一種雙光子甲醛熒光探針及其制備與應用
【專利摘要】本發明公開了一種雙光子甲醛熒光探針及其制備與應用，是一種基于分子內電荷轉移機制的以1,8?萘酰亞胺為雙光子熒光團的新型甲醛類探針。探針分子具有良好的光穩定性以及很大的斯托克位移，該探針在中性緩沖液中能夠很好檢測甲醛濃度，同時相對于其他醛類化合物，探針對甲醛具有很好的專一性。雙光子共聚焦熒光顯微鏡成像實驗很好地證明了探針能夠滲透細胞膜進入細胞中且能夠在細胞中檢測甲醛濃度的變化，為研究細胞中甲醛的生理作用提供一種有效的研究工具。
【專利說明】-種雙光子甲酵黃光探針及其制備與應用 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一種檢測細胞內甲醒的雙光子巧光染料，具體設及基于1,8-糞酷亞胺 的新型雙光子甲醒類巧光探針的制備方法及應用。 (二)【背景技術】
[0002] 甲醒作為一種公認的致癌物質，主要來源有=:一類是來源于工業生產，一類來自 于自然界的釋放，一類是來源于內源性的甲醒，例如氧化酶、嗜中性粒細胞髓過氧化物酶等 生物反應就能釋放甲醒。在正常的人體血液中，甲醒濃度就可達到0.1 mM左右。但是體內過 量的甲醒能夠引起呼吸道慢性疾病、胚胎崎形、阿茲海默病和癌癥等等。在現階段的甲醒檢 測方法當中，大多是檢測空氣中的甲醒，國內外報道的檢測細胞內甲醒的探針還是寥寥無 幾。目前能夠專一性檢測細胞內甲醒的主要方法有兩種，一種是氨基與甲醒反應后，隨后自 發發生2-氮雜-柯普重排W及水解，生成信號增強的效果;另一種利用阱和甲醒反應生成產 物達到巧光信號變化的效果。基于雙光子染料低細胞毒性、高穿透性等優點，我們設計并合 成了一種Wl ,8-糞酷亞胺為母核的雙光子的甲醒類巧光探針，運類探針能夠成功檢測甲醒 溶液W及細胞內甲醒濃度的變化。 (H)
【發明內容】
[0003] 本發明目的是提供一種1,8-糞酷亞胺的新型雙光子甲醒類巧光探針及其制備方 法與用途。
[0004] 本發明采用的技術方案是：
[0005] 本發明提供一種式(I)所示雙光子甲醒巧光探針，
[0006]
[0007]本發明還提供一種所述雙光子甲醒巧光探針的制備方法，所述方法為:將式(4)所 示化合物溶于甲醇中，冰浴至(TC,加入7mol/L氨甲醇溶液，(TC下反應半小時，隨后加入丙 締基棚酸鄰二叔醇醋，室溫反應過夜，反應液分離純化，獲得所述雙光子甲醒巧光探針；
[0008；
[0009]進一步，所述式(4)所示化合物與丙締基棚酸鄰二叔醇醋物質的量之比為1:2,所 述氨甲醇溶液用量W氨物質的量計，所述式(4)所示化合物與氨物質的量之比為1:10。
[0010 ]進一步，所述甲醇體積用量W式(4)所示化合物物質的量計為1 OmL/mmo 1。
[0011] 進一步，所述反應液分離純化方法為:反應液減壓旋蒸去除溶劑，取濃縮物進行娃 膠柱分離，W體積比20:1的二氯甲燒甲醇混合液為洗脫劑，收集目標組分，干燥，獲得所述 雙光子甲醒巧光探針。
[0012] 本發明還提供一種所述雙光子甲醒巧光探針在檢現巧醒中的應用，所述甲醒為扣 mo 1 /L~Smmo 1 /L甲醒水溶液（優選0.25~SmM )，所述甲醒為細胞內扣mo 1/L~Smmo 1 /L甲醒 (優選2~5mM)，所述細胞為子宮頸癌細胞化La。所述甲醒檢測限為如mol/L。
[0013]當檢測溶液中甲醒時，所述檢測方法是將探針溶液加入憐酸緩沖液（IOmM pH = 7.4)中，再加入甲醒水溶液，所述探針溶液為ImM探針二甲基亞諷溶液，所述探針溶液與甲 醒水溶液體積比為1: 2，所述甲醒終濃度為扣mo 1 /L~5mmo 1 /L，即檢測范圍為扣mo 1 /L~ 當檢測細胞中甲醒時，檢測范圍為如mol/L~5mmol/L。
[0014] 反應路線如下：
[0015：
[0016] 本發明所述化合物(I)可作為雙光子巧光探針，應用于甲醒的巧光檢測。所述的甲 醒濃度的巧光檢測的方法為：W化合物（I)作為巧光探針，與PBS緩沖溶液中的甲醒進行反 應，生成中間產物，隨后2-氮雜-柯普重排W及水解，生成巧光物質4,測定在激發為350nm下 的巧光強度變化，從而獲得甲醒濃度。
[0017] 其次，W化合物（I)作為巧光探針，與化La細胞進行解化，然后加入外源甲醒進行 巧光成像，激發波長為720nm，發射波長為425nm到470nm。
[0018] 本發明巧光探針的結構中W3號位的取代基的改變，實現推-拉電子能力的變化， 從而達到吸收光譜W及發射波譜藍移的效果。
[0019] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在:本發明選用的1,8-糞酷亞胺結構 是個雙光子巧光團，具有良好的光穩定性W及很大的斯托克位移。我們合成的探針對甲醒 水溶液具有很好的特異性，在生物細胞成像時選用長波長的激發波長，降低細胞自身巧光 背景，穿透能力強，對細胞損傷小，能夠檢測細胞內甲醒的濃度，最低檢測限為扣M，為研究 細胞中甲醒的生理作用提供一種有效的研究工具。 (四）
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明中探針(I)的核磁氨譜。
[0021] 圖2為本發明中探針（I)的核磁碳譜。
[0022] 圖3為本發明中探針（I)在抑為7.4條件下加入OmM和5mM甲醒水溶液濃度的紫外吸 收光譜，曲線（I) +甲醒是指探針(I)加入5mM甲醒水溶液，曲線（I)是指探針（I)加入OmM甲醒 水溶液。
[0023] 圖4為本發明中探針（I)在pH為7.4激發波長為450nm條件下加入不同甲醒水溶液 濃度下的巧光光譜，曲線（I)是指探針(I)加入OmM甲醒水溶液。
[0024] 圖5為本發明中探針（I)在pH為7.4激發波長為350nm條件下加入不同甲醒水溶液 濃度下的巧光光譜。
[0025] 圖6為本發明中探針（I)在抑為7.4激發波長為350nm發射波長為510nm條件下加入 0.5mM甲醒水溶液下的時間巧光變化圖。
[0026] 圖7為本發明中探針（I)在pH為7.4激發波長為350nm條件下加入甲醒和不同生物 相關活性小分子的巧光光譜。
[0027] 圖8為本發明中探針（I)在不同抑值激發波長為350nm發射波長為510nm條件下加 入OmM和5mM甲醒濃度的巧光變化，（I)是指探針（I)加入OmM甲醒水溶液。
[0028] 圖9為本發明中探針(I)和化合物4的密度泛函數計算。
[0029] 圖10為本發明中探針（I化抑為7.4的條件下加入ImM后不同時間段的高效液相色 譜圖。
[0030] 圖11為本發明中探針（I)在子宮頸癌細胞化eLa)中的雙光子共聚焦巧光成像效果 圖，（a)(d)(g)分別表示激發光為720nm時0、2、5mM甲醒濃度解化下細胞的雙光子共聚焦巧 光成像效果圖；（b) (e)化)分別表示0、2、5mM甲醒濃度解化下細胞的細胞明場效果圖；（C) (f)(i)分別表示(a)和(b)、（d)和(e)、（g)和化)的疊加效果圖。 (五)
【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032] 參照文獻（J.Fang, J Am 化em Soc ,2015,137,757-769，S.-K.化ang,Dyes and Pigments)的合成方法，按照合成路線分別合成結構式(2 )、（ 3)和(4)的中間產物。
[003；
[0034]實施例1探針(I)的合成
[00巧]在50mL的圓底燒瓶中，加入148mg化合物4(0.5mmo 1)溶于5mL甲醇中，冰浴至(TC， 加入0.72mL氨甲醇溶液(7mo 1 /L Smmo 1)，(TC下反應半小時，隨后加入168mg丙締基棚酸鄰 二叔醇醋（Immol)。反應轉至室溫且過夜，混合液減壓旋蒸去除溶劑，取濃縮物進行硅膠柱 分離（W體積比20:1的二氯甲燒：甲醇混合液洗脫），得到產物118mg，產率70%。核磁氨譜見 圖1，核磁碳譜見圖2。
[0036] iHMffi(500MHz，d6-DMS0)S:8.43(d，J = 7.8，lH)，8.25(d，J = 7.0，lH)，8.03(s, lH),7.35(t J = 7.6,lH),5.72(ddt J=13.8,10.1,6.8,lH),5.06(dd J = 25.4,13.6,2H), 4.50-4.32(m,lH),4.09-3.94(m,2H),2.88-2.75(m,lH),2.74-2.63(m,lH),1.64-1.49(m, 2H)，1.39-1.26(m，2H)，0.92(t，J=7.4,3H)〇Uc 醒R(126MHz，d6-DMS0)S:175.4，164.2， 162.7,134.0,130.9,130.2,127.4,121.4,120.8,118.1,98.5,52.5,38.6,36.4,30.1, 20.0，13.9.ESI calcd.for C20肥202N3(M+H)339.2，found 339.2。
[0037] 實施例2探針(I化抑為7.4條件下加入OmM和5mM甲醒濃度的紫外吸收光譜測定
[0038] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（IOmM抑=7.4)，分別加入化L超純水和化L、500ml甲醒 水溶液，37°C下反應3小時后，測定兩個混合液的紫外吸收光譜，結果見圖3。
[0039] 實驗證明，糞酷亞胺類染料的3位上推-拉電子的能力的不同能夠影響化合物的吸 收光譜，由于醒基的拉電子能力比較強，所W探針（I)與甲醒反應后的產物的吸收光譜有個 藍移的過程，最大吸收波長從440nm降到了 370nm。
[0040] 實施例3探針（I)在pH為7.4激發波長為450nm條件下加入不同當量甲醒濃度下的 巧光效果檢測。
[0041] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（1 OmM抑=7.4)，分別加入化L不同濃度甲醒水溶液(最 終甲醒在水中的濃度分別為OmM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM、5mM)，37°C下反應3小時后，測定 其巧光值。激發波長為450nm，發射波長為480-740nm，巧光譜圖見圖4。
[0042] 實驗證明，在增加甲醒當量的情況下，由于醒基的拉電子能力比較強，在激發波長 為450nm時，探針（I)與甲醒反應后的產物的發射光譜有個藍移的過程，最大發射波長從 550nm降到了 520nm。
[0043] 實施例4探針（I)在pH為7.4激發波長為350nm條件下加入不同當量甲醒濃度下的 巧光效果檢測。
[0044] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到394化憐酸緩沖液（IOmM抑=7.4)，分別加入化L不同濃度的甲醒水溶液 (最終甲醒在水中濃度分別為〇1111、〇.251111、0.5111]\1、1111]\1、21111、51111)，37°(：下反應3小時后，測定 其巧光值。激發波長為350nm，發射波長為440-740nm，巧光譜圖見圖5。
[0045] 實驗證明，在激發波長為350nm的條件下，能夠觀察到隨著甲醒濃度的提高，巧光 強度也能隨之增大，檢測限為如M。
[0046] 實施例5探針（I)在pH為7.4條件下加入100倍當量甲醒濃度的時間與巧光效果的 關系檢測
[0047] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（IOmM抑=7.4)，加入化L甲醒水溶液(最終甲醒在水中 的濃度為〇.5mM)，37°C下反應，在不同時間點（分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、9、23、24、 25h)測定其巧光值。激發波長為350nm，發射波長為510nm，巧光譜圖見圖6。
[0048] 實驗證明，隨著時間的流逝，巧光強度也能隨之增強，符合探針檢測甲醒的效果。
[0049] 實施例6探針(I)在抑為7.4條件下的選擇性實驗
[0050] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（1 OmM抑=7.4)，分別加入化L甲醒水溶液(最終甲醒在 水中的濃度均為1mmol/L)和生物相關活性小分子水溶液化醒、丙酬醒、4-甲基苯甲醒、4- 硝基苯甲醒、苯甲醒、雙氧水、谷脫甘膚、半脫氨酸、高半脫氨酸、丙酬酸鋼、葡萄糖，最終濃 度均為lmmol/L)，37°C下反應3小時，測定其巧光值。激發波長為350nm，發射波長為440- 740nm，巧光譜圖見圖7。
[0051] 實驗證明，探針(I)的抗干擾能力十分好，即對甲醒的專一性比較好。
[0052] 實施例7探針(I)在不同pH值下的檢測性能實驗
[0053] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L不同抑值的巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖液(抑分別為3.4、4、4.6、5.2、 5.8、6.4、7、7.4、8)，分別加入化1不同濃度的甲醒水溶液(最終甲醒在水中的濃度分別為0 和lmmol/L)，37°C下反應3小時，在不同抑值條件下測定其巧光值。激發波長為350nm，發射 波長為510nm，巧光譜圖見圖8。
[0054] 實驗證明，在抑中性或偏堿性時，抑的變化對探針（I)的影響不大，即探針（I)能夠 在中性的生物體內檢測甲醒的濃度。
[0055] 實施例8探針(I)和化合物4的密度泛函數計算
[0056] 利用高斯09軟件計算探針(I)和化合物4的密度泛函數，結果見圖9。
[0057] 實驗證明，通過高斯09計算，進一步證明了探針與甲醒反應后產物的巧光最大發 射波長是藍移的。
[0058] 實施例9探針(I)在抑為7.4的條件下與甲醒反應的中間產物、終產物效果分析
[0059] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取80化加入到31化L憐酸緩沖液（IOmM pH=7.4)，隨后加入化L甲醒水溶液(最終甲醒 在水中的濃度為lmmol/L)37°C下反應，分別在0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、她時取樣，然后利 用高效液相色譜分析。高效液相譜圖見圖10。
[0060] 高效液相色譜分析條件為:利用C18柱，洗脫條件為從100%乙臘梯度到100%水， 每次液相時間均為15分鐘。
[0061] 實驗證明，我們描述的探針（I)與甲醒反應的機理是正確的。探針（I)與甲醒先生 成中間產物1、2,然后經過2-氮雜-柯普重排W及水解生成最終物質4。
[0062] 實施例10探針(I)在子宮頸癌細胞化eLa)中的成像分析
[0063] 準確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為IOmM的探針母液。子宮頸 癌細胞化La接近1 X IO5個細胞培養接種在共聚焦盤中，由DMEM培養基在37°C、5%C02條件下 進行恒溫培養，培養24小時后，棄去培養基。將化L探針加入到199祉L新鮮DMEM培養基中，混 合均勻后加入共聚焦盤的細胞中，37°C下解化半小時，用新鮮DMBl培養基洗涂3次，然后用 不同甲醒濃度(最終甲醒濃度分別為0、l、5mM)解化3小時，新鮮DMEM培養基洗涂兩次，最終 用Leica TCS SP5Multiphoton Confocal Scanning Microscope進行雙光子成像，激發波 長為720nm，發射波長為420-475nm。圖11為細胞雙光子共聚焦巧光成像效果圖。
[0064]實驗證明，在甲醒濃度提高的情況下，我們能夠看到細胞中的巧光信號也在變強。 說明我們的物質能夠檢測細胞內的甲醒。
【主權項】
1. 一種式(I)所示雙光子甲醛熒光探針，2. -種權利要求1所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述方法為:將式 (4)所示化合物溶于甲醇中，冰浴至0 °C，加入7mo 1 /L氨甲醇水溶液，0 °C下反應半小時，隨后 加入丙烯基硼酸鄰二叔醇酯，室溫反應過夜，反應液分離純化，獲得所述雙光子甲醛熒光探 針；3. 如權利要求2所述所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述式(4)所示 化合物與丙烯基硼酸鄰二叔醇酯物質的量之比為1:2,所述氨甲醇溶液用量以氨物質的量 計，所述式(4)所示化合物與氨物質的量之比為1:10。4. 如權利要求2所述所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述甲醇體積 用量以式(4)所示化合物物質的量計為1 OmL/mmo 1。5. 如權利要求2所述所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述反應液分 離純化方法為:反應液減壓旋蒸去除溶劑，取濃縮物進行硅膠柱分離，以體積比20:1的二氯 甲烷甲醇混合液為洗脫劑，收集目標組分，干燥，獲得所述雙光子甲醛熒光探針。6. -種權利要求1所述雙光子甲醛熒光探針在檢測甲醛中的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述甲醛為5ymol/L~5mmol/L甲醛水溶液。8. 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述甲醛為細胞內5ymol/L~5mmol/L甲醛。9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于所述細胞為子宮頸癌細胞HeLa。10. 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述甲醛檢測限為5ymol/L。
【文檔編號】G01N21/64GK105924394SQ201610340384
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】朱勍, 謝振達
【申請人】浙江工業大學