一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽，其命名為Kp?SP，來源于庫克氏菌(Kocuria sp.3?3)菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。本發明還公開了該信號肽在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶或纖維素酶中的應用，本發明的信號肽不僅在常用的表達載體中具有將外源蛋白分泌到胞外的能力，使蛋白表達量增高，酶活明顯提高，并切在組成型表達載體pBSPPc中也具有外源蛋白分泌到胞外的能力，為生產高活性分泌蛋白提供了一條有效途徑。作為一種基礎的基因工程技術，本發明為生產工業蛋白提供了有利的條件，增強了蛋白的表達量及酶活，降低了分離成本，在蛋白質工業生產方面具有很大的應用前景。
【專利說明】
-種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號化及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及基因工程技術領域，具體設及一種使胞內蛋白表達至胞外的信號膚及 其在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶、及纖維素酶中的應用。
【背景技術】
[0002] 基因表達是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯， 轉變成具有生物活性的蛋白質分子;基因工程技術中的外源蛋白的表達是指將獲得的外源 基因片段通過載體重組到一個新的基因表達宿主中，使其能大量生產具有生物活性的蛋白 產物，是當今分子生物學領域應用最廣泛的技術手段之一。隨著生物工業生產工藝的發展， 人們對高純度、高產量和高穩定性的重組功能蛋白的需求日益增長，運使得外源蛋白表達 技術成為基因工程、生物生產和應用的重要內容。
[0003] 信號膚是引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短(長度5-30個氨基酸)膚鏈;常 指新合成多膚鏈中用于指導蛋白質的跨膜轉移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有時不一定 在N端）。在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區域，該氨基酸序列就被稱 為信號膚序列，它負責把蛋白質引導到細胞含不同膜結構的亞細胞器內。外源蛋白在宿主 菌，如大腸桿菌中的表達形式多為細胞內不溶性表達(包涵體），少數為細胞外分泌表達。利 用信號膚來引導外源蛋白定位分泌到細胞特定區間，提高可溶性，可避免因包涵體復性帶 來的困難。研究表明，多種外源基因連接上信號膚后，在原核表達系統，如大腸桿菌、L型細 菌、芽抱桿菌和乳酸桿菌中等都得到了分泌表達;信號膚也廣泛應用于真核表達系統如畢 赤酵母和昆蟲桿狀病毒表達系統中。
[0004] 目前大腸桿菌中異源表達所用信號膚一般為來源于大腸桿菌自身或者芽抱桿菌， 但大多在高效分泌表達中存在通用性不強的缺陷，導致選擇前需要開展大量的信號膚篩選 工作。本專利設及的信號膚來自于放線菌，根據檢索，目前利用放線菌庫克氏菌來源的信號 膚進行大腸桿菌重組分泌表達未見報道。
【發明內容】
[0005] 針對當前研究現狀，本發明要解決的問題是提供一種使胞內蛋白表達至胞外的放 線菌信號膚及其應用。
[0006] 本發明所述的使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號膚，其特征是:所述信號膚命 名為Kp-SP,來源于庫克氏菌化ocuria SP.3-3)菌株，其核巧酸序列長度為90bp，如SEQ ID No. 1所示;氨基酸序列長度為29aa，如SEQ ID No.7所示。
[0007] 本發明所述使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號膚在利用構建的重組大腸桿菌 表達淀粉酶或纖維素酶中的應用。
[000引其中：上述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名為FSA，來源于Sinomicrobium Pectinilyticus加 NSOOl，長度1359bp，其核巧酸序列如沈Q ID No.2所示，氨基酸序列長 度為452aa，如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594，命名為化A，來源于Bacillus Iicheniformis DSM13,長度1455bp，其核巧酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列長度為 484aa，如SEQ ID No.9所示；上述纖維素酶0RF3883,命名為CCC，來源于Clostridium cellulosi CS-4-4(Zhang et al.Synergism of Glycoside Hydrolase secretomes from two Thermophilic bacteria cocultivated on Iignocellulose.Appl Environ Microbiol (2014)80:2592-2601.)，長度2100bp，其核巧酸序列如沈Q ID No. 4所示，氨基酸 序列長度為699aa，如SEQ ID No. 10所示。
[0009] 上述使胞內蛋白表達至胞外的信號膚在利用構建的重組大腸桿菌表達淀粉酶或 纖維素酶中的應用中，所述重組大腸桿菌的構建方法是：
[0010] (1)根據NCBI數據庫所提供KC441955.1、AAU39594、0RF3883所述的核巧酸序列設 計引物；
[00川其中，淀粉酶KC44 1955. 1與信號膚Kp-SP重組所用引物為：SFSA-Fl : GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-Rl:GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC;SFSA-F2: GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通過 S步PC時尋信號膚Kp-SP序列與KC441955.1序列連接，所得重組基因片段命名為SFSA;
[001^ 淀粉酶AAU39594與信號膚Kp-SP重組所用引物為：SBLA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC,SBLA-Rl：CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG,SBLA-F2： GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通過 S 步 PC時尋信號膚Kp-SP序列與AAU39594序列連接，所得重組基因片段命名為SBLA;
[001引纖維素酶0RF3883與信號膚Kp-SP重組所用引物為：SCCC-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl:CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2: GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通過 S 步 PCR 將信號膚Kp-SP序列與0RF3883序列連接，所得重組基因片段命名為SCCC;
[0014] 其中：所述KC441955.1的核巧酸序列如沈Q ID齡.2所示，441139594的核巧酸序列 如沈Q ID No.3所示，0RF3883的核巧酸序列如沈Q ID No.4所示；
[0015] 對照組為一步PCR獲得的不加信號膚Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或0RF3883所 示的基因片段；
[0016] (2)將（1)中得到的S組重組基因片段和對照組基因片段分別與載體pET-Duet或 pBSP 化連接，構建獲得重組質粒 SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc 或 SBLA-pET-Duet、SBLA- pBSP化或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，將所述重組質粒分別轉入感受態大腸桿菌化21 (DE3)中，獲得的重組菌株通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證確認;對照組為FSA-pET-Duet、 FSA-pBSPPc 或 BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc 或 CCC-祀 T-Duet、CCC-地 SP 化重組質粒轉入感受 態大腸桿菌化21 (DE3)中，通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證；
[0017] (3)將(2)中得到的W祀T-Duet為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分另臘 于LB搖管中，培養8-化，再W體積比1 %的接種量轉接于100mL LB搖瓶中，37°C搖床培養，待 ODsoonm= 0.4-0.6時，按體積比加入1%。的口PG，其中，產淀粉酶FSA及SFSA的重組菌株放入20 °C搖床過夜培養，產淀粉酶化A及SBLA的重組菌株于37°C繼續培養4h，產纖維素酶CCC及 SCCC的重組菌株于37°C繼續培養4h，所獲菌液離屯、保留上清，即得到含有淀粉酶或纖維素 酶的發酵液；
[001引同樣，將(2)中得到的W地SP化為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分別接 于LB搖管中，培養8-化，再W體積比1%的接種量轉接于100mL LB搖瓶中，其中，產淀粉酶 FSA及SFSA的重組菌株直接20°C過夜培養，產淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株直接37°C過夜培 養，產纖維素酶CCC及SCCC的重組菌株直接37°C過夜培養，所獲菌液離屯、保留上清，即得到 含有淀粉酶或纖維素酶的發酵液。
[0019] 本發明公開了一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號膚及其應用。通過利用來 源于放線菌的一種高通用性信號膚構建了帶有信號膚的淀粉酶和纖維素酶，通過信號膚分 別與誘導型表達載體祀T-Duet及組成型表達載體地SP化融合，獲得了高效的大腸桿菌誘導 型及組成型分泌表達系統。結果表明該信號膚的使用不僅顯著提高了胞外培養基中的目的 蛋白量及酶活，還提高了胞內目的蛋白的酶活性，沉淀中包涵體明顯減少。有效解決了異源 蛋白的包涵體形成、不溶性表達等問題。分別利用=個水解酶進行表達驗證，其中一個為稀 有密碼子含量高的古菌淀粉酶同源蛋白，結果表明該信號膚具有在大腸桿菌中表達的通用 性。因此本發明可顯著提高大腸桿菌重組蛋白的活性表達量，具有重要的應用價值。
【附圖說明】
[0020] 圖1:克隆表達載體構建圖。
[0021] 圖2:重組菌株透明圈實驗
[0022] 其中：BLA表示DSM13淀粉酶，FSA表示抓NSOOl淀粉酶，CCC表示纖維素酶。
[0023] 圖3:重組菌株的淀粉酶及纖維素酶酶活
[0024] 其中：圖中A，B，C分別表示DSM13淀粉酶各轉化子酶活，5DNS001淀粉酶各轉化子酶 活，纖維素酶各轉化子酶活。
[0025] 圖4:重組菌株樣品SDS-PAGE
[0026] 其中：1-8泳道依次為W祀T-Duet為載體不帶有信號膚轉化子的胞外樣品，W祀T- Duet為載體不帶有信號膚轉化子的胞內樣品，W祀T-Duet為載體帶有信號膚轉化子的胞外 樣品，WpET-Duet為載體帶有信號膚轉化子的胞內樣品，WpBSP化為載體不帶有信號膚轉 化子的胞外樣品，WpBSP化為載體不帶有信號膚轉化子的胞內樣品，WpBSP化為載體帶有 信號膚轉化子的胞外樣品，W地SP化為載體帶有信號膚轉化子的胞內樣品。
【具體實施方式】
[0027] 酶活測定方法:實驗酶類水解底物產生還原糖，DNS(稱3,5-二硝基水楊酸3.15g， 加水0.化，45 °C水浴，溶解后加入10.48g氨氧化鋼，攬拌至完全溶解后依次加入酒石酸鐘鋼 91g、苯酪2.5g、無水亞硫酸鋼2.5g;定容至1L，儲存于棟色瓶中避光保存7天后使用）。可與 還原糖結合產生顯色反應。
[0028] 實施例1:化學法重組菌株的構建
[0029] 感受態的制備:化學法(化Cb)法
[0030] 1%接種量接化21過夜培養物到50ml LB中；每隔15-20min測一次0D600皿，待長至 0.3-0.4時收集菌體;將培養物放置于冰上IOmin，再倒入50ml離屯、管中，4°C，450化pm，離屯、 10min(50ml離屯、管也需預冷，提前將離屯、機調至4°C);棄上清，50ml初始培養液用30ml預冷 的0.1 M MgCl2-CaCl2溶液重懸細胞沉淀;4°C，4500rpm，離屯、IOmin;棄上清，50ml初始培養液 用2ml預冷的0.1 M CaCb溶液（15%甘油)重懸細胞沉淀;5化1/管或IOOiil/管分裝，于-70°C 保藏。
[0031] 連接體系:載體化1，目的片段5.扣1，T4DNA連接酶0.扣1，T4DNA連接酶Buffer化I; 連接條件：25 °C化；將連接液加入到感受態細胞化21中，冰上30min，37 °C水浴5min，冰上 Smin;加入5(K)山LB培養基，37°C搖床培養化后涂板化B固體，加入Amp),將平板放入37°C培 養箱過夜培養;挑單菌落提質粒測序驗證，正確的菌株保藏備用。
[0032] 實施例2 :FSA及SFSA重組菌株的構建
[0033] FSA淀粉酶基因全長1359bp。根據信號膚序列設計引物，將信號膚序列與 KC441955.1所示的基因序列進行重組，獲得融合基因片段SFSA。其中：1輪PCR分別擴增上下 兩個片段，引 物為 SFSA-F1:GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-R1: GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC;SFSA-F2:GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG。兩組PCR產物分別進行切膠回收，回收產物測定濃 度，加水將上下游同源臂濃度調至基本相同；2輪PCRWl輪PCR產物為引物和模板，將兩段擴 增產物連接來，回收PCR產物;3輪PCR W 2輪PCR為模板，引物為SFSA-Fl，SFSA-R2。
[0034] 對照組為不加信號膚的FSA，利用1步PCR獲得片段F SA，引物為F SA-F : GGCGAGCTCGGATGACAATAATAATTATAC，FSA-R: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，產物 進行切膠回收。
[0035] 與祀T-Duet連接:將所獲回收片段FSA和SFSA按照如圖1所示的構建方法，用BamH I和Sal I進行雙酶切目的片段，載體祀T-Duetl同樣用BamH I和Sal I進行雙酶，目的片段 和載體經酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產物化學法轉入到感受態化2UDE3) 中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復蘇培養化后涂含 氨節青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37 °C過夜培養，挑單菌落于LB+氨節青霉素（lOOmg/L)搖 管，提質粒測序驗證構建的重組質粒，測序由深圳華大基因完成。
[0036] 與pBSP化連接:將所獲回收片段FSA和SFSA按照如圖1所示的構建方法，用BamH I 和Sal I進行雙酶切目的片段，載體pBSP化同樣用BamH I和Sal I進行雙酶，目的片段和載 體經酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產物化學法轉入到感受態化2UDE3)中，冰 上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復蘇培養化后涂含硫酸 慶大霉素(50mg/L)的LB平板，37 °C過夜培養，挑單菌落于LB+硫酸慶大霉素(50mg/L)搖管， 提質粒測序驗證構建的重組質粒，測序由深圳華大基因完成。
[0037] 實施例3 :BLA及SBLA重組菌株的構建
[0038] BLA淀粉酶基因全長1455bp。根據信號膚序列設計引物，將信號膚序列與AAU39594 所示的基因序列進行重組，獲得融合基因片段SBLA，其中，1輪PCR分別擴增上下兩個片段， F2: GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG。兩組 PCR 產物分別進行切膠回收，回收產物測定濃度，加水將上下游同源臂濃度調至基本相同；2輪 PCR W1輪PCR產物為引物和模板，將兩段擴增產物連接來，回收PCR產物;3輪PCR W2輪PCR為 模板，引物為SBLA-Fl，SBLA-R2。
[0039] 對照組為不加信號膚的B L A，利用1步P C R獲得片段F S A，引物B L A - F : GAGGATCCGATGGCGGCAAATCTTAAAGGGACG，BLA-R: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，產物 進行切膠回收。
[0040]與祀T-Duet連接:將所獲回收片段BLA和SBLA按照如圖I所示的構建方法，用BamH I和化nd III進行雙酶切目的片段，載體祀T-Duetl同樣用BamH I和化nd III進行雙酶，目 的片段和載體經酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產物化學法轉入到感受態化21 (DE3)中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復蘇培養化 后涂含氨節青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37°C過夜培養，挑單菌落于LB+氨節青霉素（lOOmg/ U搖管，提質粒測序驗證構建的重組質粒，測序由深圳華大基因完成。
[0041 ]與pBSP化連接:將所獲回收片段BLA和SBLA按照如圖1所示的構建方法，用BamH I 和化nd III進行雙酶切目的片段，載體pBSP化同樣用BamH I和化nd III進行雙酶，目的片 段和載體經酶切純化后加入T4連接酶25°C放置Ih,連接產物化學法轉入到感受態化21 (DE3)中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復蘇培養化 后涂含硫酸慶大霉素（50mg/L)的LB平板，37°C過夜培養，挑單菌落于LB+硫酸慶大霉素 (50mg/L)搖管，提質粒測序驗證構建的重組質粒，測序由深圳華大基因完成。
[0042] 實施例4: CCC及SCCC重組菌株的構建
[0043] CCC纖維素酶基因全長2100bp。根據信號膚序列設計引物，將信號膚序列與 0RF3883所示的基因序列進行重組，獲得融合基因片段SCCC，其中，1輪PCR分別擴增上下兩 個片段，引物為SCCC-Fl: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl: CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC， SCCC-F2:GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2:GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，兩 組PCR產物分別進行切膠回收，回收產物測定濃度，加水將上下游同源臂濃度調至基本相 同；2輪PCR W1輪PCR產物為引物和模板，將兩段擴增產物連接來，回收PCR產物;3輪PCR W 2 輪PCR為模板，引物為SCCC-Fl，SCCC-R2。
[0044] 對照組為不加信號膚的CCC，利用1步PCR(引物CCC-F: GAGGATCCGGTAAGCGGCCCAGG， CCC-R: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC)獲得片段 CCC，產物進行切膠回收。
[0045] 與祀T-Duet連接:將所獲回收片段CCC和SCCC按照如圖1所示的構建方法，用BamH I和Sal I進行雙酶切目的片段，載體祀T-Duetl同樣用BamH I和Sal I進行雙酶，目的片段 和載體經酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產物化學法轉入到感受態化2UDE3) 中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復蘇培養化后涂含 氨節青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37 °C過夜培養，挑單菌落于LB+氨節青霉素（lOOmg/L)搖 管，提質粒測序驗證構建的重組質粒，測序由深圳華大基因完成。
[0046] 與pBSP化連接:將所獲回收片段CCC和SCCC按照如圖1所示的構建方法，用BamH I 和Sal I進行雙酶切目的片段，載體pBSP化同樣用BamH I和Sal I進行雙酶，目的片段和載 體經酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產物化學法轉入到感受態化2UDE3)中，冰 上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復蘇培養化后涂含硫酸 慶大霉素(50mg/L)的LB平板，37 °C過夜培養，挑單菌落于LB+硫酸慶大霉素(50mg/L)搖管， 提質粒測序驗證構建的重組質粒，測序由深圳華大基因完成。
[0047] 實施例5:透明圈實驗
[004引淀粉酶重組菌株WpET-Duet為載體的點在LB+lg/L淀粉平板，WpBSP化為載體的 點在BSM+lg/L淀粉平板;纖維素酶重組菌株W祀T-Duet為載體的點在LB+lg/LCMC平板，W 地SP化為載體的點在BSM+lg/LCMC平板，37 °C培養兩天。淀粉平板用盧戈式艦液染色，CMC平 板用剛果紅染色，結果如圖2所示:帶有信號膚的轉化子產生的透明圈明顯高于未帶有信號 膚的轉化子，酶活明顯增高。
[0049] 實施例6:重組菌株的表達
[(K)加]2 %接種量接重組菌株于LB搖管，培養8-化，轉接LB搖瓶，1 %接種量，37 °C搖床培 養，待長到0D600nm=0.4-0.6時，加入1%。的ITPG放入20°C (淀粉酶FSA及SFSA W地SP化為載 體的直接20°C過夜培養，無需IPTG誘導過程;淀粉酶BLA及SBLAW祀T-Duet為載體的37°C誘 導地，淀粉酶BLA及SBLAWpBSP化為載體的直接37 °C過夜培養，無需IPTG誘導過程;纖維素 酶CCC及SCCCWpET-Duet為載體的37°C誘導地，纖維素 WpBSP化為載體的直接37°C過夜培 養，無需IPTG誘導過程)搖床過夜培養。
[0051] 1)收集菌體
[0化2] 600化mp，4。(：，離屯、IOmin，保留上清，將上清液置于冰上保存，用Buffer PBS重懸 菌體沉淀，GOOOrmp,4°C，離屯、IOmin;重復兩遍。
[0化3] 2)破壁
[0054] 用Buffer (10 %甘油+ 90 % PBS)將菌體重懸，加入1%。的PMSF后破壁。破壁后 ISOOOrmp,4°C，離屯、20min [005引 3)濃縮
[0056] 將胞外液用濃縮管濃縮，濃縮至90化1左右即可。
[0057] 4)LB培養基：Yeast Powder 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl lOg/L
[0化引 BSM 培養基：K 出 P04 2.4g,化 2冊04 ? 12 此 0 14.0g，NH4Cl 2.0g，10%MgCl2 ?細 20 2.0ml,1%化Cl2 100.0山，1%化〔13 100.化1,Solution A 5.Oml,Glycerin 4.Og,Vitamin solution 200.Oul，加水至IL。
[0化9]溶液A:0.5g FeCl2,0.5g aiCl2,0.5g MnCl2,0.1g Na2Mo〇4 ? 2出0,0.05g Na3W〇3 ? 2H2〇，120mM 肥I and 0.05g CuCl2,加水至IL。
[0060]維生素溶液：calcium pantothenate 400.Omg,creatine 200.Omg,nicotinic acid 400.Omg,PABA 200.Omg,Vitamin B6 400.Omg and Vitamin B12 0.5mg，加水至IL。 [0061 ] 實施例7:重組蛋白SDS-PAGE
[0062] 重組蛋白樣品W相同蛋白量跑11.25%含0.1% (w/v)SDS的聚丙締酷氨凝膠電泳， 120V，SOmin，跑完后用考馬斯亮藍R-250染色。SDS-Page結果如圖4所示:帶有信號膚的轉化 子W祀T-Duet為載體的樣品其胞外蛋白的表達量明顯增高，WpBSP化為載體的轉化子BLA 和CCC的胞外樣品表達量明顯增高，說明了信號膚Kp-SP應用的廣泛性，并且Kp-SP的成功應 用減少了蛋白的不溶性表達。
[0063] 實施例8:酶活的測定
[0064] FSA及SFSA酶活測定方法:在50°C下，測定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二鋼19.1008g/L，憐酸二氨鐘1.8516g/L)和20化1 5g/L淀粉溶液中反應15min，加入40化 1 DNS于100°C反應10min，在540皿下測吸光值變化。酶活定義:在50°C、pH 7.3(PBS緩沖液） 條件下，Imin轉化可溶性淀粉生成1皿Ol還原糖所需要的酶量，即為1個酶活力單位，WU表 /J、- O
[00化]BLA及SBLA酶活測定方法:在7(TC下，測定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二鋼19.1008g/L，憐酸二氨鐘1.8516g/L)和20化1 5g/L淀粉溶液中反應15min，加入 400iil DNS于100°C反應lOmin，在540nm下測吸光值變化。酶活定義:在70°C、pH 7.3(PBS緩 沖液)條件下，lmin轉化可溶性淀粉生成Iwiiol還原糖所需要的酶量，即為I個酶活力單位， Wu表示。
[0066] CCC及SCCC酶活測定方法:在60°C下，測定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二鋼19.1008g/L，憐酸二氨鐘1.8516g/L)和200]il 5g/L簇甲基纖維素鋼中反應15min，加 入40化1 DNS于100 °C反應10min，在540nm下測吸光值變化。酶活定義：在60 °C、pH 7.3 (PBS 緩沖液)條件下，Imin轉化簇甲基纖維素鋼生成I曲iol還原糖所需要的酶量，即為I個酶活力 單位，WU表示。
[0067] 按照上述方法測量各轉化子蛋白酶活，結果如圖3所示:帶有信號膚的轉化子其胞 外酶活明顯提高，且酶活總量也有所提高，對胞內外蛋白的表達均有促進作用。信號膚Kp- SP解決了蛋白的不溶性表達等問題，使蛋白的分離純化更加簡便經濟，對促進一些應用酶 類的工業化生產具有重要意義。
[0068] 發明實施例公開如上，雖然實施例已有優化，但其并非用W限定本發明，任何熟悉 此技術的人都可在不脫離本發明的精神和范圍內進行改動與修飾，因此本發明的保護應W 權利要求為準。
【主權項】
1. 一種使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽，其特征是:所述信號肽命名為Kp-SP， 來源于庫克氏菌(Kocuria sp.3-3)菌株，其核苷酸序列長度為90bp，如SEQ ID No.l所示； 其氨基酸序列長度為29aa，如SEQ ID No.7所示。2. 權利要求1所述使胞內蛋白表達至胞外的放線菌信號肽在利用構建的重組大腸桿菌 表達淀粉酶或纖維素酶中的應用。3. 如權利要求2所述的應用，其特征是：所述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名為FSA， 來源于Sinomicrobium Pectinilyticus f5DNS001，其核苷酸序列如SEQ ID Νο·2所不，氨基 酸序列如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594,命名為BLA，來源于Bacillus licheniformis DSM13,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.9所 示;所述纖維素酶0RF3883,命名為CCC，來源于Clostridium cellulosi CS-4-4,其核苷酸 序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。4. 如權利要求2所述的應用，其特征是:所述重組大腸桿菌的構建方法是： (1) 根據NCBI數據庫所提供KC441955.1、AAU39594、0RF3883所述的核苷酸序列設計引 物； 其中，淀粉酶KC441955.1與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SFSA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC,SFSA-Rl：GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC；SFSA-F2： GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通過 三步PCR將信號肽Kp-SP序列與KC441955.1序列連接，所得重組基因片段命名為SFSA; 淀粉酶AAU39594與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SBLA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SBLA-Rl:CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG，SBLA-F2: GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通過三步 PCR將信號肽Kp-SP序列與AAU39594序列連接，所得重組基因片段命名為SBLA; 纖維素酶0RF3883與信號肽Kp-SP重組所用引物為：SCCC-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl:CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2: GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通過三步 PCR 將信號肽Kp-SP序列與0RF3883序列連接，所得重組基因片段命名為SCCC; 其中：所述KC441955.1的核苷酸序列如SEQ ID化.2所示441]39594的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示，0RF3883的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示； 對照組為一步PCR獲得的不加信號肽Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或0RF3883所示的 基因片段； (2) 將（1)中得到的三組重組基因片段和對照組基因片段分別與載體pET-Duet或 pBSPPc 連接，構建獲得重組質粒 SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc 或 SBLA-pET-Duet、SBLA-pBSPPc或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，將所述重組質粒分別轉入感受態大腸桿菌BL21 (DE3)中，獲得的重組菌株通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證確認;對照組為FSA-pET-Duet、 FSA-pBSPPc 或 BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc 或 CCC-pET-Duet、CCC-pBSPPc 重組質粒轉入感受 態大腸桿菌BL21 (DE3)中，通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證； (3) 將(2)中得到的以pET-Duet為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分別接于LB 搖管中，培養8-9h，再以體積比1 %的接種量轉接于100ml LB搖瓶中，37 °C搖床培養，待 0D6QQnm= 0.4-0.6時，按體積比加入1%。的ITPG，其中，產淀粉酶FSA及SFSA的重組菌株放入20 °C搖床過夜培養，產淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株于3 7 °C繼續培養4h，產纖維素酶CCC及 SCCC的重組菌株于37°C繼續培養4h，所獲菌液離心保留上清，即得到含有淀粉酶或纖維素 酶的發酵液； 同樣，將(2)中得到的以pBSPPc為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分別接于LB 搖管中，培養8-9h，再以體積比1 %的接種量轉接于100mL LB搖瓶中，其中，產淀粉酶FSA及 SFSA的重組菌株直接20 °C過夜培養，產淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株直接37 °C過夜培養，產 纖維素酶CCC及SCCC的重組菌株直接37°C過夜培養，所獲菌液離心保留上清，即得到含有淀 粉酶或纖維素酶的發酵液。
【文檔編號】C07K14/195GK105924507SQ201610462367
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】楊春玉, 崔延冰
【申請人】山東大學