性抑制的多膚MHC復合物(沒有加待測多膚的樣本)的 放射量比較，求待測多膚在抑制50%標記多膚與MHC結合時的濃度，即I巧0。由此得到，實施 例1得到的多膚對HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分別為《1 OiiM定為3.89、4.22、1.53、7、 32和3.22皿ol/L，均符合陽性多膚的標準。因此，實施例1得到的多膚為具有有效結合能力 的免疫原多膚。
[001引實施例6
[0019] T淋己細胞的增殖作用:無菌取小鼠脾臟，1640培養基清洗3次，5ml注射器忍研磨， 200目篩網過濾，制成單細胞懸液，離屯、（100化/min，5min)，棄上清，化iS-NH4化破解紅細 胞，冰水浴靜置3-5min，離屯、（100化/min，5min)，棄上清，用無菌冷PBS洗涂細胞兩次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培養液（5ml)懸浮細胞，細胞計數，調整細胞濃度為5*106 個/ml，于96孔培養板中培養。
[0020]實驗設空白對照組、模型組(刀豆蛋白A)、實施例1得到的多膚各劑量(5、10、20mg/ ml)組。各組分別加入脾臟淋己細胞懸液I(K)山/孔后，空白對照組加入1640培養液I(K)山，模 型組加入ConA(終濃度為扣g/ml)，實施例1得到的多膚各劑量組在加入不同濃度的多膚基 礎上加 ConA(終濃度為化g/ml)。37 °C細胞培養箱靜止培養4她，培養結束后每孔加入 MTT，繼續培養4h，最后棄掉每孔所有溶液，每孔加入10化IDMSO，震蕩，用酶標儀檢測570nm 處OD值，每孔設5個平行。增殖率公式：增值率（％ ) = (OD樣品組-OD模型組）/0D樣品組* 100%;
[0021 ]表1實施例1得到的多膚對T淋己細胞的增殖作用
[0022]
[0023] 沖<0.05，*沖<0.0 l與模型組相比。
[0024] 實驗結果見表1，與模型組比較，實施例1得到的多膚能促進小鼠脾臟淋己細胞的 增殖，在劑量為5~20mg/ml的范圍呈現很好的劑量依賴關系，W20mg/ml的增殖率最高，為 53.51%。
[0025] 實施例7
[0026] 緊密連接免疫原多膚的免疫原性測定:采用流式細胞技術測定免疫原多膚對CD8+ T細胞的影響。6-8齡雌性C57BL/6小鼠，小鼠隨機分成4組，每組10只。（1)空白組；（2)實施例 1免疫原多膚低劑量組；（3)實施例1免疫原多膚中劑量組；（4)實施例1免疫原多膚高劑量 組。在試驗的第〇、7、14天，分別進行免疫。方案為:空白組加入相同體積的溶劑，實驗組實施 例1多膚(上海吉爾合成)設3個劑量:5、10、20111旨/蛇，在小鼠背部淋己結附近多點注射。30天 后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，將血離屯、后取血細胞層，用紅細胞裂解液破解紅細胞，洗去 裂解的紅細胞，再用巧光標記的單克隆抗CD8+-FITC解育、固定后，進行流式細胞技術測定， 評價免疫原多膚對CD8巧細胞的影響。
[0027] 表2實施例1得到的多膚對CD8巧淋己細胞的作用 [002引
[00巧]沖<0.05，*沖<0.0 l與模型組相比。
[0030]實驗結果見表2,與空白組比較，實施例1得到的多膚能促進小鼠 CD8巧淋己細胞， 在劑量為5~20mg/Kg的范圍呈現很好的劑量依賴關系，W20mg/Kg的增殖率最高，為 56.82%。
【主權項】
1. 一種緊密連接免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列為SEQ ID NO: 1。2. 根據權利要求1所述的多肽在制備治療卵巢癌腫瘤藥物中的應用。3. 根據權利要求2所述的多肽，其特征在于:采用卵巢癌腫瘤免疫細胞技術中，增強T細 胞免疫應答。
【文檔編號】A61P35/00GK105924513SQ201610438527
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月19日
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司