從油茶葉中提取根皮甙的方法
【專利摘要】本發明提供了一種從油茶葉中提取根皮甙的方法。以乙醇溶液為溶劑，對油茶葉進行浸提，得到粗提液；以D101大孔吸附樹脂為填料分離，再經硅膠層析分離，最后經DAC色譜柱分離、硅膠層析分離、C18色譜柱分離，即可獲得僅含根皮甙的混合物。本發明首次從山茶屬植物中成功提取出了根皮甙，并且該提取方法具有收率高、產品純度高等優點。
【專利說明】
從油茶葉中提取根皮巧的方法
技術領域
[0001] 本發明設及藥物提取技術領域，尤其是設及一種從油茶葉中提取根皮武的方法。
【背景技術】
[0002] 油茶葉為山茶科植物油茶的葉，其富含多種藥效成分，尤其是黃酬類化合物、巧類 化合物。黃酬類化合物具有多種生物活性，例如屯、血管系統活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫 瘤活性、抗氧化自由基活性、鎮痛活性、保肝活性等。巧類化合物具有桂疲止咳、抗腫瘤、抗 真菌、抑菌及降膽固醇等生物活性。
[0003] 如何從油茶葉中提取出根皮武等生物活性成分，對深度開發油茶作物極其重要。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供從油茶葉中提取根皮武的方法，所述的提取方法首次從油 茶葉中成功提取出了根皮武，并且該提取方法具有收率高、產品純度高等優點。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供了 W下技術方案：
[0006] 從油茶葉中提取根皮武的方法，包括W下步驟：
[0007] A: W乙醇溶液為溶劑，對油茶葉進行浸提，得到粗提液；
[000引 B: WDlO 1大孔吸附樹脂為填料，依次用水、15-25wt %乙醇溶液、75-85wt %乙醇溶 液對所述粗提液進行恒定洗脫；
[0009] C:將所述75-85wt%乙醇溶液洗脫得到的洗脫液進行硅膠層析分離，用10:1~1:3 的二氯甲燒-甲醇進行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮武的流份段， 命名為第一順序組分；
[0010] D:采用DAC色譜柱，用55-65 %甲醇-7jc為流動相對所述第一順序組分進行恒定洗 脫，分段收集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮武的流份段，命名為第二順序組分；
[00川 E:對所述第二順序組分進行硅膠層析，用90-110:10-14:1的二氯甲燒-甲醇-水進 行恒定洗脫，分段收集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮武的流份段，命名為第=順序組 分；
[0012] F:采用C18色譜柱，W15-25%乙臘-水對所述第=順序組分進行恒定洗脫，分段收 集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮武的流份段。
[0013] 上述提取方法由粗至精的方式從油茶葉中逐步分離出根皮武的純凈物。
[0014] W干油茶葉為基準，本發明對根皮武的提取率在10.1 mg/kgW上，并且前后產品的 純度均在90 % W上。
[001引本發明所述的流動相（即洗脫所用的液體)的比例均指體積比，流動相中的"％"指 非水物質所占的體積百分數，乙醇溶液均指乙醇的水溶液，例如，15-25%乙醇溶液指乙醇 體積百分比為15-25%水溶液。55-65%甲醇-水指甲醇體積百分比為55-65%的水溶液。
[0016] 本發明所述的恒定洗脫是指流動相的組成比例固定。
[0017] 本發明所述的梯度洗脫是指在洗脫過程中不斷改變流動相的濃度配比，但起始濃 度和終點濃度是固定的，例如步驟C中的梯度洗脫是指:二氯甲燒-甲醇按照起始濃度為9- 11:1、洗脫終點濃度為1:2.5-3.5的方式進行梯度洗脫。
[0018] 本發明所述的DAC色譜柱指軸向動態壓縮工業色譜柱。
[0019] 本發明所述的提取方法適用于不同種屬的油茶葉，尤其適合普通油茶（Camellia oleifera Abel),其提取率高。
[0020] 本發明所述的提取方法的各個步驟可W進一步改進，例如：
[0021] 步驟A中，浸提所用的溶劑、料液比、溫度對粗提液中的雜質含量W及有效成分的 提取率都有影響。溶劑優選用40-60 %的乙醇-水溶液，更優選50 %的乙醇-水溶液。料液比 優選為1:2.5-3.5( Ig固體:2.5-3.5mL溶劑），更優選1:2.5-3。浸提溫度優選為70-80°C，并 且W回流浸提為最佳。采用W上浸提條件能降低粗提液中的雜質含量，提高根皮武的提取 率。
[0022] 另外，為了降低后期分離的難度，在浸提之后可W濃縮干燥粗提液，除去乙醇。
[0023] 步驟B中，每個梯度洗脫所用流動相的體積優選為柱體積的3.5-4.5倍，更優選為 4-4.5倍，保證待提取成分能夠被充分洗脫出來。所用流動相的濃度優選水、15-20%乙醇溶 液、75-80%乙醇溶液。
[0024] 步驟C中，硅膠層析分離為分離手段，色譜分析為評價分離結果的手段，兩者互相 配合，篩選出含有根皮武目標提取物的洗脫液。篩選通常為粗篩選，一般是經色譜分析，先 將色譜圖相似的洗脫液合并，然后與目標提取物的標準品色譜圖對比，從中篩選出含有目 標提取物的洗脫液，將其合并。當然，也可W不經過合并，直接與目標提取物的標準品色譜 圖對比來選出有用的洗脫液，運種做法工作量較大，但是結果更精確。
[0025] 所述步驟C中，所用的硅膠的粒徑優選為200-300目，所述梯度洗脫優選為：用9-10 :1至1:2.5-3梯度的二氯甲燒-甲醇進行梯度洗脫，采用W上進一步優化的條件，可W提高 分離度和柱效。
[00%]在所述步驟C中，所述硅膠層析分離之前還包括:將所述75-85%乙醇溶液洗脫得 到的洗脫液濃縮干燥，可W避免乙醇對后續硅膠層析的干擾。
[0027] 另外，所述步驟C中的色譜分析可W是薄層色譜(TLC)、高效液相色譜等任意能用 于定性的方法，其中后者更準確。
[0028] 另外，在進行硅膠層析時，為了保證待分離物均勻分散在硅膠之中，優選將二氯 甲燒-甲醇稀釋待分離物，同時拌入硅膠，之后再水浴蒸干。經過W上處理后的物質再裝入 硅膠柱中進行層析。
[0029] 同樣，所述步驟D中，經色譜分析可W為:高效液相色譜分析，和/或薄層分析等。
[0030] 所述步驟D中，流動相的濃度優選55-60%甲醇-水時，具有更高的分離度。
[0031] 所述步驟E中，所用的硅膠的粒徑優選為200-300目，所述二氯甲燒-甲醇-水的比 例優選為90-100:10-12:1，W提高分離度和柱效。所采用的色譜分析可W為高效液相色譜 分析、薄層分析等。
[0032] 所述步驟F中，流動相的濃度優選15-20%乙臘-水。在該步驟中即可獲得根皮武的 純凈物，只要在色譜分析后，將僅含有根皮武的流份段合并即可。此處的"僅含"是指根皮武 的含量只要達到提取物的一般純度即可，在此基礎上，可根據生產需求選擇進一步提純。 [0033 ]與現有技術相比，本發明能達到W下技術效果：
[0034] (I)首次從油茶葉中提取了出高純度的根皮武；
[0035] (2)由粗到精的提取方式利于提取方法的規模化推廣；
[0036] (3)提取收率高。
【附圖說明】
[0037] 為了更清楚地說明本發明【具體實施方式】或現有技術中的技術方案，下面將對具體 實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前 提下，還可W根據運些附圖獲得其他的附圖。
[0038] 圖1為本發明實施例1提供的80%乙醇洗脫后收集的樣品的液相色譜圖；
[0039] 圖2為實施例1得到的最終流份的Ih-NM時普圖；
[0040] 圖3為實施例1得到的最終流份的Uc-NMR譜圖。
【具體實施方式】
[0041] 下面將結合附圖和【具體實施方式】對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，但 是本領域技術人員將會理解，下列所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的 實施例，僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。基于本發明中的實施例，本領 域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保 護的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑 或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過市售購買獲得的常規產品。
[0042] 本發明中所述的流動相的比例均指體積比。
[0043] 實施例1
[0044] 第一步：
[0045] 將自然陰干的油茶干燥葉粉碎過60目篩，取20kg分兩批用50 %乙醇按料液比1: 3 在70-80°C加熱回流，重復提取2次，每次提取化，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減壓濃 縮至無醇味，得到原體積約一半的粗提液樣品，備用。
[0046] 第二步：
[0047] 用工業酒精處理約IOL的DlOl型大孔吸附樹脂，用水洗到無醇味，將第一步得到的 提取液分兩次上樣，依次用水、20 %乙醇、80 %乙醇洗脫，每個梯度洗脫4倍柱體積，根據化C 和HPLC分析結果，各部位合并濃縮。
[004引80%乙醇洗脫后收集的樣品濃縮干燥(約150g，其HPlX譜圖如圖1所示，洗脫程序： O-IOminSO %甲醇水溶液，10-20min80 %甲醇水溶液，20-21min100 %甲醇;檢測波長254nm， 進樣量10化），溶解于10:1的二氯甲燒-甲醇中，拌入300g薄層層析硅膠(200~300目），水浴 揮干，分兩次裝柱，其中每次空白層裝填硅膠約800g。
[0049]流動相系統為二氯甲燒-甲醇（10:1至1:3梯度洗脫），每500mL收集為一次，經過 TLC檢測合并為1-化2'（表示:將第一次硅膠柱的第一個流份、第二個流份W及第二次硅膠 柱的第二個流份合并），3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'，17-19+14'， 20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66- 67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共計24個組分（兩次娃 膠柱的流份用序號后面的符號加 W區分，部分流份進行交叉合并，用加號銜接（同一次 硅膠柱的流份用-銜接），例如，第一次裝柱的提取液經洗脫后，收集的液體編號分別為1、 2……78,第二次裝柱的提取液經洗脫后，收集的液體編號分別為1'、2'……84'）。
[0050]第S步：
[0化1 ] 27-40利用DAC制備色譜分離，60 %甲醇-水恒定洗脫，得到化合物CO-I (56.4mg)， C0-2 (39.2mg)，C0-3 (9. Img)，W及一個含多個化合物的復雜組分打.A(865mg)。
[0化2] 第四步：
[0053] 將打.A流份溶解于一定比例的二氯甲燒-甲醇中，拌入2.5g薄層層析硅膠（200- 300目），水浴揮干，空白層裝填硅膠約40g。流動相系統為二氯甲燒-甲醇-水（100:12:1恒定 洗脫），每40mL收集為一個流份，經過化C檢測合并為1，2,3,4-12(編號方法同第二步）。
[0054] 第五步：
[0055] 利用C18色譜柱對第四步得到的流份1進行分離，20%乙臘-水恒定洗脫，對照HPLC 譜圖分析，收集僅含根皮武的流份(10.1 mg)。
[0056] 第六步:表征提取物
[0057] 將最終的流份進行核磁共振圖譜檢測，1H-NMR、Uc-NMR分別如圖2和3所示。
[0化引
[0059] 在 Ih-NMR 中，可見兩個苯環間位質子信號 S5.95(lH，d，J = 2.0HzWPS6.17(lH，d，J =2. OHz)分別歸屬于H-3 '和H-5 ' ；另有一組AA' BB'偶合系統的芳香質子信號S7.05(IH，d，J = 8.6Hz)，S6.68(lH，d，J = 8.細z)分別歸屬于H-2,6和H-3,5;S5.02(lH，d，J = 7.2Hz)為葡 萄糖的端基質子信號。在Uc-NMR中，可見一個酬幾基碳信號S205.1和一組葡萄糖基碳信號5 100.5，73.2，77.0，69.6，76.9，60.9。將碳譜和氨譜數據與現有文獻報道的根皮武的核磁圖 對照，基本一致。因此，可鑒定最終得到的流份為根皮巧。
[0060] 結合H術親化結單而W疏巧忌給流份的4V早立加下立（一即責巧巧就。
[0061]
1234 經檢測，得到的根皮武的純度分別為95.6%。 2 實施例2 3 第一步： 4 將自然陰干的油茶干燥葉粉碎過60目篩，取20kg分兩批用40%乙醇按料液比1: 2.5在70-80°C加熱回流，重復提取2次，每次提取化，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減 壓濃縮至無醇味，得到原體積約一半的粗提液樣品，備用。
[0066] 第二步：
[0067] 用工業酒精處理約IOL的DlOl型大孔吸附樹脂，用水洗到無醇味，將第一步得到的 提取液分兩次上樣，依次用水、15%乙醇、75%乙醇洗脫，每個梯度洗脫4.5倍柱體積，根據 TLC和HPLC分析結果，各部位合并濃縮。
[0068] 80%乙醇洗脫后收集的樣品濃縮干燥(約150g)，溶解于10:1的二氯甲燒-甲醇中， 拌入300g薄層層析硅膠(200~300目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空白層裝填硅膠約 SOOgo
[0069] 流動相系統為二氯甲燒-甲醇(9:1至1:2.5梯度洗脫），每SOOmL收集為一次，經過 TLC檢測合并含有根皮武的流份段，命名為第一順序組分。
[0070] 第S步：
[007。 第一順序組分利用DAC制備色譜分離，55 %甲醇-水恒定洗脫，經色譜分析，合并含 有根皮武的復雜組分，命名為第二順序組分。
[0072] 第四步：
[0073] 將第二順序組分溶解于一定比例的二氯甲燒-甲醇中，拌入2.5g薄層層析硅膠 (200-300目），水浴揮干，空白層裝填硅膠約40g。流動相系統為二氯甲燒-甲醇-水(90:10:1 恒定洗脫），每40mL收集為一個流份，經過化C檢測合并，得到含有根皮武的流份段，命名為 第=順序組分。
[0074] 第五步：
[0075] 利用C18色譜柱對第S順序組分進行分離，15%乙臘-水恒定洗脫，對照HPL村普圖 分析，收集僅含根皮武的流份(10.4)。
[0076] 第六步:表征提取物
[0077] 同樣，采用質譜和ih-nmr、i3c-nmr進行表征，結果與實施例1相同，最終流份為根皮 武。
[007引實施例3
[0079] 第一步：
[0080] 將自然陰干的油茶干燥葉粉碎過60目篩，取20kg分兩批用60%乙醇按料液比1: 3.5在70-80°C加熱回流，重復提取2次，每次提取化，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減 壓濃縮至無醇味，得到原體積約一半的粗提液樣品，備用。
[0081 ]第二步：
[0082] 用工業酒精處理約IOL的DlOl型大孔吸附樹脂，用水洗到無醇味，將第一步得到的 提取液分兩次上樣，依次用水、25 %乙醇、85 %乙醇洗脫，每個梯度洗脫3.5倍柱體積，根據 TLC和HPLC分析結果，各部位合并濃縮。
[0083] 80%乙醇洗脫后收集的樣品濃縮干燥(約150g)，溶解于10:1的二氯甲燒-甲醇中， 拌入300g薄層層析硅膠(200~300目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空白層裝填硅膠約 SOOgo
[0084] 流動相系統為二氯甲燒-甲醇（11:1至1:3.5梯度洗脫），每SOOmL收集為一次，經過 TLC檢測合并含有根皮武的流份段，命名為第一順序組分。
[0085] 第S步：
[0086] 第一順序組分利用DAC制備色譜分離，65 %甲醇-水恒定洗脫，經色譜分析，合并含 有根皮武巧的復雜組分，命名為第二順序組分。
[0087] 第四步：
[008引將第二順序組分溶解于一定比例的二氯甲燒-甲醇中，拌入2.5g薄層層析硅膠 (200-300目），水浴揮干，空白層裝填硅膠約40g。流動相系統為二氯甲燒-甲醇-水（110:14: 1恒定洗脫），每40mL收集為一個流份，經過化C檢測合并，得到含有根皮武的流份，命名為第 =順序組分。
[0089] 第五步：
[0090] 利用C18色譜柱對第S順序組分進行分離，25%乙臘-水恒定洗脫，對照HPL村普圖 分析，收集僅含根皮武的流份(9.7mg)。
[0091] 第六步:表征提取物
[0092] 同樣，采用質譜和ih-nmr、i3c-nmr進行表征，結果與實施例1相同，最終流份為根皮 武。
[0093] 最后應說明的是：W上各實施例僅用W說明本發明的技術方案，而非對其限制;盡 管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依 然可W對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進 行等同替換；而運些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術 方案的范圍。
【主權項】
1. 從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，包括以下步驟： A:以乙醇溶液為溶劑，對油茶葉進行浸提，得到粗提液； B:以DlOl大孔吸附樹脂為填料，依次用水、15-25wt%乙醇溶液、75-85wt%乙醇溶液對 所述粗提液進行恒定洗脫； C:將所述75-85wt%乙醇溶液洗脫得到的洗脫液進行硅膠層析分離，用10:1~1:3的二 氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫，分段收集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮甙的流份段，命名 為第一順序組分； D:采用DAC色譜柱，用55-65 %甲醇-水為流動相對所述第一順序組分進行恒定洗脫，分 段收集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮甙的流份段，命名為第二順序組分； E:對所述第二順序組分進行硅膠層析，用90-110:10-14:1的二氯甲烷-甲醇-水進行恒 定洗脫，分段收集洗脫液，經色譜分析，合并含有根皮甙的流份段，命名為第三順序組分； F:采用C18色譜柱，以15-25 %乙腈-水對所述第三順序組分進行恒定洗脫，分段收集洗 脫液，經色譜分析，合并含有根皮甙的流份段。2. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟A中，浸 提的方法為：料液比為1:3，在70-80°C下回流提取，乙醇溶液優選為40-60 %的乙醇-水溶 液。3. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟B中，每 個梯度洗脫所用流動相的體積為柱體積的3.5-4.5倍。4. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟C中，所 用的硅膠的粒徑為200-300目；所用的色譜分析優選為TLC。5. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟D中，所 述55-65 %甲醇-水優選為55-60 %甲醇-水。6. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟E中，所 用的硅膠的粒徑為200-300目，所述二氯甲烷-甲醇-水的比例優選為90-100:10-12:1。7. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟F中，合 并含有根皮甙的流份段優選為:經液相色譜分析，合并僅含有根皮甙的流份段。8. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，所述步驟F中，所 述乙臆_水為：15-20%乙臆-水。9. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，在所述步驟C中， 所述硅膠層析分離之前還包括:將所述75-85wt %乙醇溶液洗脫得到的洗脫液濃縮干燥。10. 根據權利要求1所述的從油茶葉中提取根皮甙的方法，其特征在于，在所述步驟A 中，在所述浸提之后還包括:濃縮除醇。
【文檔編號】C07H15/203GK105924482SQ201610281277
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】曹清明, 王元清, 鄭雙, 蘭芳, 鐘海雁
【申請人】中南林業科技大學