馬蘭活性組分及化合物及制備和應用
【專利摘要】本發明提供一種馬蘭水溶性活性組分及兩個黃酮苷化合物，將中藥馬蘭粉碎后，甲醇浸提，抽濾濃縮，經水和乙酸乙酯溶劑分配后，水層濃縮，先經ODS開口柱分離，再通過硅膠開口柱分離得到馬蘭活性組分，再純化得到兩個黃酮苷化合物。本發明通過抑制疫霉孢子囊產生的生物活性系統，發現馬蘭活性組分和其中兩個黃酮苷類化合物能顯著抑制疫霉孢子囊的產生，發揮抗疫霉作用，可在制備抗疫霉菌農藥中應用。本發明制備方法簡單，提取的產物純度高，且馬蘭為便宜易得的蔬菜和中藥，擴展了馬蘭的藥物用途，為利用傳統中藥材開發創新農藥提供了依據。
【專利說明】
馬蘭活性組分及化合物及制備和應用
技術領域
[0001] 本發明屬醫藥技術領域，設及馬蘭水溶性活性組分及化合物，W及制備方法和在 制備抗疫霉病農藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 目前，疫霉菌已經超過100種，并在逐月增加，能引起世界上最具有毀滅性的植物 病害，每年都帶來嚴重的經濟損失。19世紀中葉，致病疫霉引起的馬鈴馨晚疫病導致了愛爾 蘭大饑荒的發生，最終造成一百多萬人死亡，一百多萬人背井離鄉的人間悲劇。由精疫霉引 起的按樹根腐病使澳大利亞西南地區的森林結構和植物種群發生了重大變化，運已經嚴重 威脅到當地的生物多樣性和自然生態系統。化學農藥長期而廣泛的應用也產生了嚴重耐藥 性和環境污染。因此，尋找和發現低毒高效的抗疫霉菌活性物質已成為急需解決的問題。
[0003] 目前抗疫霉菌活性物質的研究主要集中在抑制菌絲生長和游動抱子萌發兩方面， 對具有抑制疫霉菌無性生殖階段抱子囊產生的活性物質的研究極少，而抱子囊的產生是疫 霉菌無性生殖階段的關鍵時期，其產生的游動抱子是疫霉菌蔓延的基礎。因此尋找具有抑 制無性抱子囊產生的活性物質具有及其重要的意義。
[0004] 天然產物作為藥物擁有取材天然，來源廣泛;作用平穩;毒副作用相對較小;是藥 物先導物的最佳來源之一等的特點，因而被廣泛研究。另外，我國中藥資源十分豐富，很多 中藥都擁有悠久的應用歷史，因此從中藥中尋找具有抗疫霉菌活性的成分有較大的優勢。
[0005] 馬蘭化alimeris indica)屬于菊科馬蘭屬，多年生草本植物，又名路邊菊。在我 國，其作為中藥用于治療感冒、腹瀉、胃潰瘍、急性胃脈腫、胃腸炎、急性睪丸炎、吐血和損傷 等疾病。主要化學成分有酪類、祗類、多糖、揮發油等。具有眾多的生物活性，一直被廣泛研 究。例如：馬蘭在制備降血脂藥物或功能性食品中的應用；治療流行性腮腺炎的蒼耳馬蘭 湯;一種用于治療持的馬蘭湯等。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種馬蘭水溶性活性組分及其中兩個黃酬巧化合物，所述的 馬蘭水溶性活性組分及其中兩個黃酬巧化合物通過W下制備步驟實現：
[0007] (1)馬蘭經粉碎后用甲醇浸提，抽濾濃縮后再經水和乙酸乙醋溶劑分配、水層濃 縮，得到浸提物；
[000引（2)將所得浸提物依次經ODS和硅膠開口柱分離，得到馬蘭抑制疫霉抱子囊產生的 活性組分；
[0009] (3)所得馬蘭活性組分經HPLC純化后得兩個黃酬巧化合物：kaempferol-3-0- rutinoside和isorhamnetin-3-〇-rutinoside。
[0010] 步驟(1)中所用馬蘭為干燥的馬蘭全株。
[0011] 步驟(2)中ODS(十八烷基硅烷鍵合硅膠填料)開口柱分離的溶劑系統為甲醇：水： 溶劑系統按體積比為甲醇:水= 3:7,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1，10:0。
[0012]步驟(2)中硅膠開口柱分離的溶劑系統為乙酸乙醋：甲醇= 7:3,5:5,3:7,0:10。 [OOU] 步驟(3)中HPLC純化的色譜條件：色譜柱C18(巫10/250mm)，流速3mL/min，檢測波 長210nm，流動相為為甲醇:水= 35:65。
[0014] 兩個黃酬巧化合物kaempfe;rol-3-0-;rutinoside和iso;rhamnetin-3-0- rutinoside在馬蘭水溶性活性組分中的含量在51%~72%之間。結構式如下：
[0015]
[0016] 本發明的另一個目的是提供所述的馬蘭水溶性活性組分及兩個黃酬巧化合物在 制備抗疫霉菌農藥中的應用。所述農藥由馬蘭水溶性活性組分及兩個黃酬巧化合物與農藥 學上可接受的載體組成。本發明研究表明馬蘭水溶性活性組分及其中兩個黃酬巧化合物可 W顯著地抑制疫霉抱子囊的產生。
[0017] 本發明的藥物劑型選用選用粉劑、乳劑或顆粒劑等。
[0018] 本發明通過抑制疫霉抱子囊產生的生物活性系統，發現馬蘭活性組分和其中兩個 黃酬巧類化合物能顯著抑制疫霉抱子囊的產生，發揮抗疫霉作用，可在制備抗疫霉菌農藥 中應用。本發明制備方法簡單，提取的產物純度高，且馬蘭為便宜易得的蔬菜和中藥，擴展 了馬蘭的藥物用途，為利用傳統中藥材開發創新農藥提供了參考。本發明制備方法簡單，提 取的產物純度高，且馬蘭為便宜易得的中藥，為利用傳統中藥材開發創新農藥提供了依據。
【附圖說明】
[0019] 圖1是馬蘭水溶性棘性組分對疫霉菌抱子囊產生的抑審峰。
[0020] 圖 2是化合物4日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16和1301'11日1]1]161：；[]1-3-〇-1'111：；[]1031(16對疫 霉菌抱子囊產生的抑制率，其中左：kaempferol-S-O-rutinoside，右：iso;rhamnetin-3-〇- rutinoside。
[0021 ]圖 3是化合物4日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16和1301'11日1]1]161：；[]1-3-〇-1'111：；[]1031(16抑制 疫霉菌抱子囊產生的顯微圖片。圖中a為陰性對照:0.2%DMS0，b為陽性對照：甲霜靈(3化g/ 111]^)，。為1<：日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16(3〇11]\〇(1,1<：日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16(3〇11]\〇。
【具體實施方式】
[0022] W下結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。但不應將此理解為本發明上述 主題的范圍僅限于下述的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范 圍。
[0023] 實施例1馬蘭水溶性活性組分及其中兩個黃酬巧化合物kaempf ero 1-3-0- rutinoside 和 isorhamnetin-3-O-rutinoside 的審 Ij 備方法
[0024] (I)粉碎和浸提：
[0025] 取Ikg干燥的馬蘭粉碎后，用IOL甲醇（工業級）室溫下浸提2次，每次1天，抽濾濃 縮，得甲醇浸提物粗樣，用乙酸乙醋和水萃取分離，靜置，將水層減壓濃縮旋干后，得到乙水 層粗樣2始。
[0026] (2)分離和純化：
[0027] 將水層粗樣先經ODS開口柱分離(溶劑系統按體積比為甲醇:水=3:7，5:5，6:4，7: 3,8:2,9:1，10:0);活性樣品再用硅膠開口柱分離（200-300目，^下溶劑系統按體積比，乙 酸乙醋：甲醇= 7:3,5 :5,3:7，0:10);得到黃色的含活性化合物的活性組分（152mg)。取 17.4mg活性組分用反向HPLC純化，色譜條件:色譜柱C18(〇10/250mm)，流速3ml/min，檢測 波長210皿，流動相為為甲醇：水=35:65，得到4曰61119'61'〇]_-3-0-1'111:;[]1〇31(16(4.1111旨,保留時 間為60.0111；[]1)和13〇1'11日1]1]161:;[]1-3-0-1'111:;[]1〇31(16(4.8111邑,保留時間為69.7111；[]1)。
[0028] 實施例2
[00 巧]對實施例 1 所得化合物kaempf 61'〇1-3-0-1'111:;[]1〇31(16和13〇1'11日1]1]161:;[]1-3-0- rutinoside的理化特征及化學結構的定性鑒定：
[0030]化合物 4日61119'61'〇1-3-0-1'111：；[]1〇31(16和13〇1'11日1]1]161：；[]1-3-0-1'111：；[]1〇31(16的結構經 Ih NMR、MS和文獻比對確定
[0031 ] 化合物kaempferol-S-O-rutinoside的理化性質：黃色固體， [a],:- i 6.2。（(' 0.2, McOH),分子式為C2訊3〇〇15; ESI-TOF-MS :m/z 595.1663(M+H) +，氨譜數據： Ih NMR( 500MHz，CD3孤）：5 = 1.12(3H，d，J = 6. OHz，H-護 '），3.25-2.81 (IOH，m，H-2"-護/T'- 5"'），4.51(lH，s，H-r'），5.12(lH，d，J = 7.5Hz，H-r)，6.89(2H，d，J = 8.5Hz，H-375'）， 8.07(2H，d，J = 8.甜z，H-276'），6.41(lH，s，H-8)，6.21(lH，s，H-6)。
[0032] 化合物isorhamnetin-S-O-rutinoside的理化性質：黃色固體， [CtE-%.4。（(' 0.07, Mt'OH)，分子式為C2祖32016，ESI-TOF-MS:m/z 625.1765(M+H) +，氨譜數據 :Ih NMR( 500MHz，CD3孤）：5 = 1.09 (3H，d，J = 6. OHz，H-6"'），3.22-3.49(8H，m，H-2"-5"/T'- 5，，，），3.60(lH，dd J = 3.5,2.0Hz，H-6b，，），3.81(lH，dd J=12.5，1.5Hz，H-6a，，），4.52(lH, d J=l.甜z，H-^'），5.24(lH，dJ = 7.0Hz，H-^)，7.62aH，ddJ = 8.5,2.0Hz，H-6'），6.91 化，d，J = 8.5Hz，H-5'），7.94( lH，d，J = 2.0Hz，H-2'），3.94(3H, S，-0C 曲），6.40( lH，d, J = 2.0Hz)，6.20(lH，d，J = 2.0Hz)。
[0033] 實施例3
[0034] 馬蘭水溶性活性組分及化合物在辣椒疫霉篩選模型中，能顯著抑制疫霉菌抱子囊 的產生。
[0035] 目前抗疫霉菌活性物質的研究主要集中在抑制菌絲生長和游動抱子萌發兩方面， 對具有抑制疫霉菌無性生殖階段抱子囊產生的活性物質的研究極少。甲霜靈是目前在防治 植物疫病上面被最廣泛應用的一種農藥，可強烈抑制疫霉菌絲體的生長和無性抱子囊的產 生。本發明發現馬蘭水溶性活性組分及其中兩個黃酬巧化合物kaempferol-3-O- rutinoside和isorhamnetin-S-O-rutinoside在辣椒疫霉模型中，顯著抑制疫霉菌抱子囊 的產生。
[0036] 1.實驗方法：
[0037] (1)從l〇°C生化培養箱取出辣椒疫霉菌株，復蘇到25°C，取一小塊接種到20ml固體 培養皿（10%的V8化ice，0.02%的碳酸巧，2%的瓊脂粉）中。25°C避光培養3-4d備用。
[003引 （2)取￥8化;[。6 50111]^，碳酸巧0.2邑,于離屯、管中混勻，離屯、15111；[]1(400〇1'/111；[]1)，得到 VSjuice上清液。
[0039] (3)取出在生化培養箱中避光培養3-4d的固體平板，用打孔器在菌絲邊緣切下直 徑為6mm的菌塊，放在已滅菌的直徑為6cm的培養皿中屯、，然后加入IOmL液體培養基（3%的 V8 juice上清液），放于25°C生化培養箱避光培養。4化后，除去培養基，并加入IOmL無菌水/ 皿。樣品加入時，先將樣品別用20化DMSO溶解，然后用移液槍吸取培養皿中的無菌水98化 L，加入到樣品溶液中，混勻后再均勻加入到培養皿中。測定中WO. 2%DMS0為陰性對照，W 30yg/血的甲霜靈為陽性對照。經過16-24h的避光培養，在光學顯微鏡下觀察疫霉菌無性抱 子囊產生的情況并懸浮計數(10倍目鏡，4倍物鏡)統計，然后計算其抑制率。
[0040] 抑制率（％) = (Nd-Ns)/NdX100%
[0041] Nd:陰性對照組單位體積內產生的無性抱子囊數;Ns:樣品組單位體積內產生的無 性抱子囊數。
[0042] 2.實驗結果：
[0043] 馬蘭活性組分在30yg/mL對疫霉菌抱子囊產生的具有明顯的抑制作用（圖1)。化合 物 4日6111口'61'〇1-3-0-1'111：；[]1〇31(16和13〇1'11日1]1]161：；[]1-3-0-1'111：；[]1〇31(16在3-30111的濃度范圍內 對疫霉菌抱子囊的產生具有抑制作用（圖2)。運兩種化合物在濃度為30iiM時，對疫霉菌抱子 囊抑制率分別為92%和83%，相應顯微圖片（圖3)。
【主權項】
1. 一種馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物，其特征在于，通過以下方法獲 得： (1) 馬蘭經粉碎后用甲醇浸提，抽濾濃縮后再經水和乙酸乙酯溶劑分配、水層濃縮，得 到水層粗樣； (2) 將所得水層粗樣依次經ODS和硅膠開口柱分離，得到馬蘭抑制疫霉孢子囊產生的活 性組分； (3) 所得馬蘭活性組分經HPLC純化后得兩個黃酮苷化合物：kaempfer〇l-3-0-rutinoside 和 isorhamnetin_3-〇-rutinoside，結構式如下：2. 根據權利要求1所述的一種馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物，其特征 在于，步驟(1)中所用馬蘭為干燥的馬蘭全株。3. 根據權利要求1所述的一種馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物，其特征 在于，步驟(2)0DS開口柱分離的溶劑系統為甲醇:水，溶劑系統按體積比為甲醇:水=3: 7， 5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,10:0〇4. 根據權利要求1所述的一種馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物，其特征 在于，步驟(2)硅膠開口柱分離的溶劑系統為乙酸乙酯：甲醇，體積比為7 :3,5:5,3:7,0:10。5. 根據權利要求1所述的一種馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物，其特征 在于，步驟(3)中HPLC純化的色譜條件為：色譜柱C18?10/250mm，流速3mL/min，檢測波長 210nm，流動相為甲醇：水= 35:65。6. 根據權利要求1所述的一種馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物，其特征 在于，兩個黃酮苷化合物 1<3611^^61'〇1-3-〇-1'111：；[1108丨(16和丨801'11&1]11161：；[11-3-〇-1'111：；[1108丨(16在 馬蘭水溶性活性組分中的含量在51 %~72 %之間。7. 權利要求1所述的馬蘭水溶性活性組分及二個兩個黃酮苷化合物在制備抗疫霉菌農 藥中的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述農藥由馬蘭水溶性活性組分及兩個黃 酮苷化合物與農藥學上可接受的載體組成。9. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述農藥的劑型選用粉劑、乳劑或顆粒劑。
【文檔編號】C07H1/08GK105924479SQ201610463306
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】戚建華, 張慧, 王源超
【申請人】浙江大學