在固體支持物上的多核苷酸修飾的制作方法

在固體支持物上的多核苷酸修飾的制作方法
【專利摘要】本公開內容涉及分子生物學領域，并且更具體地涉及用于在固體表面上捕獲和擴增靶多核苷酸的方法。
【專利說明】在固體支持物上的多核苷酸修飾
[0001]本公開內容涉及分子生物學領域，并且更具體地涉及用于在固體表面上捕獲和擴 增靶多核苷酸的方法。
[0002] 背景
[0003] 新一代測序已經使全基因組測序和全基因組分析成為可能。新一代測序方法典型 地依賴于基因組片段的通用擴增，所述通用擴增首先配備通用擴增區域，并且然后通過在 固體表面上的通用捕獲引物無差別地捕獲。該通用捕獲引物介導多核苷酸捕獲和橋式擴增 二者，是新一代測序方法中的關鍵元件（參見，例如，WO 2011/025477A1、US 2011/ 0172119A1)〇
[0004] 雖然當前的方法能有效地支持全基因組測序，但其不允許靶向捕獲特定多核苷 酸，并且因此不支持，例如，部分基因組的靶向測序。但是，對于促進例如生物體的外顯子組 或轉錄組的特定部分的靶向測序的方法存在增長的需要。該需要部分被成本但也被數據處 理考慮驅動。
[0005] 因此，對使部分基因組的靶向的新一代測序成為可能的新方法存在需要。本公開 內容通過提供用于修飾表面上固定的捕獲引物的方法解決該需要。也提供相關的優勢。
[0006] 概述
[0007] 本公開內容提供修飾固定的捕獲引物的方法。
[0008] 在一方面，本公開內容提供修飾固定的捕獲引物的方法，所述方法包括:a)提供具 有固定的應用特異性捕獲引物的固體支持物，該應用特異性捕獲引物包括：i)包括應用特 異性捕獲區域的3'部分和ii)包括通用捕獲區域的5'部分;b)對于雜交足夠將應用特異性 多核苷酸與該應用特異性捕獲引物接觸在對于雜交足夠的條件下，以產生固定的應用特異 性多核苷酸，和c)移除未與應用特異性多核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物的應用特異性 捕獲區域，以將未雜交的應用特異性捕獲引物轉化成通用捕獲引物。在一些實施方案中，應 用特異性捕獲區域的一部分被移除。
[0009] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物包括多個不同的固定的應用特異性捕獲 引物。
[0010] 在一些實施方案中，應用特異性多核苷酸包括多個不同的應用特異性多核苷酸。
[0011] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲區域包括靶特異性捕獲區域且應用特異性多 核苷酸包括靶多核苷酸。
[0012] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲區域包括轉座子末端(TE)區域且應用特異性 多核苷酸包括TE寡核苷酸。
[0013] 在一些實施方案中，所述方法還包括在執行步驟c)之前，在對于寡核苷酸與應用 特異性捕獲引物的通用捕獲區域雜交足夠的條件下，施加寡核苷酸，以產生雙鏈DNA區域。 在某些實施方案中，所述寡核苷酸是P5或P7寡核苷酸。
[0014] 在一些實施方案中，所述方法還包括在執行步驟c)之前，在對于寡核苷酸與應用 特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域雜交足夠的條件下，施加寡核苷酸，以產生雙鏈DNA 區域。
[0015] 在一些實施方案中，所述方法還包括將所述應用特異性捕獲引物與核酸酶接觸， 其中未與應用特異性多核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域被核酸 酶移除。在一些實施方案中，所述核酸酶為外切核酸酶。在一些實施方案中，所述外切核酸 酶是外切核酸酶I。在一些實施方案中，所述外切核酸酶是外切核酸酶III。在一些實施方案 中，所述核酸酶為內切核酸酶。
[0016] 在一些實施方案中，提供固體支持物包括將應用特異性捕獲引物固定到固體支持 物上。在一些實施方案中，所述應用特異性捕獲引物被直接固定到固體支持物上。在一些實 施方案中，固定所述應用特異性捕獲引物包括將通用捕獲引物固定到固體支持物上。在一 些實施方案中，所述方法還包括將固定的通用捕獲引物轉化成應用特異性捕獲引物。
[0017] 附圖簡述
[0018] 圖1是闡明應用特異性捕獲引物和通用捕獲引物的設計的示意圖。通用捕獲引物 由通用的川umina?捕獲引物P5和P7代表，其用黑色箭頭表示。應用特異性捕獲引物用延 伸的箭頭表示。通用捕獲區域由P5和P7區域示例，其顯示為延伸的箭頭中的黑色區域。應用 特異性捕獲區域顯示為具有不同模式的虛線。在應用特異性捕獲引物中，通用捕獲區域位 于引物靠近固體支持物的5'末端。應用特異性捕獲區域位于引物的3'末端。
[0019] 圖2是示例將應用特異性捕獲引物附接到固體支持物的兩種方法的示意圖。圖2A 示例直接固定通用捕獲引物(稱為"標準的P5"和"標準的P7"）和應用特異性捕獲引物(稱為 "修飾的P5"和"修飾的P7"）。圖2B示例將通用捕獲引物轉化成應用特異性捕獲引物的雜交 和延伸方法。
[0020] 圖3是示例從應用特異性捕獲引物移除應用特異性捕獲區域，因此將應用特異性 捕獲引物轉化成通用捕獲引物的方法的示意圖。
[0021] 圖4是例示在直接的靶捕獲應用中，從捕獲引物中移除靶特異性捕獲區域的方法 的示意圖。
[0022] 圖5是闡明兩種備選的涉及固定的靶多核苷酸的雜交方案的示意圖。圖5A闡明，固 定的靶多核苷酸可與匹配的靶特異性捕獲區域雜交并且支持有效的捕獲引物延伸以復制 靶多核苷酸。圖5B闡明，固定的靶多核苷酸偶爾可與不匹配的靶特異性探針，例如，與其通 用捕獲區域，錯誤雜交。錯誤雜交的靶多核苷酸不能有效地支持捕獲引物延伸。
[0023] 圖6是示例制備用于表面標簽化的流動池的示意圖。
[0024] 圖7是闡明表面標簽化反應的示意圖。
[0025] 圖8顯不在僅具有通用捕獲引物（也稱為標準Illumina?:表面引物）的未修飾的 Illumina?流動池上獲得的DNA測序結果（泳道1，上圖）和在僅具有應用特異性捕獲引物 (也稱為修飾的表面引物P5-ME和P7-ME)的修飾的川umina?流動池上獲得的DNA測序結果 (泳道2,下圖）的比較。
[0026] 圖9顯示表明使用外切核酸酶I從應用特異性捕獲引物有效地移除應用特異性捕 獲區域的實驗的結果。具有轉座子末端區域(ME區域)和通用捕獲區域(P5和P7區域)的應用 特異性捕獲引物被固定在流動池上，與標記的寡核苷酸雜交，并且在Typhoon掃描儀上成 像。流動池的圖像顯不在左側(L1、2、3等等指不泳道1、2、3等等）。顯不對每個流動池泳道的 定量信號的圖顯示在右側。圖9A顯示當流動池與標記的抗P5和抗P7寡核苷酸雜交后的成像 結果。圖9B顯示在后續去除標記的抗P5和抗P7寡核苷酸以及標記的抗ME寡核苷酸與流動池 雜交之后的成像結果。移除標記的抗ME寡核苷酸之后，流動池的泳道3、6、7和8與未標記的 抗P5和抗P7寡核苷酸雜交。然后，對泳道4、5、6和8進行外切核酸酶I處理。移除未標記的抗 P5和抗P7寡核苷酸之后，流動池再次與標記的寡核苷酸雜交。圖9C顯示對于標記的抗P5和 抗P7寡核苷酸的成像結果。圖9D顯示對于標記的抗ME寡核苷酸的成像結果。
[0027]圖10是闡明在表面標簽化實驗中從應用特異性捕獲引物移除轉座子末端區域的 示意圖。
[0028]圖11顯示表面標簽化實驗的結果，比較未移除轉座子末端區域(泳道1，上圖）或通 過外切核酸酶I移除轉座子末端區域(ME區域)之后(泳道2,下圖）觀察到的完全擴增聚簇的 比例。
[0029] 圖12是闡明針對外切核酸酶I的活性自我保護的發夾結構的表面引物的示意圖。 圖12A闡明包括通用捕獲區域(P5和P7)和在其3'末端的轉座子末端區域(ME)的應用特異性 捕獲引物。一些表面引物與轉座子末端寡核苷酸（16-mer)雜交并且結合轉座酶。引物-轉座 酶復合物可以二聚化以形成表面轉座體。未能裝配為轉座體的發夾捕獲引物的轉座子末端 區域，可用外切核酸酶I移除。圖12B闡明具有在約38°C(外切核酸酶I起作用的溫度)是穩定 的，但在60°C (進行橋式擴增的溫度)被破壞的二級結構的捕獲引物。
[0030] 圖13闡明用靶向DNA擴增產物占據模式化的流動池的方法的實例的流程圖；
[0031] 圖14圖示圖13的方法的步驟；
[0032]圖15顯示根據圖13的方法制備的靶向DNA文庫的每泳道的聚簇密度圖；
[0033]圖16闡明制備用于模式化的流動池的靶向DNA擴增產物的方法的實例的流程圖； [0034]圖17圖示圖16的方法的步驟;和
[0035]圖18A和圖18B顯示對于根據圖16的方法制備的珠富集的靶向DNA文庫，每泳道的 簇密度圖和序列度量(sequence metric)的匯總數據表。
[0036] 詳述
[0037]橋式擴增是新一代測序中的一個步驟。橋式擴增依賴于通過固定在固體表面上的 通用捕獲引物捕獲多核苷酸模板。通用捕獲引物不能基于其特定的核酸序列靶向或捕獲特 定的多核苷酸。但是，越來越多的新一代測序應用要求應用特異性多核苷酸的應用特異性 捕獲，和因此在相同表面上固定除了通用捕獲引物以外的應用特異性捕獲引物。
[0038] 例如，越來越多的新一代測序應用要求靶特異性多核苷酸的靶特異性捕獲，和因 此在相同表面上除了通用捕獲引物以外固定靶特異性捕獲引物。在另一個實例中，序列標 簽化應用要求存在通用捕獲引物，并且還存在具有轉座子末端(TE)并且與轉座子末端寡核 苷酸雜交的應用特異性捕獲引物。
[0039] 本公開內容部分地基于以下認識：固體表面上靠近通用捕獲引物的應用特異性捕 獲引物的存在干擾當前的橋式擴增方案。
[0040] 例如，靠近通用捕獲引物的靶特異性捕獲引物的存在干擾橋式擴增。直接的靶捕 獲可通過將特異地與靶多核苷酸，例如，編碼突變的癌基因的多核苷酸，雜交的靶特異性捕 獲引物固定在表面上來實現。在需要在同一流動池上捕獲許多靶多核苷酸(例如，編碼人類 癌基因中已知突變的多個多核苷酸)的應用中，靶特異性捕獲引物必然很多并且多變。固體 支持物上高濃度的靶特異性捕獲引物將使靶捕獲快速、高效和穩健。在靶多核苷酸極其稀 少并且具有低豐度時，例如在靶多核苷酸編碼人類癌基因的體細胞突變的情況下，速度、效 率和穩健性尤其重要。但是，如果支持物上僅存在靶特異性捕獲引物，有效的橋式擴增不能 發生。
[0041] 通常，僅特異性捕獲的靶多核苷酸可以有效地支持橋式擴增。與之相比，與錯配的 捕獲引物錯誤雜交的多核苷酸在支持捕獲引物延伸中可以是無效的。因此，錯配的多核苷 酸可被無效地復制或擴增(參見例如圖5)。因此，如果1，000個不同的靶多核苷酸將被捕獲 到流動池上，并且如果所有的捕獲引物是靶特異性捕獲探針，僅0.1%的捕獲探針可有效地 支持特異靶性分子的橋式擴增，這是無效的。因此，為了確保高效擴增，大量過量的通用捕 獲引物將必須與僅少量的靶特異性捕獲引物在固體支持物上組合。此外，小心地選擇足夠 捕獲靶多核苷酸，但不是太高以至于妨礙后續的擴增步驟的靶特異性捕獲引物的密度將是 必要的。
[0042] 因此，在有效靶捕獲和有效靶擴增之間折中的需要潛在地限制直接捕獲應用的性 能，例如，通過降低靶檢測的靈敏度。此外，次優的靶捕獲和靶擴增將增加方法的結果的噪 音，降低方法的穩健性，并且最終減少直接靶捕獲應用的效用。
[0043] 本公開內容還部分地基于以下認識:可設計應用特異性捕獲引物以包括應用特異 性捕獲區域和通用捕獲區域二者。例如，圖1闡明，應用特異性捕獲引物可被設計為包括在 其5'_末端的通用捕獲區域(更接近固體支持物的部分，顯示為黑色實線)和在其3'-末端的 另外的應用特異性捕獲區域(顯示為具有不同模式的虛線）。應用特異性捕獲區域的性質可 根據應用特異性捕獲引物意圖用于的應用類型而改變。例如，為了捕獲編碼癌基因突變的 靶多核苷酸，該捕獲引物將包括與靶向癌基因突變互補的靶特異性捕獲區域。在另一個實 例中，應用特異性捕獲引物可包括編碼轉座子末端(TE)的應用特異性捕獲區域并且介導表 面標簽化反應(參見，例如，圖6)。
[0044] 本公開內容還部分地基于以下認識:應用特異性捕獲引物可以以若干方式被裝配 在表面上(參見，例如，圖2)。例如，應用特異性捕獲引物可被直接固定到固體表面上(參見， 例如，圖2A，通用捕獲區域顯示為黑色實線，應用特異性捕獲區域顯示為具有不同模式的虛 線）。在另一個實例中，應用特異性捕獲引物可被裝配在固體表面上，例如，通過使用引物雜 交和延伸方法(參見，例如，圖2B)。
[0045] 本公開內容部分地涉及以下驚人發現:應用特異性多核苷酸可與應用特異性捕獲 引物雜交，并且未雜交的應用特異性捕獲引物的應用特異性區域其后可被移除，以將未雜 交的應用特異性捕獲引物轉化成通用引物(參見，例如，圖3、4和6)。
[0046] 本公開內容提供用于修飾固定的捕獲引物的方法和試劑盒。本公開內容的一個好 處是，其使得能夠在新一代測序中有效使用應用特異性捕獲引物。具體地，本公開內容促進 在要求使用應用特異性捕獲引物的先進的新一代測序應用中收集高質量數據。高數據質量 為靶特異性新一代測序在打開寬廣的新應用領域，例如，在疾病診斷和預測中。
[0047] 此外，出人意外地有效的從未雜交的應用特異性捕獲引物移除應用特異性捕獲區 域改善表面標簽化應用的數據質量(錯誤率、靈敏度)和數據數量(計數的簇的數目）二者。 通過促進在新一代測序中的表面標簽化技術，本公開內容有利于自動化和簡單化樣品制備 以及樣品通量的努力。因此，本文提供的方法幫助減少高通量測序技術的成本。此外，本公 開內容預期通過促進罕見遺傳突變的可靠的早期檢測，使患有涉及罕見遺傳突變的疾病的 患者，例如，癌癥患者受益。典型地，越早的疾病檢測轉化成越多數目的治療選擇和改進的 治療效果。
[0048] 必須注意，如在本說明書和所附的權利要求書中使用的，單數形式"一個(a)"、"一 個(an)"和"該(the)"包括復數指代對象，除非內容另有清楚的指示。因此，例如，提及"生物 標記物"包括兩種或更多種生物標記物的混合物等等。
[0049] 特別地在提及給定量時，術語"約"意味著涵蓋正或負百分之五的偏離。
[0050]如本文使用的，術語"包括（includes)"、"包括（including)"、"包括（includes)"、 "包括（including)"、"包含（contains)"、"包含（containing)"和其任何變化形式意圖涵蓋 非排他性包括，諸如包括(includes)、包括(includes)、或包含(contains)要素或要素的列 表的過程、方法、方法限定的產品或物質組合物，不僅包括所述要素，也可包括此類過程、方 法、方法限定的產品或物質組合物未明確列出的或固有的其他要素。
[0051] 如本文使用的，術語"多個"指兩個或更多個成員諸如多核苷酸成員或其他提及的 分子的群體。在一些實施方案中，多個成員的兩個或更多個成員是相同的成員。例如，多個 多核苷酸可包括具有相同核酸序列的兩個或更多個多核苷酸成員。在一些實施方案中，多 個成員的兩個或更多個成員是不同的成員。例如，多個多核苷酸可包括具有不同核酸序列 的兩個或更多個多核苷酸成員。多個包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或100或更多個不同的成員。多個也可包括200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、 1x10 5、2x105、3x105、4x105、5x10 5、6x105、7x105、8x105、9x10 5、1x106、2x106、3x106、4x10 6、 51106、61106、71106、8110 6、91106或11107或更多個不同的成員。多個包括在上面示例多個數 字之間的所有整數。
[0052] 如本文使用的，術語"靶多核苷酸"意指是為分析或作用的目標的多核苷酸。所述 分析或作用包括使多核苷酸經過復制、擴增、測序和/或用于核酸詢問（interrogation)的 其他過程。靶多核苷酸可包括除了待分析的靶序列以外的核苷酸序列。例如，靶多核苷酸可 包括一個或更多個銜接物，包括在待分析的靶多核苷酸序列側翼的作為引物結合位點發揮 功能的銜接物。與捕獲寡核苷酸或捕獲引物雜交的靶多核苷酸可包含以不是所有的靶核苷 酸都可順從延伸的方式，延伸超過捕獲寡核苷酸的5 '或3 '末端的核苷酸。在特別的實施方 案中，如在下面進一步詳細描述的，多個靶多核苷酸包括不同種類，該不同種類在靶多核苷 酸序列上不同但具有對兩個或更多個不同種類是相同的銜接物。在特定靶多核苷酸序列兩 側的兩個銜接物可具有相同的序列或兩個銜接物可具有不同的序列。相應地，多個不同的 靶多核苷酸在靶多核苷酸序列的每個末端可具有相同的銜接物序列或兩個不同的銜接物 序列。因此，在多個靶多核苷酸中的種類可包括要通過例如測序評價的未知序列的區域兩 側的已知序列的區域。在靶多核苷酸在單個末端攜帶銜接物的情況，所述銜接物可位于該 靶多核苷酸的3'末端或5'末端。可使用無任何銜接物的靶多核苷酸，在這種情況下引物結 合序列可直接來自在靶多核苷酸中發現的序列。
[0053] 如本文使用的，術語"捕獲引物"意指具有在例如在擴增或測序反應的引物退火步 驟遇到的條件下，能與待分析或待經過核酸詢問（interrogation)的單鏈多核苷酸序列特 異地退火的核苷酸序列的寡核苷酸。通常，術語"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"在本文可 互換地使用。不同術語不意圖指示在大小、序列或其他性質上的任何特定差異，除非另有具 體地指示。為了描述的簡潔，當描述包括若干核酸種類的特定的方法或組合物時，所述術語 可用于區別一種核酸與另一種核酸。
[0054] 如本文使用的，在提及捕獲引物或其他寡核苷酸時使用的術語"靶特異"意指包括 對靶多核苷酸序列特異的核苷酸序列的捕獲引物或其他寡核苷酸，所述對靶多核苷酸序列 特異的核苷酸序列即能與靶多核苷酸的鑒定區域選擇性退火的核苷酸的序列。靶特異性捕 獲引物可具有單一種類的寡核苷酸，或其可包括兩種或更多種具有不同序列的種類。因此， 所述靶特異性捕獲引物可以是兩種或更多種序列，包括3、4、5、6、7、8、9或10或更多種不同 的序列。靶特異捕獲寡核苷酸可包括靶特異性捕獲引物序列和通用捕獲引物序列。其他的 序列諸如測序引物序列等等也可被包括在靶特異性捕獲引物內。
[0055] 相比之下，在提及捕獲引物或其他寡核苷酸序列時使用的術語"通用"意指在多個 捕獲引物之中具有共同的核苷酸序列的捕獲引物或其他寡核苷酸。共同的序列可以是，例 如，與相同的銜接物序列互補的序列。通用捕獲引物適用于詢問（interrogating)多個不同 的多核苷酸而無需區分不同種類，而靶特異性捕獲引物適用于區分不同的種類。
[0056] 如本文使用的，當提及核酸時使用的術語"固定的"意指經由共價鍵或非共價鍵直 接或間接附接到固體支持物。在本發明的某些實施方案中，可使用共價附接，但是通常地所 有需要的是，核酸保持靜止或在其中意圖使用支持物的條件下，例如，在要求核酸擴增和/ 或測序的應用中，附接至支持物。典型地，待被用作捕獲引物或擴增引物的寡核苷酸是固定 的，使得3'末端對于酶延伸是可用的，并且至少部分的所述序列能與互補序列雜交。固定化 可經由與表面附接的寡核苷酸雜交發生，在這種情況下，固定的寡核苷酸或多核苷酸可呈 3'_5'方向。可選地，固定化可通過除了堿基配對雜交以外的方式發生，諸如上文描述的共 價附接。
[0057] 如本文使用的，術語"轉座體復合物"通常地指非共價地結合至雙鏈核酸的轉座 酶。例如，復合物可以是在支持非共價復合物形成的條件下與雙鏈轉座子DNA預孵育的轉座 酶。雙鏈轉座子DNA可包括但不限于Tn?NA、Tn5DNA的一部分、轉座子末端成分、轉座子末端 成分的混合物或能與轉座酶諸如超活性Tn5轉座酶相互作用的其他雙鏈DNA。
[0058] "轉座酶"指能與含有轉座子末端的成分(例如，轉座子、轉座子末端、轉座子末端 成分)形成功能性復合物且能在例如體外轉座反應中催化含轉座子末端的成分插入或轉座 至與其一起孵育的雙鏈靶DNA的酶。本文呈現的轉座酶也可包括來自逆轉錄轉座子和逆轉 錄病毒的整合酶。轉座酶、轉座體和轉座體復合物通常地是為本領域技術人員所熟知的，如 由US2010/0120098的公開內容所例示的，其內容通過引用全部并入本文。盡管本文描述的 很多實施方案涉及Τη5轉座酶和/或超活性Τη5轉座酶，但是將領會，為了其意圖的目的能以 足夠的效率將轉座子末端插入5'-標簽并片段化靶DNA的任何轉座系統可在本發明中使用。 在特定的實施方案中，優選的轉座系統能以隨機或幾乎隨機的方式將轉座子末端插入至 5 ' -標簽并片段化靶DNA。
[0059] 術語"轉座子末端"（ΤΕ)指僅展現對于與轉座酶或整合酶形成復合物是必要的核 苷酸序列（"轉座子末端序列"）的雙鏈核酸DNA，所述轉座酶或整合酶在體外轉座反應中是 功能性的。在一些實施方案中，轉座子末端能在轉座反應中與轉座酶形成功能性的復合物。 作為非限制性實例，轉座子末端可包括19-bp外末端（"0Ε"）轉座子末端、內末端（"ΙΕ"）轉座 子末端、或被野生型或突變體Tn5轉座酶識別的"嵌合(mosaic)末端"（"ME"）轉座子末端、或 如在US 2010/0120098的公開內容中描述的R1和R2轉座子末端，其內容通過引用全部并入 本文。轉座子末端可包括適于在體外轉座反應中與轉座酶或整合酶形成功能性復合物的任 何核酸或核酸類似物。例如，轉座子末端可包括DNA、RNA、修飾的堿基、非天然堿基、修飾的 骨架，并且可在一條或兩條鏈中包括缺口。盡管貫穿本公開內容與轉座子末端的成分相連 使用術語"DNA"，但是應理解，任何合適的核酸或核酸類似物可在轉座子末端中被使用。
[0060]如本文使用的術語"轉座子末端寡核苷酸"（ΤΕ0)或"轉座子末端區域"（TER)指包 括轉座子末端序列的單鏈核酸DNA。
[0061 ] 術語"轉移鏈(transferred strand)"指兩個轉座子末端的轉移部分。類似地，術 語"非轉移鏈(non-transf erred strand)"指兩個"轉座子末端"的非轉移部分。轉移鏈的 3'_末端在體外轉座反應中被連接或轉移到革E1DNA。展現出與轉移的轉座子末端序列互補的 轉座子末端序列的非轉移鏈，在體外轉座反應中不被連接或轉移至靶DNA。
[0062] 在一些實施方案中，轉移鏈和非轉移鏈被共價地連接。例如，在一些實施方案中， 在單個寡核苷酸上提供轉移鏈序列和非轉移鏈序列，所述單寡核苷酸例如，呈發夾構造。像 這樣，盡管非轉移鏈的游離末端不通過轉座反應直接地連接至靶DNA，但是非轉移鏈變成間 接地附接至DNA片段，因為非轉移鏈通過發夾結構的環連接至轉移鏈。轉座體結構的另外的 實例以及制備和使用轉座體的方法可見于US 2010/0120098的公開內容中，其內容通過引 用全部并入本文。
[0063] 在本文提供的方法和組合物中，捕獲引物被固定至固體支持物上。在一些實施方 案中，捕獲引物可經由將捕獲引物偶聯至固體支持物的接頭分子被固定。當提及將分子(例 如，核酸）固定至固體支持物時，術語"固定"和"附接"在本文是可互換地使用的，并且兩個 術語均意圖涵蓋直接或間接的、共價或非共價的附接，除非另有明確地或通過上下文的指 示。在本發明的某些實施方案中，共價附接是優選的，但是通常地所有需要的是，分子(例 如，核酸)在其中意圖使用支持物的條件下例如在要求核酸擴增和/或測序的應用中，保持 固定或附接至支持物。
[0064] 本發明的某些實施方案可使用包括惰性基底或基質（例如，載玻片、聚合物珠等） 的固體支持物，所述惰性基底或基質已通過例如應用包括活性基團的中間材料的層或包衣 而被功能化，所述活性基團允許共價附接至諸如多核苷酸的生物分子。此類支持物的實例 包括但不限于負載于諸如玻璃的惰性基底上的聚丙烯酰胺水凝膠，特別是W0 2005/065814 和US2008/0280773中描述的聚丙烯酰胺水凝膠，其內容通過引用全部并入本文。在此類實 施方案中，生物分子(例如，多核苷酸)可被直接地共價附接至中間材料(例如，水凝膠），但 是中間材料其自身可被非共價地附接至基底或基質(例如，玻璃基底）。術語"共價附接至固 體支持物"要相應地理解為包括這種排列類型。
[0065] 本文中術語"固體表面"、"固體支持物"和其他語法等同物指適合于或可被改性以 適合用于附接轉座體復合物的任何材料。如本領域人員將領會的，可能的基底的數目是很 巨大的。可能的基底包括但不限于:玻璃和改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸樹脂、 聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon?等）、 多糖、尼龍或硝酸纖維素、陶瓷、樹脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的 硅）、碳、金屬、無機玻璃、塑料、光學纖維束、和很多其他聚合物。對于一些實施方案特別有 用的固體支持物和固體表面位于流動池裝置內。示例性流動池在以下被更詳細地描述。
[0066] 在一些實施方案中，固體支持物包括適于以有序的模式固定捕獲引物的模式化的 表面。"模式化的表面"指在固體支持物的暴露層中或暴露層上不同區域的排列。例如，區域 中的一個或更多個可以是其中存在一個或更多捕獲引物的特征。特征可被其中不存在捕獲 引物的間隙區域分開。在一些實施方案中，模式可以是行和列形式的χ-y格式的特征。在一 些實施方案中，模式可以是特征和/或間隙區域的重復排列。在一些實施方案中，模式可以 是特征和/或間隙區域的隨機排列。在一些實施方案中，捕獲引物在固體支持物上隨機地分 布。在一些實施方案中，捕獲引物分布在模式化的表面上。可在本文描述的方法和組合物中 使用的示例性模式化的表面在美國系列號13/661，524或美國專利申請公布號2012/ 0316086A1中描述，其每個通過引用并入本文。
[0067] 在一些實施方案中，固體支持物包括表面中的孔或凹的陣列。如本領域普遍所知 的，這可利用多種技術被制造，包括但不限于照相平板印刷術、沖壓技術、塑模技術和顯微 蝕刻技術。如將被本領域人員所領會的，使用的技術將取決于陣列基底的組成和形狀。
[0068] 固體支持物的組成和幾何結構可隨其用途而不同。在一些實施方案中，固體支持 物是平面結構，諸如載玻片、芯片、微芯片和/或陣列。像這樣，基底的表面可以是平面層的 形式。在一些實施方案中，固體支持物包括流動池的一個或更多個表面。如本文使用的術語 "流動池"指包括固體表面的室，一種或更多種流體試劑可流動穿過所述室。可在本公開內 容的方法中容易地使用的流動池和相關流體系統和檢測平臺的實例被描述于例如， Bentley等人，Nature 456:53-59(2008) ;W0 04/018497;US 7,057,026;W0 91/06678;W0 07/123744;US 7,329,492;US 7,211，414;US 7,315,019;US 7,405,281和US 2008/ 0108082中，其每個通過引用并入本文。
[0069] 在一些實施方案中，固體支持物或其表面是非平面的，諸如管或容器的內表面或 外表面。在一些實施方案中，固體支持物包括微球或珠。本文中"微球"或"珠"或"顆粒"或語 法上的等同物是指小的離散顆粒。合適的珠成分包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、 甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、順磁材料、二氧化釷溶膠、碳石墨、二氧化鈦、乳膠或交聯葡聚 糖諸如Sepharose、纖維素、尼龍、交聯膠束和teflon，以及本文概述用于固體支持物的任何 其他材料可全部被使用。來自Bangs Laboratories, Fishers Ind.的"微球檢測指南 (Microsphere Detection Guide)"是有用的指南。在某些實施方案中，微球為磁性微球或 珠。
[0070] 珠不必是球形的；不規則顆粒可被使用。可選地或另外的，珠可以是多孔的。珠大 小范圍從納米，例如，l〇〇nm，至毫米例如1mm，從約0.2微米至約200微米的珠是優選的，并且 從約0.5至約5微米的珠是特別優選的，盡管在一些實施方案中，更小或更大的珠可被使用。
[0071] 本文提供修飾固定的捕獲引物的方法，包括a)提供具有固定的應用特異性捕獲引 物的固體支持物，該應用特異性捕獲引物包括i)包括應用特異性捕獲區域的3'部分和ii) 包括通用捕獲區域的5'部分;b)在對于雜交足夠的條件下，將應用特異性多核苷酸與該應 用特異性捕獲引物接觸，以產生固定的應用特異性多核苷酸，和c)移除未與應用特異性多 核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域，以將未雜交的應用特異性捕獲 引物轉化成通用捕獲引物。
[0072] 在一方面，本公開內容提供修飾固定的捕獲引物的方法，包括:a)提供具有固定的 應用特異性捕獲引物的固體支持物，所述應用特異性捕獲引物包括：i)包括靶特異性捕獲 區域的3'部分和ii)包括通用捕獲區域的5'部分;b)在對于雜交足夠的條件下，將靶多核苷 酸與該應用特異性捕獲引物接觸，以產生固定的靶特異性多核苷酸，c)延伸雜交的應用特 異性捕獲引物以產生與固定的靶特異性多核苷酸互補的固定的延伸產物;d)在對于寡核苷 酸與固定的應用特異性捕獲引物的通用捕獲區域雜交足夠的條件下，施加寡核苷酸;e)在 對于核酸酶足夠的條件下，將固定的應用特異性捕獲引物與核酸酶接觸，以去除未與靶多 核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物的靶特異性捕獲區域，以將未雜交的應用特異性捕獲引 物轉化成通用捕獲引物;f)從固定的應用特異性捕獲引物移除寡核苷酸;g)將通用捕獲引 物與固定的延伸產物退火;h)通過PCR擴增固定的延伸產物以產生多個固定的擴增子;和i) 對多個固定的擴增子測序，其中測序包括橋式擴增步驟。
[0073] 在另一個方面，本公開內容提供修飾固定的多核苷酸捕獲引物的方法，包括:a)提 供具有固定的應用特異性捕獲引物的固體支持物，所述應用特異性捕獲引物包括：i)包括 轉座子末端(TE)區域的3'部分和ii)包括通用捕獲區域的5'部分;b)在對于雜交足夠的條 件下，將轉座子末端寡核苷酸(ΤΕ0)與應用特異性捕獲引物接觸，以產生固定的TE區域-ΤΕ0 雜合體;c)將轉座酶結合到TE區域-ΤΕ0雜合體以產生支持物結合的轉座體復合物;d)在其 中支持物結合的轉座體復合物將在應用特異性捕獲引物的TE區域的3'-末端（"轉移鏈"）連 接到靶多核苷酸的條件下，將支持物結合的轉座體復合物與靶多核苷酸接觸，以產生固定 的革巴多核苷酸;e)從固體支持物移除轉座酶和ΤΕ0; g)延伸固定的革E1多核苷酸的3 ' -末端;h) 在對于寡核苷酸與在固定的應用特異性捕獲引物中的通用捕獲區域雜交足夠的條件下，施 加寡核苷酸;i)在對于核酸酶足夠的條件下，將應用特異性捕獲引物與核酸酶接觸，除去未 與ΤΕ0雜交的應用特異性捕獲引物的TE區域，以將應用特異性捕獲引物轉化成通用捕獲引 物;j)從通用捕獲引物移除寡核苷酸;k)通過PCR擴增固定的靶多核苷酸以產生多個固定的 擴增子;1)對多個固定的擴增子測序，其中測序包括橋式擴增步驟。
[0074] 在一些實施方案中，該應用特異性捕獲區域包括靶特異性捕獲區域且應用特異性 多核苷酸包括靶多核苷酸。
[0075] 在一些實施方案中，該應用特異性捕獲區域包括轉座子末端(TE)區域且應用特異 性多核苷酸包括TE寡核苷酸。
[0076] 在一些實施方案中，本公開內容的方法還包括在執行步驟c)之前，在對于寡核苷 酸與應用特異性捕獲引物的通用捕獲區域雜交足夠的條件下，施加寡核苷酸，以產生雙鏈 DNA區域。在某些實施方案中，在執行步驟b)之前，例如，在產生固定的應用特異性多核苷酸 之前，施加寡核苷酸。在某些其他的實施方案中，在完成步驟b)之后，例如，在產生固定的靶 特異多核苷酸之后，施加寡核苷酸。
[0077] 在某些實施方案中，寡核苷酸可與Illuinina⑩捕獲引物P 5 ( 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGA-3 '）或P7 (5 ' -CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 '）雜交。在某些實施方案 中，寡核苷酸是Illumin_)捕獲引物P5 ( "抗-P5" ： 5 '-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3 '）或P7 ("抗-P7" ：5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'）的反向互補物。在某些實施方案中，寡核苷酸可 與 niumina? 捕獲引物P5 (雙端）（5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC- '）或P7 (雙端） (5 ' -CAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-〇x〇-G)AT-3 '）雜交。在某些實施方案中，寡核苷酸可與 Illumina?捕獲引物P5(雙端）（"抗_P5(雙端)" ：5'-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'） 或P7(雙端）（"抗-P7(雙端)" ：5 '-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3 '）的反向互補物雜交。
[0078] 本公開內容的捕獲引物可以是通用捕獲引物或應用特異性捕獲引物。在一些實施 方案中，通用捕獲引物包括已知的序列。在某些實施方案中，已知的序列是Illumina?捕獲 引物P5和P7的序列（參見，例如，圖1;通用捕獲引物顯示為黑色箭頭）。
[0079] 應用特異性捕獲引物包括i)包括應用特異性捕獲區域的3'部分和ii)包括通用捕 獲區域的5'部分(參見，例如，圖1;通用捕獲區域由P5和P7區域例示，顯示為黑色實線;應用 特異性捕獲區域顯示為具有不同模式的虛線）。本公開內容的應用特異性捕獲引物與應用 特異性多核苷酸雜交。在一些實施方案中，應用特異性多核苷酸是轉座子末端(TE)寡核苷 酸(ΤΕ0;例如，嵌合末端寡核苷酸(ΜΕ0))。在一些實施方案中，應用特異性多核苷酸是靶多 核苷酸。在一些實施方案中，靶多核苷酸呈其野生型形式。在一些實施方案中，靶多核苷酸 呈其突變體形式。在一些實施方案中，靶多核苷酸編碼多肽。在一些實施方案中，靶多核苷 酸編碼癌基因。在一些實施方案中，靶多核苷酸編碼生物標志物(例如，疾病標志物）。
[0080] 在一些實施方案中，捕獲引物具有發夾結構(參見，例如，圖12)。
[0081] 在一些實施方案中，本公開內容的方法包括提供具有固定的應用特異性捕獲引物 的固體支持物。在一些實施方案中，提供固體支持物包括將應用特異性捕獲引物固定到固 體支持物上。
[0082]圖2A和圖2B大體闡明可如何固定應用特異性捕獲引物的一種構造。
[0083]在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物被直接固定到固體支持物上。為了這些 實施方案的目的，"直接"意味著，在其固定化之前，合成應用特異性捕獲引物，與從固體支 持物上的不同部分被裝配不同。
[0084]圖2A大體上闡明根據一個實施方案，應用特異性捕獲引物(在圖2A中稱為"修飾的 P7"和"修飾的P5"）可如何被直接固定到表面上(通用捕獲區域顯示為黑色實線;應用特異 性捕獲區域顯示為呈不同模式的虛線）。
[0085]在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物以一步或更多步被裝配到固體支持物 上。在一些實施方案中，固定應用特異性捕獲引物包括將通用捕獲引物固定到固體支持物 上。在某些實施方案中，所述方法還包括將固定的通用捕獲引物轉化成應用特異性捕獲引 物。在某些實施方案中，所述方法還包括將夾板(splint)寡核苷酸與通用捕獲引物退火，其 中所述夾板寡核苷酸包括與應用特異性捕獲引物的通用區域互補的通用區域和與在應用 特異性核苷酸中的應用特異性區域互補的應用特異性區域。在某些實施方案中，所述方法 還包括延伸通用捕獲引物以產生應用特異性捕獲引物。
[0086]圖2B大體上闡明根據一個實施方案，使用引物雜交和延伸方法，可如何修飾固體 支持物諸如流動池以裝配應用特異性捕獲引物(通用捕獲區域顯示為黑色實線;應用特異 性捕獲區域顯示為呈不同模式的虛線）。
[0087] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物與其他應用特異性捕獲引物被聯合固 定。在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物包括多個應用特異性捕獲引物。在一些實施方 案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物是相同的應用特異性捕獲引物。 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物是不同的應用特異 性捕獲引物。
[0088] 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物具有相同 的通用捕獲區域。在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物 具有不同的通用捕獲區域。
[0089] 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物具有相同 的應用特異性捕獲區域。在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕 獲引物具有不同的應用特異性捕獲區域。
[0090] 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物僅包括一個成員。在一些實施方案 中，一個應用特異性捕獲引物包括通用捕獲區域和靶特異性捕獲區域。在一些實施方案中， 一個應用特異性捕獲引物包括通用捕獲區域和轉座子末端序列。
[0091] 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物包括兩個不同的應用特異性捕獲引 物。在一些實施方案中，每個應用特異性捕獲引物包括兩個通用捕獲區域的一個，例如P5區 域或P7區域，并且每個包含相同的應用特異性區域。在一些實施方案中，相同的應用特異性 區域是靶特異性捕獲區域。在一些實施方案中，相同的應用特異性區域是靶-末端區域。
[0092] 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物包括多于兩個不同的應用特異性捕 獲引物。在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物，每個包括 相同的通用捕獲區域，例如，P5區域或P7區域，并且每個包括不同的應用特異性捕獲區域。 在一些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物，每個包括兩個通 用捕獲區域的一個，例如P5區域或P7區域，并且每個包括不同的應用特異性捕獲區域。在一 些實施方案中，多個應用特異性捕獲引物中的應用特異性捕獲引物，每個包括兩個或更多 個通用捕獲區域的一個，例如，P5區域或P7區域，并且每個包括不同的應用特異性捕獲區 域。在一些實施方案中，具有不同的應用特異性捕獲區域的多個應用特異性捕獲引物可包 括多于 10、100、1，〇〇〇、10，〇〇〇、100,000、1，〇〇〇,〇〇〇 或 10，〇〇〇,〇〇〇 個不同的成員。在一些實 施方案中，不同的應用特異性捕獲區域是靶特異性捕獲區域。在一些實施方案中，不同的應 用特異性捕獲區域是轉座子末端區域。
[0093] 在一些實施方案中，應用特異性多核苷酸是多個應用特異性多核苷酸。在一些實 施方案中，在多個應用特異性多核苷酸中的應用特異性多核苷酸是相同的應用特異性多核 苷酸。在一些實施方案中，在多個應用特異性多核苷酸中的應用特異性多核苷酸是不同的 應用特異性多核苷酸。
[0094] 在一些實施方案中，靶多核苷酸是多個靶多核苷酸。在一些實施方案中，多個靶多 核苷酸中的靶多核苷酸是相同的靶多核苷酸。在一些實施方案中，多個靶核苷酸中的靶多 核苷酸是不同的靶多核苷酸。
[0095] 在一些實施方案中，靶多核苷酸包括在多個不同的靶多核苷酸之間保守的區域。 在一些實施方案中，多個不同的靶多核苷酸包括基因家族(例如，HLA基因家族）的成員。在 一些實施方案中，多個不同的靶多核苷酸包括疾病標志物的多個突變的變體。在一些實施 方案中，多個不同的靶多核苷酸包括基因，例如，癌基因，的多個突變的變體。
[0096] 在一些實施方案中，轉座子末端寡核苷酸是多個轉座子末端寡核苷酸。在一些實 施方案中，多個轉座子末端寡核苷酸中的轉座子末端寡核苷酸是相同的轉座子末端寡核苷 酸。在一些實施方案中，多個轉座子末端寡核苷酸中的轉座子末端寡核苷酸是不同的轉座 子末端寡核苷酸。
[0097] 在本公開內容的一些實施方案中，固定的應用特異性捕獲引物包括多個固定的應 用特異性捕獲引物。在一些實施方案中，應用特異性多核苷酸包括多個應用特異性多核苷 酸。在一些實施方案中，多個應用特異性多核苷酸包括多個靶多核苷酸。在一些實施方案 中，多個應用特異性多核苷酸包括多個TE區域。
[0098] 在一些實施方案中，基本上所有固定的捕獲引物是應用特異性捕獲引物。在其他 的實施方案中，應用特異性捕獲引物與通用捕獲引物被聯合固定。在一些實施方案中，過量 的應用特異性捕獲引物被固定。在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物超過通用捕獲引 物的過量是大于2:1、3:1、5:1、10:1、50:1、100:1、500:1、1，000:1、10,000:1、50,000:1 或 100,000:1。在一些實施方案中，過量的通用捕獲引物被固定。在一些實施方案中，通用捕獲 引物超過應用特異性捕獲引物的過量是大于2:1、3 :1、5 :1、10 :1、50 :1、100 :1、500 :1、1， 000:1、10，000:1、50，000:1或100，000:1。
[0099] 本公開內容的方法包括移除未雜交的應用特異性捕獲引物的一些或所有的應用 特異性捕獲區域。應用特異性捕獲區域可通過任何化學方法（例如，使用金屬-有機復合 物）、生物化學方法(例如，使用酶）、或物理方法(例如，使用輻射、原子力鑷、光鑷)或任何本 領域已知的用于從較大的寡核苷酸或多核苷酸移除單鏈未雜交的寡核苷酸或多核苷酸部 分的方法來移除。
[0100] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲區域被生物分子移除。本公開內容的生物分 子包括但不限于酶、抗體(例如，催化抗體)或適體。
[0101 ]在一些實施方案中，該生物分子是核酸酶。在一些實施方案中，該核酸酶為外切核 酸酶。該外切核酸酶可以是5 '到3 '外切核酸酶、3 '到5 '外切核酸酶或po ly (A)特異的3 '到5 ' 外切核酸酶。外切核酸酶可包括任何具有外切核酸酶活性的蛋白或蛋白結構域，例如DNA聚 合酶I。在某些實施方案中，外切核酸酶是外切核酸酶I。在某些實施方案中，外切核酸酶是 外切核酸酶II。在某些實施方案中，外切核酸酶是外切核酸酶III。在某些實施方案中，外切 核酸酶是外切核酸酶IV。在某些實施方案中，外切核酸酶是外切核酸酶V。
[0102] 在一些實施方案中，核酸酶為內切核酸酶。在某些實施方案中，內切核酸酶是限制 性內切核酸酶。限制性內切核酸酶可以是I型酶(EC3.1.21.3)、II型酶(EC 3.1.21.4)、III 型酶(EC 3.1.21.5)、或IV型酶(EC3.1.21.5)。限制性內切核酸酶可包括，例如，但不限于 Alu I、Ava I、Bam HI、Bgl II、Eco P15I、Eco RI、Eco RII、Eco RV、Hae III、Hga I、Hha I、 Hind III、Hinf I、Hpa I、Kpn I、Mbo I、Not I、Pst I、Pvu II、Sac I、Sal I、Sau 3A、Sca I、Sma I、Spe I、Sph I、Sst I、Stu I、Taq I、Xba I或Xma L·限制性內切核酸酶可以是重組 的限制性酶。重組限制性酶可包括但不限于，包括天然的或改造的DNA結合結構域(例如，鋅 指結構域、TAL效應物結構域)和核酸酶結構域(例如，IIS型限制性酶Fokl的裂解結構域)的 融合蛋白。
[0103] 生物分子可衍生自任何表達各生物分子的任何生物體，包括真核生物（例如，植 物、昆蟲、哺乳動物)和原核生物。在某些實施方案中，生物分子衍生自真細菌(例如，革蘭氏 陽性、革蘭氏陰性）、古細菌、酵母菌、真菌、藻類。原核生物可包括，例如，但不限于藤黃節桿 菌（Arthrobacter luteus)、多變魚腥藻（Anabaena variabi 1 is )、解淀粉芽抱桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、球芽抱桿菌（Bacillus globigii)、大腸桿菌RY 13 (Escherichia coli RY 13)、大腸桿菌R245(Escherichia coli R245)、埃及嗜血桿菌 (Haemophilus aegyptius)、溶血性嗜血桿菌（Haemophilus haemolyticus)、流感嗜血桿菌 Rd(Haemophilus inflenzae Rd)、禽嗜血桿菌（Haemophilus gallinarum)、副流感嗜血桿 菌(Haemophilus parainflenzae)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumonia)、牛莫拉氏桿 菌(Moraxella bovis)、Nocardia otitidis、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、斯氏普羅 威登斯菌(Providencia stuartii)、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)、浮游球衣菌 (Sphaerotilus natans)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、產色鏈霉菌 (Streptomyces achromogenes)、白色鏈霉菌G(Streptomyces albus G)、頭狀鏈霉菌 (Streptomyces caespitosus)、Streptomyces Stanford、殺結核鏈霉菌（Streptomyces tubercidicus)、暗色產色鏈霉菌（Streptomyces phaeochromogenes)、水生棲熱菌 (Thermophi lus aquaticus)、巴氏黃單胞菌（Xanthamonas badri i )或Xanthamonas malvacearum〇
[0104] 生物分子可以是野生型形式或突變體形式。生物分子可以是重組生物分子。
[0105] 在一些實施方案中，所述方法還包括將應用特異性捕獲引物與核酸酶接觸，其中 應用特異性捕獲區域被核酸酶移除。在一些實施方案中，所述方法還包括將應用特異性捕 獲引物與核酸酶接觸，其中應用特異性捕獲引物具有靶特異性捕獲區域并且該靶特異性捕 獲區域被核酸酶移除。
[0106] 在一些實施方案中，所述核酸酶為外切核酸酶。在一些實施方案中，所述外切核酸 酶是外切核酸酶I。
[0107] 圖3大體上闡明本公開內容的實施方案(還參見實施例1)。上圖顯示固定到固體支 持物的應用特異性捕獲引物。所述應用特異性捕獲引物包含接近表面的通用捕獲區域 ("P5"或"P7"，顯示為黑色實線）。應用特異性捕獲區域存在于捕獲引物的3'末端(顯示為具 有不同模式的虛箭頭）。在一些實施方案中，應用特異性捕獲區域是靶特異性捕獲區域。應 用特異性捕獲區域可與應用特異性多核苷酸(例如，轉座子末端寡核苷酸(ΤΕ0))或靶多核 苷酸諸如基因組DNA片段雜交。根據圖3的方法，應用特異性捕獲引物的通用捕獲區域被與 互補的寡核苷酸(例如，"抗P5"或"抗P7"）雜交以形成雙鏈DNA區段。捕獲引物的應用特異性 區域保持未雜交(例如，單鏈），并且用外切核酸酶I移除。移除應用特異性區域將應用特異 性捕獲引物轉化成通用捕獲引物。
[0108] 在一些實施方案中，本公開內容的方法還包括在執行步驟c)之前，在對于寡核苷 酸與應用特異性捕獲引物的靶特異性捕獲區域雜交足夠的條件下施加寡核苷酸，以產生雙 鏈DNA區域。在某些實施方案中，在執行步驟b)之前，例如，在產生固定的應用特異性多核苷 酸之前，施加寡核苷酸。在某些其他的實施方案中，在完成步驟b)之后，例如，在產生固定的 靶特異性多核苷酸之后，施加寡核苷酸。在一些實施方案中，所述方法還包括將應用特異性 捕獲引物與核酸酶接觸，其中雙鏈DNA被核酸酶移除。在某些實施方案中，所述核酸酶是外 切核酸酶III。在某些實施方案中，寡核苷酸與轉座子末端區域雜交。在某些實施方案中，寡 核苷酸與靶特異性捕獲區域雜交。在某些實施方案中，寡核苷酸是多個寡核苷酸。在某些實 施方案中，多個寡核苷酸與固定在固體支持物上的應用特異性捕獲引物的一些或所有靶特 異性捕獲區域雜交(例如，多于1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 99%)。
[0109] 在本公開內容的方法中，移除應用特異性捕獲區域可包括移除一些或所有的應用 特異性捕獲區域。在一些實施方案中，所有的應用特異性捕獲區域被移除（100% )。在一些 實施方案中，少于5%、10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99% 的應用特 異性捕獲區域被移除。
[0110] 在一些實施方案中，所述方法還包括移除一些或所有的通用捕獲區域。在一些實 施方案中，所有的通用捕獲區域被移除（100 % )。在一些實施方案中，少于5 %、10%、20 %、 30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的通用捕獲區域被移除。在一些實施方案 中，所述方法包括將應用特異性捕獲引物與核酸酶接觸，其中通用捕獲區域被核酸酶移除。 在某些實施方案中，所述核酸酶是外切核酸酶I。在某些實施方案中，所述核酸酶是外切核 酸酶III。
[0111] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲引物還包括包含限制位點的部分。限制位點 可通過限制性內切核酸酶裂解。在某些實施方案中，所述限制位點長4-8堿基對。在某些實 施方案中，所述限制位點是回文序列（例如被EcoRI裂解的限制位點，GAATTC)。在某些實施 方案中，所述限制位點位于應用特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域和通用捕獲區域之 間。
[0112] 在一些實施方案中，所述方法還包括將應用特異性捕獲引物與限制性內切核酸酶 接觸，其中所述應用特異性捕獲引物包括限制位點。在一些實施方案中，所述限制性內切核 酸酶裂解所述限制位點。在一些實施方案中，所述限制性內切核酸酶移除應用特異性捕獲 引物的應用特異性區域。
[0113] 在一些實施方案中，應用特異性捕獲區域被從基本上一些或所有固定的應用特異 性捕獲引物移除。在一些實施方案中，應用特異性捕獲區域被從多于5 %、10 %、20 %、30 %、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %的固定的應用特異性捕獲引物移除。在一些 實施方案中，基本上所有固定的捕獲引物是應用特異性捕獲引物，并且應用特異性捕獲區 域被從基本上所有應用特異性捕獲引物移除。在一些實施方案中，基本上所有應用特異性 捕獲引物被轉化成通用捕獲引物。
[0114]在一些實施方案中，本公開內容的方法在靶捕獲應用中使用。圖4大體上闡明在直 接靶捕獲中的使用。上圖顯示合適用于靶捕獲的流動池。在該流動池中，所有應用特異性捕 獲引物在其3'末端具有靶特異性捕獲區域。每個顯示的捕獲引物靶向不同的靶多核苷酸 (如被在3'末端的具有不同模式的虛線指示）。多個靶多核苷酸，例如片段化的基因組DNA， 在流動池內部流動。靶多核苷酸通過與靶特異性捕獲引物匹配被捕獲。不是靶的多核苷酸 被洗掉。隨后是第一輪的DNA聚合作用（第1鏈延伸），據此靶分子被復制并且從單鏈靶多核 苷酸轉化成雙鏈DNA。在一些實施方案中，隨后是第一個循環的橋式擴增(如在例如，圖4中 顯示的）。然后，抗P5和抗P7寡核苷酸與捕獲引物的通用捕獲區域P5和P7雜交，以產生雙鏈 區域。在下一步，未雜交的捕獲引物的靶特異性捕獲區域通過外切核酸酶I被移除，而呈其 雙鏈構造的通用捕獲區域被保護。移除抗P5和抗P7寡核苷酸之后，固定的靶多核苷酸可通 過橋式擴增被進一步擴增和測序。
[0115] 在一些實施方案中，該應用特異性捕獲區域包括靶特異性捕獲區域且應用特異性 多核苷酸包括靶多核苷酸。在一些實施方案中，所述方法還包括延伸與靶多核苷酸雜交的 應用特異性捕獲引物的靶特異性捕獲區域，以產生與靶多核苷酸互補的固定的延伸產物。 在一些實施方案中，所述方法包括將通用捕獲引物與固定的延伸產物退火。在一些實施方 案中，所述方法包括通過PCR擴增固定的延伸產物以產生多個固定的擴增子。在一些實施方 案中，所述方法包括對所述多個固定的擴增子測序。在一些實施方案中，測序包括橋式擴增 步驟。
[0116] 在一些實施方案中，本公開內容的方法在表面標簽化應用中使用。標簽化實驗的 大體設計顯示在圖10中。首先，使用引物雜交和延伸方法將轉座子末端區域(例如，ME)添加 到通用捕獲引物的3'末端。下一步，轉座子末端寡核苷酸與轉座子末端區域雜交，以形成雙 鏈轉座子末端。轉座酶結合到轉座子末端，因此產生表面轉座體。在一些實施方案中，轉座 酶結合到所有雙鏈轉座子末端。在其他的實施方案中，轉座酶結合到少于所有的雙鏈轉座 子末端（例如，少于 99%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或 1 % )。靶多核苷酸被直接標簽化到表面上。標簽化的靶多核苷酸包括例如基因組DNA。標簽 化包括將延伸的通用引物的3'-鏈與靶多核苷酸鏈連接，因此固定靶多核苷酸。在一些實施 方案中，轉座酶復合物和轉座子末端寡核苷酸被移除，并且隨后是一輪的祀多核苷酸延伸 (參見，例如，圖10)。捕獲引物的通用捕獲區域(例如，P5和P7區域)通過與互補的寡核苷酸 (抗P5和抗P7)雜交將這些區域轉化成雙鏈被保護免于外切核酸酶消化。單鏈轉座子末端區 域被用外切核酸酶I移除。進行橋式擴增并且準備得到的靶多核苷酸簇用于測序。
[0117] 在一些實施方案中，該應用特異性捕獲區域包括轉座子末端(TE)區域且應用特異 性多核苷酸包括TE寡核苷酸。在一些實施方案中，所述方法還包括在執行步驟b)之后和執 行步驟c)之前，將轉座酶結合到TE區域-TE寡核苷酸(ΤΕ0)雜合體以產生支持物結合的轉座 體復合物。在一些實施方案中，所述方法還包括在其中支持物結合的轉座體復合物連接在 應用特異性捕獲引物的TE區域的3'-末端（"轉移鏈"）到靶多核苷酸的條件下，將支持物結 合的轉座體復合物與靶多核苷酸接觸，以產生固定的靶多核苷酸。在一些實施方案中，所述 方法還包括延伸固定的靶多核苷酸的3'-末端。在一些實施方案中，所述方法還包括從固體 支持物移除轉座酶和ΤΕ0。在一些實施方案中，所述方法還包括延伸固定的靶多核苷酸的 3'-末端。在一些實施方案中，所述方法還包括通過PCR擴增固定的靶多核苷酸以產生多個 固定的擴增子。在一些實施方案中，所述方法還包括對所述多個固定的擴增子測序。在一些 實施方案中，測序包括橋式擴增。
[0118] 在一些實施方案中，相對于其中未進行本公開內容的方法的對照，本公開內容的 方法改進在直接靶捕獲應用或在表面標簽化應用中的測序數據質量或測序數據數量（參 見，例如，實施例1I)。在一些實施方案中，所述方法降低錯配率百分比（PF%;純度過濾器 (pruity f ilter))。在某些實施方案中，在表面標簽化應用中的錯配率％少于0.6%、 0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或更少。在一些實施方案中，所述方法增加高于030的堿基的百 分比（大于1/1，〇〇〇的堿基正確的概率）。在某些實施方案中，在表面標簽化應用中高于Q30 的堿基的百分比大于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或更多。在一些實施方案中， 所述方法增加 PF簇的百分比(PF%，穿過最小信號閾值的簇的數目）。在某些實施方案中，所 述方法增加在表面標簽化應用中PF簇的百分比到大于70%、75%、80%、85%或更多。在一 些實施方案中，所述方法增加對齊讀段的百分比(對齊(PF) % )。在某些實施方案中，所述方 法增加對齊讀段的百分比到大于70%、75%、80%、85%或90%。
[0119] 本公開內容還涉及根據本文提供的方法產生的固定的核酸片段的擴增。固定的核 酸片段可包括，例如，與作為直接捕獲應用的部分捕獲的靶多核苷酸互補的固定的延伸產 物。在另一個實例中，固定的核酸片段可包括，在標簽化應用的過程中固定的靶多核苷酸。 固定的核酸片段可根據本領域已知的任何合適的擴增方法被擴增。在一些實施方案中，在 固體支持物上擴增固定的核酸片段。在一些實施方案中，固體支持物與其上發生表面結合 的標簽化的固體支持物是同一固體支持物。在此類實施方案中，本文提供的方法和組合物 允許從最初的樣品引入步驟至擴增且任選地至測序步驟，樣品制備在同一固體支持物上進 行。
[0120] 例如，在一些實施方案中，固定的核酸片段使用簇擴增方法來擴增，如由美國專利 號7,985,565和7，115,400的公開內容所例示的，其每個的內容通過引用以全文并入本文。 美國專利號7，985，565和7，115，400的并入的材料描述了固相核酸擴增的方法，其允許擴增 產物被固定在固體支持物上，以形成包括固定的核酸分子的簇或"集群"的陣列。在此類陣 列上的每個簇或集群從多個相同的固定的多核苷酸鏈和多個相同的固定的互補多核苷酸 鏈形成。如此形成的陣列本文中通常地被稱作"成簇的陣列"。固相擴增反應的產物諸如在 美國專利號7，985,565和7,115,400中描述的那些，是通過固定的多核苷酸鏈和固定的互補 的鏈的對的退火形成的所謂的"橋接的"結構，兩種鏈在5'末端被固定在固體支持物上，優 選地經由共價附接。簇擴增方法是其中固定的核酸模板被用來產生固定的擴增子的方法的 實例。其他合適的方法也可被用來從根據本文提供的方法產生的固定的核酸片段產生固定 的擴增子。例如，一個或更多個簇或集群可經由固相PCR來形成，每對擴增引物中的一個或 兩個引物是被固定的。
[0121] 在其他的實施方案中，在溶液中擴增固定的核酸片段。例如，在一些實施方案中， 固定的核酸片段被裂解或者以其他方式從固體支持物釋放，并且然后擴增引物在溶液中與 釋放的分子雜交。在其他的實施方案中，對于一個或更多個初始擴增步驟，擴增引物被與固 定的核酸片段雜交，然后是在溶液中的隨后擴增步驟。因此，在一些實施方案中，固定的核 酸模板可被用來產生溶液相擴增子。
[0122] 將領會的是，本文描述的或本領域一般已知的任何擴增方法可與通用引物或靶特 異性引物一起使用以擴增固定的核酸片段。用于擴增的合適的方法包括但不限于聚合酶鏈 式反應(PCR)、鏈置換擴增(SDA)、轉錄介導的擴增(TMA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)，如 在美國專利號8,003,354中描述的，其通過引用以其全文并入本文。以上擴增方法可被用來 擴增一個或更多個感興趣的核酸。例如， PCR，包括多重?〇?、5以、11^、嫩584等可被用來擴增 固定的DNA片段。在一些實施方案中，將特異地針對感興趣的核酸的引物包括在擴增反應 中。
[0123] 用于核酸擴增的其他合適方法可包括寡核苷酸延伸和連接技術、滾環擴增(RCA) 技術(Lizardi等人，Nat .Genet. 19: 225-232(1998)，其通過引用并入本文)和寡核苷酸連接 測定(〇1^)技術(通常參見美國專利號7,582,420、5，185,243、5,679,524和5,573,907$卩0 320 308B1;EP 0 336 731B1;EP0 439 182B1;TO 90/01069;TO 89/12696和TO 89/09835， 其全部通過引用并入本文）。將領會，這些擴增方法可被設計為擴增固定的核酸片段。例如， 在一些實施方案中，擴增方法可包括連接探針擴增或寡核苷酸連接測定(0LA)反應，其包括 特異地針對感興趣的核酸的引物。在一些實施方案中，擴增方法可包括引物延伸-連接反 應，其包括特異地針對感興趣的核酸的引物。作為引物延伸和可被特異地設計為擴增感興 趣的核酸的連接引物的非限制性實例，擴增可包括用于GoldenGate測定anil:minail，Inc.， San Diego，CA)的引物，如由美國專利號7,582,420和7,611,869所例示的，其每個通過引用 以其全文并入本文。
[0124] 可在本公開內容的方法中使用的示例性等溫擴增方法包括但不限于多重置換擴 增(MDA)，如由例如Dean等Proc.Natl .Acad. Sci.USA99:5261-66(2002)所例示的，或等溫鏈 置換核酸擴增，由例如美國專利號6,214,587所例證的，其每個通過引用以其全文并入本 文。可在本公開內容中使用的其他的非基于PCR的方法包括例如鏈置換擴增(SDA)，其在例 如Walker等Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press，Inc ·，1995;美國 專利號5,455,166和5,130,238,以及Walker等Nucl.Acids Res .20:1691-96( 1992)中被描 述;或超支化鏈置換擴增，其在例如Lage等Genome Research 13:294-307(2003)中被描述， 其每個通過引用以其全文并入本文。等溫擴增方法可與用于基因組DNA的隨機引物擴增的 鏈置換Phi29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段5'->3'外切酶一起使用。這些聚合酶的使用利 用其高的持續合成能力和鏈置換活性。高的持續合成能力允許聚合酶產生長10_20kb的片 段。如以上描述的，可在等溫條件下使用具有低的持續合成能力和鏈置換活性的聚合酶諸 如Klenow聚合酶產生較小的片段。在美國專利號7,670,810的公開內容中詳細描述了擴增 反應、條件和組分的另外的描述，其通過引用以其全文并入本文。
[0125] 在本公開內容中有用的另一種核酸擴增方法是加標簽的PCR，其使用具有恒定的 5'區域接著是隨機的3'區域的多個雙域引物，例如在Grothues等Nucleic Acids Res.21 (5) :1321-2(1993)中描述的，通過引用以其全文并入本文。進行第一輪擴增以允許基于從 隨機合成的3'區域單獨雜交的對熱變性的DNA的大量起始。由于3'區域的性質，所以起始位 點預期是遍及基因組隨機的。其后，未結合的引物可被移除并且進一步的復制可使用與恒 定的5'區域互補的引物發生。
[0126] 本公開內容還涉及根據本文提供的方法產生的固定的靶多核苷酸的測序。例如由 表面結合的轉座體介導的標簽化或直接靶捕獲產生的固定的靶多核苷酸可根據任何合適 的測序方法而被測序，所述測序方法諸如直接測序，包括合成測序、連接測序、雜交測序、納 米孔測序等。在一些實施方案中，在固體支持物上對固定的靶多核苷酸測序。在一些實施方 案中，用于測序的固體支持物與其上發生表面結合的標簽化的固體支持物是同一固體支持 物。在一些實施方案中，用于測序的固體支持物與于上發生擴增的固體支持物為同一固體 支持物。
[0127] -種優選的測序方法是合成測序法(SBS)。在SBS中，監測核酸引物沿著核酸模板 (例如，靶核酸或其擴增子）的延伸以確定模板中核苷酸的序列。根本的化學方法可以是聚 合作用（例如，如被聚合酶催化）。在特定的基于聚合酶的SBS實施方案中，熒光標記的核苷 酸以模板依賴模式被添加至引物(從而延伸引物），以使得添加至引物的核苷酸的順序和類 型的檢測可被用來確定模板的序列。
[0128] 流動池提供了用于容納由本公開內容的方法產生的擴增的DNA片段的方便的固體 支持物。此類形式的一種或更多種擴增的DNA片段可經受SBS或包括以循環重復遞送試劑的 其他檢測技術。例如，為了起始第一SBS循環，一個或更多個標記的核苷酸、DNA聚合酶等可 流入/流經容納一個或更多個擴增的核酸分子的流動池。其中引物延伸導致標記的核苷酸 被并入的那些位點可被檢測。任選地，核苷酸還可包括可逆終止特性，在核苷酸已被添加至 引物后，終止進一步的引物延伸。例如，具有可逆終止子部分的核苷酸類似物可被添加至引 物，以使得隨后的延伸不能發生，直到遞送解阻斷劑以移除該部分。因此，對于使用可逆終 止的實施方案，可將解阻斷劑遞送至流動池(在檢測發生之前或之后）。在多個遞送步驟之 間可進行洗滌。然后可重復循環η次，以將引物延伸η個核苷酸，從而檢測長度η的序列。可容 易地適于與由本公開內容的方法產生的擴增子一起使用的示例性SBS過程、流體系統和檢 測平臺被描述于例如Bentley等Nature456:53-59(2008);WO 04/018497 ;US 7，057，026 ;W0 91/06678;W0 07/123744;US 7,329,492;US 7,211，414;US 7,315,019;US 7,405,281和US 2008/0108082 中。
[0129] 使用循環反應的其他測序過程可被利用，諸如焦磷酸測序。焦磷酸測序檢測隨著 特定核苷酸并入新生的核酸鏈，無機焦磷酸（PPi )的釋放（Ronaghi，等Analytical Biochemistry 242(1)，84_9(1996);Ronaghi，Genome Res.ll(l)，3-11(2001);Ronaghi等 Science 281 (5375) ,363( 1998) ;US6,210,891 ;US 6,258,568和US.6,274,320,其每個通過 引用并入本文）。在焦磷酸測序中，釋放的PPi可通過以下檢測:立即被ATP硫酸化酶轉化成 腺苷三磷酸(ATP)，并且產生的ATP的水平可經由熒光素酶產生的質子來檢測。因此，測序反 應可經由發光檢測系統來監測。用于基于熒光的檢測系統的激發放射源對于焦磷酸測序過 程不是必需的。可適用于對根據本公開內容產生的擴增子應用焦磷酸測序的有用的流體系 統、檢測器和過程，被描述例如在WIP0專利申請系列號PCT/US11/57111、US 2005/ 0191698A1、US 7,595,883和US 7,244,559中。
[0130] -些實施方案可利用包括DNA聚合酶活性的實時監測的方法。例如，核苷酸并入可 通過載有熒光團的聚合酶和γ -磷酸標記的核苷酸之間的熒光共振能量轉移(FRET)相互作 用，或用零模波導(ZMW)來檢測。用于基于FRET的測序的技術和試劑被描述于例如Levene等 Science 299，682-686(2003);Lundquist等Opt·Lett·33，1026-1028(2008);Korlach等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)〇
[0131] -些SBS實施方案包括檢測將核苷酸并入延伸產物后釋放的質子。例如，基于檢測 釋放的質子的測序可使用電子檢測器和從Ion Torrent(Guilford，CT，a Life Technologies subsidiary)商業可得的相關技術，或在US2009/0026082A1 ;US 2009/ 0127589A1;US 2010/0137143A1;或US2010/0282617A1中描述的測序方法和系統。本文描述 的用于使用動力學排除擴增靶核酸的方法可容易地應用于被用來檢測質子的底物。更具體 地，本文描述的方法可被用來產生用于檢測質子的擴增子的克隆群體。
[0132] 另一種有用的測序技術是納米孔測序（參見，例如，D e am e r等T r e n d s Biotechnol.18,147-151(2000);Dearner等Acc.Chem.Res.35:817_825(2002);Li等 Nat.Mater. 2:611 -615(2003)。在一些納米孔實施方案中，將靶核酸或從靶核酸移除的單個 核苷酸通過納米孔。隨著核酸或核苷酸通過納米孔，每個核苷酸類型可通過測量孔的電導 率波動來鑒定。（美國專利號7,001,792; Soni等Clin· Chem. 53,1996-2001 (2007) ;Healy, Nanomed.2,459-481(2007);Cockroft等J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)〇
[0133] 可應用于根據本公開內容的檢測的用于基于陣列的表達和基因分型分析的示例 性方法被描述于美國專利號7，582，420; 6，890，741; 6，913，884或6，355，431或美國專利公 布號 2005/0053980Α1; 2009/0186349Α1 或 US2005/0181440A1。
[0134] 本文描述的方法的有益用途是，其提供了多個核酸片段的快速且高效的平行檢 測。相應地，本公開內容提供了能夠利用本領域已知的技術諸如以上例示的那些制備并檢 測核酸的整合系統。因此，本公開內容的整合系統可包括能夠將擴增試劑和/或測序試劑遞 送至一個或更多個固定的核酸片段的流體組件；系統包括諸如栗、閥門、儲液箱、射流線路 等組件。流動池可被構造和/或在用于檢測靶核酸的整合系統中使用。示例性流動池被描述 在，例如，US 2010/0111768Α1和美國系列號13/273,666中，其每個通過引用并入本文。作為 流動池的例示，整合系統的一個或更多個流體組件可被用于擴增方法和用于檢測方法。以 核酸測序實施方案為例，整合系統中的一種或更多種流體組件可被用于本文描述的擴增方 法并用于在諸如以上例證的那些的測序方法中遞送測序試劑。可選地，整合系統可包括分 隔流體系統以進行擴增方法和進行檢測方法。能夠產生擴增的核酸且還能夠確定核酸的序 列的整合測序系統的實例包括但不限于MiSeqTM平臺（Illumina?，Inc.，San Diego，CA)和 在美國系列號13/273,666中描述的裝置。
[0135] 本公開內容還涉及用于修飾固定的捕獲引物的試劑盒。在一些實施方案中，所述 試劑盒包括a)應用特異性捕獲引物，所述應用特異性捕獲引物包括i)包括應用特異性捕獲 區域的3'部分，和ii)包括通用捕獲區域的5'部分，和b)核酸酶。在其他實施方案中，所述試 劑盒包括a)第一通用捕獲引物;b)第二通用捕獲引物;c)包括與在第一通用捕獲引物中的 區域互補的區域和與在應用特異性多核苷酸中的區域互補的區域的寡核苷酸;d)包括與在 第二通用捕獲引物中的區域互補的區域和與在應用特異性多核苷酸中的區域互補的區域 的寡核苷酸;和e)核酸酶。在一些實施方案中，所述核酸酶為外切核酸酶。在一些實施方案 中，所述核酸酶是外切核酸酶I。在一些實施方案中，所述核酸酶是外切核酸酶III。在一些 實施方案中，所述核酸酶為內切核酸酶。在一些實施方案中，所述核酸酶為限制性內切核酸 酶。
[0136] 在一些實施方案中，所述試劑盒還包括用于固定應用特異性捕獲引物或通用捕獲 引物的基底。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括包括與通用捕獲引物或通用捕獲區域 互補的區域的一種或更多種寡核苷酸。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括一種或更多 種包括與靶捕獲區域互補的區域的寡核苷酸。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括使用 試劑盒的組分用于修飾固定的捕獲引物的說明書。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括 一種或更多種對照分析物的混合物，例如兩種或更多種對照分析物，用于在測試試劑盒中 使用。
[0137] 本發明還提供用PCR擴增的靶DNA序列占據模式化的流動池的方法。
[0138] 圖13闡明用靶向的DNA擴增產物占據模式化的流動池的方法100的實例的流程圖。 例如，靶向的 DNA 擴增可根據在 W02010/038042 公布、W02011/025477 公布、U.S. 61/928,368 專利申請、和/或U. S. 61/928，382專利申請中描述的方法進行。方法100使用DNA聚合酶介導 的引物延伸步驟和洗滌步驟將在流動池表面上的擴增的靶DNA序列的接種與捕獲的靶序列 的克隆擴增分開。方法100包括但不限于以下步驟。
[0139] 在步驟110，靶向的DNA擴增產物被加載到模式化的流動池。所述模式化的流動池 包括在流動池表面上的基因特異捕獲引物。
[0140] 在步驟115,靶序列被與在模式化的流動池上的捕獲引物雜交。孵育階段之后，洗 滌流動池以移除未結合的序列。
[0141] 在步驟120,捕獲引物通過DNA聚合酶延伸以產生雜交的靶序列的互補物。孵育階 段之后，洗滌流動池。
[0142] 在步驟125，變性dsDNA。流動池被洗滌以移除未結合的原始的靶序列。
[0143] 在步驟130,結合的單鏈模板準備用于克隆擴增和后續測序。在一個實例中，用于 占據模式化的流動池的擴增方法是動力學排除方法。例如，動力學排除可根據在 U.S.20130338042專利公布中描述的方法進行。在另一個實例中，用于占據模式化的流動池 的擴增方法是橋式擴增(28個循環）。
[0144] 圖14圖示了圖13的方法100的步驟。即，模式化的流動池210包括捕獲引物220和多 個P5/P7引物225。捕獲引物220包括對感興趣的靶基因特異的寡核苷酸序列。在步驟110,靶 向的DNA擴增產物225被加載到流動池210的表面上。靶向的DNA擴增產物225包括感興趣的 靶序列230、過量的引物和DNA。在步驟115,靶序列230被與捕獲引物220雜交。在步驟120,捕 獲引物220通過DNA聚合酶延伸以產生雜交的靶序列230的互補物235。在步驟125，dsDNA被 變性并且流動池被洗滌以移除未結合的原始靶序列230。
[0145] 圖15顯示通過根據圖13的方法100制備的靶向的DNA文庫的每泳道的簇密度的圖 300。在這個實例中，使用不同密度的捕獲探針:25、50、100或200pM制備模式化的流動池。模 板輸入是l〇yL或2.5yL的擴增的靶DNA。探針密度和模板輸入的匯總顯示在表A中。數據顯示 通過過濾器(綠色框)的簇，具有約30%占據。當分析簇時，從分析結果中移除最不可靠的數 據(通常來自重疊簇）。因此，原始數據被過濾以移除任何不滿足如通過純潔性過濾器測量 的整體質量的讀段。堿基訪問的純潔性被計算為最亮的強度除以最亮的強度和次亮的強度 的總數的比率。例如，如果在前25個循環不超過1個堿基訪問具有〈0.6的純潔性，則簇"通過 過濾器(PF)"。虛線條代表原始簇的預期數目/mm2。數據顯示，在模式化的流動池上使用標 準加載方法，通過過濾器的簇的百分比是限于約30%到約40%的泊松分布。該限制是因為 使用單一模板雜交步驟播種模式化的陣列，所以泊松加載預測，一些陣列將保持空的，一些 將具有單一模板，且其他的將具有多個模板。
[0146]
[0147] 圖16闡明制備用于模式化的流動池的靶向的DNA擴增產物的方法400的實例的流 程圖。在加載到模式化的流動池之前，方法400使用基于珠的靶捕獲以預富集靶分子。方法 400包括但不限于以下步驟。
[0148] 在步驟410，P7引物被珠結合，并且"夾板"寡核苷酸隨后與結合的P7引物雜交。在 一個實例中，P7引物是生物素化的并且珠是鏈霉抗生物素蛋白涂覆的珠。P7引物經由生物 素-鏈霉抗生物素蛋白結合復合物結合到珠表面。在另一個實例中，P7引物使用可用于結合 寡核苷酸到固體表面的任何合適的DNA化學反應來結合珠。"夾板"寡核苷酸包括與P7引物 (或其的部分)互補的3'序列和包括與捕獲探針序列互補的序列的5'寡核苷酸序列。
[0149] 在步驟415,結合的P7/夾板雙鏈體延伸以形成經由其5'末端連接到珠的捕獲探 針。捕獲探針包括對感興趣的靶分子特異的序列。各自含有不同的互補捕獲探針序列的多 個夾板可被連接到珠。
[0150]在步驟420,靶向的DNA擴增產物被添加到其上結合有捕獲探針的珠的懸浮液。
[0151] 在步驟425,在靶向的DNA擴增產物中的靶序列被與捕獲探針雜交。
[0152] 在步驟430,捕獲探針通過DNA聚合酶延伸以產生雜交的靶序列的互補物。新合成 的鏈包括P7和P5引物二者。
[0153]在步驟435,變性dsDNA以移除未結合的原始模板。新合成的互補鏈保持與珠結合。
[0154] 在步驟440,互補鏈被從珠釋放。在一個實例中，通過生物素-鏈霉抗生物素蛋白復 合物結合到珠的互補鏈通過在水中煮沸珠懸浮液持續一段足以釋放鏈的時間被從珠釋放。
[0155] 在步驟445，P7_P5引導的靶向的序列被加載到模式化的流動池上用于隨后的簇產 生和測序。
[0156] 圖17圖示圖16的方法400的步驟。即，珠510被用于捕獲靶序列。在步驟410，P7引物 515被結合到珠510,并且夾板寡核苷酸(未顯示)被與P7引物515雜交。在步驟415，P7引物/ 夾板雙鏈體延伸以形成捕獲探針520。在步驟420,靶向的DNA擴增產物525被添加到具其上 結合有捕獲探針520的珠510的懸浮液。在步驟425,包含在PCR產物525中的靶序列530與捕 獲探針520雜交。在步驟430,捕獲探針520通過DNA聚合酶延伸以產生靶序列530的互補鏈 535。在步驟435,變性dsDNA以移除靶序列530。在步驟440,延伸的互補鏈535被從珠510釋 放。
[0157] 圖18A和圖18B顯示對于根據圖16的方法400制備的珠富集的靶向的DNA文庫，每泳 道的簇密度的圖600和序列度量的匯總數據表650。在該實例中，簇產生和測序在pazam模式 化的流動池上進行。將對照樣品（CT13776)和從珠釋放的延伸的（EXT)互補ssDNA與動力學 排除擴增試劑混合，并且加載到流動池的單獨的泳道上，如在數據表650中顯示的。對照樣 品（CT13776)是從人類基因組DNA衍生的TruSeq無 PCR文庫。EXT DNA是來自使用10ng的 Cor i e 11人類DNA樣品的初始擴增的CPT珠選擇的靶向的DNA擴增產物。參考圖18A，圖600顯 示對于模式化的流動池的每個泳道，通過過濾器的簇。在圖600的頂部的虛線是對于700nm 傾斜模式化的流動池的特征的預期原始密度。在繪圖600中顯示的框標繪通過過濾器的簇 的實際數目（每mm2)。參考圖18B，對于泳道2和泳道3,通過過濾器的簇的百分比(PF簇％)是 約50 %到約60 %，并且顯示與人類基因組的對齊(對齊(PF) % )是約77 %。數據顯示，CPT珠 富集的材料可被用于有效地加載帶有PCR擴增的靶DNA序列的模式化的流動池。
[0158] 在一些實施方案中，基于珠的靶向捕獲的低產量可通過用亞氨基生物素或脫硫生 物素取代生物素化的P7寡核苷酸上的生物素來克服。在某些情況下的低產量可歸因于難以 從鏈霉抗生物素蛋白洗脫生物素。但是，使用亞氨基生物素產生文庫產物，其可以在pH 7.5 或高于7.5有效地結合到鏈霉抗生物素蛋白，并且在pH 4.0、室溫以接近100%的產率溫和 地洗脫。可選地，用脫硫生物素取代生物素產生文庫產物，其有高效地結合到鏈霉抗生物素 蛋白并且用游離的生物素洗脫。
[0159] 在本文描述的某些靶向捕獲測定格式中，生物素-P7寡核苷酸結合到鏈霉抗生物 素蛋白珠。在將捕獲探針與鏈霉抗生物素蛋白結合的P7寡核苷酸退火之后，捕獲探針序列 通過引物延伸被附接到結合的P7寡核苷酸。靶不對稱PCR產物與捕獲探針退火，并且充當用 于鏈延伸的模板。在某些實施方案中，洗滌之后，通過在l〇〇°C在水中孵育5分鐘從鏈霉抗生 物素蛋白珠洗脫單鏈生物素化的P7-捕獲探針-靶DNA。這種洗脫方法可導致，僅小部分的 ssDNA產物通過這種方法從鏈霉抗生物素蛋白洗脫，導致可用于成簇的低的文庫產率。用亞 氨基生物素取代生物素導致文庫產物可易于通過pH變成pH 4從鏈霉抗生物素蛋白洗脫。可 選地，用脫硫生物素取代生物素導致文庫產物可易于用游離的生物素從鏈霉抗生物素蛋白 洗脫。這兩種洗脫方法都是溫和的并且可產生幾乎100%文庫產物回收，這可減少用于文庫 制備需要的DNA輸入量，導致增加的靈敏度。任何合適形式的亞氨基生物素可在本文提供的 方法中使用。亞氨基生物素對于典型地用于合成之后寡核苷酸去保護的某些條件不穩定。 并入亞氨基生物素的可選的方法是將NHS-亞氨基生物素與用C6或C12修飾的氨基基團修飾 的寡捕獲探針偶聯。脫硫生物素-TEG亞磷酰胺商購可得。結構顯示在下面。脫硫生物素可在 常規合成期間被并入寡核苷酸。
[0160] 從前面的描述，將明顯的是，可對本文描述的發明進行改變和修飾以將其采用到 各種用法和條件。此類實施方案也在所附權利要求書的范圍內。
[0161] 本文中變量的任何定義的要素列表的列舉包括作為列出的要素的任何單一要素 或組合(或子組合）的該變量的定義。本文中一個實施方案的列舉包括，作為任何單一實施 方案或與任何其他實施方案或其部分組合的實施方案。
[0162] 本說明書中提到的所有專利和出版物通過引用并入本文，其程度如同每個單獨專 利和出版物被具體和單獨地指明通過引用并入的相同程度。
[0163] 下面的實施例以例示方式提供而并非限制。
[0164] 實施例1
[0165] 通過外切核酸酶從捕獲引物移除轉座子末端序列
[0166] 該實施例描述了用于通過引物雜交和延伸以及隨后通過外切核酸酶移除應用特 異性捕獲區域，將通用捕獲引物轉化成應用特異性捕獲引物的整合過程。
[0167] 具體地，該實施例描述了證實在圖2B(通過引物雜交和延伸修飾通用引物)和在圖 3(通過外切核酸酶I移除修飾的引物的應用特異性區域)中闡明的實施方案的實驗。
[0168] 使用如在表1和圖9A-D中所示的條件和對照的列表在8泳道流動池上進行實驗。
[0169] 轉座子末端區域(ME區域)通過雜交夾板寡核苷酸并且用聚合酶將其復制被添加 到表面結合的P5和P7引物的3 '末端。ME序列被添加到流動池泳道2、3、5、6、7和8，但未被添 加到泳道1和4。在移除夾板寡核苷酸之后，通過使用以標記的寡核苷酸(P5("抗P5"）和P7 ("抗P7"）的反向互補物)的引物密度測定，評價每個泳道中表面結合的P5和P7序列的量。該 實驗的結果顯示在圖9A中。所有8條泳道顯示在表面上具有類似量的表面結合的P5和？7序 列。
[0170] 用使用標記的抗ME寡核苷酸的引物密度測定，對流動池的每個泳道評價ME區域的 相對量。該實驗的結果顯示在圖9B中。未經過引物雜交和延伸方案的泳道(泳道1和4)顯示 無 ME特異性信號。與之相比，經過引物雜交和延伸的泳道(泳道2、3、5、6、7和8)顯示強的腿 特異性信號。
[0171]為了保護靶特異性捕獲引物的通用捕獲區域(P5和P7區域)免受外切核酸酶I消 化，抗P5和P7寡核苷酸被與泳道3、6、7和8雜交。然后，泳道4、5、6和8被用外切核酸酶I在38 °C處理30分鐘。該實驗設計概述在表1中。
[0172]表1:外切核酸酶消化實驗的設計
[0173]
[0174] 表1的最后兩列代表在每個流動池泳
道中觀察到的P5/P7特異性信號和ME特異性 信號。加號指示觀察到強的信號，而減號指示僅觀察到弱的信號或背景信號。該實驗的結果 也顯示在圖9C和9D中。
[0175] 發現抗P5和抗P7寡核苷酸有效地保護捕獲引物的通用P5和P7區域。例如，在泳道6 和8中觀察到強的信號，其中P5和P7區域通過與抗P5和抗P7寡核苷酸雜交被保護。與之相 比，在泳道4中未觀察到P5或P7特異性信號，其中捕獲引物的P5和P7區域保持未雜交和單 鏈。
[0176] 這些結果顯示外切核酸酶可有效地移除未雜交的、單鏈捕獲引物，但單鏈引物可 通過與互補寡核苷酸雜交被保護免受外切核酸酶。
[0177] 顯示外切核酸酶有效地從捕獲引物移除靶特異ME區域。其中捕獲引物的通用捕獲 區域被保護免受外切核酸酶的泳道6顯示無 ME特異性信號。與之相比，未經過外切核酸酶處 理的泳道7顯示強的信號。
[0178] 概括地說，在該實施例中顯示的結果表明，引物延伸和雜交是用于添加靶特異性 捕獲區域(例如，ME區域)到固定的通用捕獲引物的3'末端，因此產生靶特異性捕獲引物的 有效的方法。外切核酸酶可被用于移除未雜交的靶特異性捕獲區域，并且因此將靶特異性 捕獲引物轉化成通用捕獲引物。通用捕獲引物的通用捕獲區域(例如，P5和P7區域)可通過 與互補寡核苷酸(例如，抗P5和抗P7寡核苷酸)雜交被保護免受外切核酸酶。
[0179] 實施例1I
[0180]表面標簽化后，從捕獲引物移除轉座子末端區域促進橋式擴增
[0181] 該實施例描述了用于通過表面標簽化、移除未雜交的轉座子末端區域、橋式擴增 和對擴增子測序的DNA固定化的整合過程。
[0182] 具體地，該實施例描述了證實在圖6(準備流動池用于表面標簽化）、圖7(表面標簽 化反應)和圖1〇(表面標簽化隨后移除轉座子末端區域)中闡明的實施方案的實驗。
[0183] 例如，可根據在圖6中闡明的方案準備流動池用于表面標簽化。首先，包含與通用 捕獲引物(例如，P5或P7)互補的區域和與轉座子末端區域(例如，嵌合末端(ME))互補的區 域的夾板寡核苷酸與在標準mumina?流動池上的通用捕獲引物雜交。其次，在其3'-末端 延伸通用捕獲引物以添加轉座子末端區域。在移除夾板寡核苷酸之后，轉座子末端寡核苷 酸與延伸的捕獲引物的轉座子末端區域雜交以形成轉座子末端。然后，轉座酶結合到轉座 子末端。未結合到轉座酶并且不是可變轉座體的一部分的轉座子末端區域可阻礙橋式擴 增，如下文所示。
[0184] 例如，可根據在圖7中闡明的方案進行表面標簽化。首先，基因組DNA(示例的靶多 核苷酸)在具有表面結合的轉座體的流動池內部流動。這些轉座體可在"標簽化反應"中片 段化并且固定基因組DNA。在該反應的過程中，延伸的引物（"轉移鏈"）的3'-末端連接到靶 DNA，其因此被固定到流動池（固定的靶多核苷酸）。在完成標簽化反應之后，轉座酶分子被 移除（例如用PBI (Quiagen緩沖液）），并且靶DNA中在標簽化反應期間產生的3 '末端被延伸。 移除轉座體之后，保留了過量的具有轉座子區域的延伸的捕獲引物。
[0185] 大體上發現，相對于在僅包含通用捕獲引物的未修飾的標準流動池上進行的類似 的反應，過量靶特異性捕獲引物的存在降低測序反應的數據質量和數據數量。例如，與使用 僅具有通用捕獲引物的未修飾的標準的Illumina?流動池相比，當使用具有過量靶特異性 捕獲引物的修飾的Illumina?流動池時，發現％PF值更低，發現高于Q30的堿基百分位數更 低，并且發現當成像在初始SBS(合成測序)循環中的簇時觀察到背景信號更高。
[0186] 在一個具體的實例中，通過在未修飾的標準的Illumina?表面上（具有標準的P5 和P7引物)和在具有包括轉座子末端區域(P5-ME和P7-ME引物)的捕獲引物的表面上對標準 的NEXTERA?文庫測序，展示了靶特異性捕獲引物的作用。該實驗的結果顯示在表2和圖8中。
[0187] 表2.對NEXTERA?文庫測序的實驗結果
[0188]
[0190] 表2顯示，標準的Ilkimina⑧衷面(泳道1)相比于修飾的表面(泳道2)，產生更多數 據(更高的原始簇計數)和也更高的％PF并且獲得的數據具有更高質量(更低的錯誤率，高 于Q30的堿基更多）。
[0191] 圖8B顯示正確讀段的部分(淺灰色區域)和包含一個錯誤的讀段的部分(深灰色區 域）。從標準的Illumina?表面(泳道1)獲得的絕大部分讀段是無錯誤的，而約60%的從修 飾的表面(泳道2)獲得的讀段具有至少一個錯誤。
[0192] 下面的標簽化實驗闡明，通過在完成標簽化反應之后和在橋式擴增之前從延伸的 捕獲引物移除轉座子區域，可以改進DNA測序數據的質量。
[0193] 使用如在圖11和表3和4中所示的條件和對照的列表在8泳道流動池上進行實驗。
[0194] 表3.標簽化實驗的實驗條件
[0195]
[0196] 實驗號：130618_EAS89_0423_FC664KHAAX
[0197] 表4.標簽化實驗的實驗結果
[0198]
[0199] 表4顯示來自標簽化實驗的主要的測序度量。
[0200] 在泳道2、4、6和8中，在橋式擴增之前，用外切核酸酶I移除靶特異性捕獲引物的轉 座子末端序列。在這些泳道中的測序數據相對于保持未經外切核酸酶處理的泳道1、3和7的 數據，在更高的％PF和更高的對齊％和更低的錯誤率方面顯示改進的質量。
[0201] 圖11顯示正確簇(淺灰色區域)和具有1個或2個錯誤的簇(分別為深灰色和黑色區 域)的比例。其中轉座子末端序列在簇擴增之前被用外切核酸酶I移除的泳道2相比于保持 未經外切核酸酶處理的泳道1，顯示較大比例的正確簇(淺灰色區域）。
[0202] 概括來說，該實施例展示，在固定應用特異性多核苷酸之后但在橋式擴增之前，從 應用特異性捕獲引物移除未雜交的應用特異性捕獲區域，充分改善DNA測序數據質量和數 量。
[0203]盡管已經參考公開的實施方案描述了本公開內容，本領域的技術人員將容易地理 解，上文詳述的具體的實施例和研究僅是本公開內容的例示。應該理解，可進行各種改變而 不偏離本公開內容的精神。因此，本公開內容僅由下面的權利要求書來限制。
【主權項】
1. 一種修飾固定的捕獲引物的方法，所述方法包括： a. 提供具有固定的應用特異性捕獲引物的固體支持物，所述應用特異性捕獲引物包 括： i .包括應用特異性捕獲區域的3 '部分，和 ii.包括通用捕獲區域的5'部分； b. 將應用特異性多核苷酸與所述應用特異性捕獲引物在對于雜交足夠的條件下接觸 以產生固定的應用特異性多核苷酸，和 c. 移除未與應用特異性多核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域 以將未雜交的應用特異性捕獲引物轉化為通用捕獲引物。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述應用特異性捕獲引物包括多個不同的固定的 應用特異性捕獲引物。3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述應用特異性多核苷酸包括多個不同的應用特 異性多核苷酸。4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述應用特異性捕獲區域的一部分被移除。5. 根據權利要求1所述的方法，其中所述應用特異性捕獲區域包括靶特異性捕獲區域 并且其中所述應用特異性多核苷酸包括靶多核苷酸。6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述應用特異性捕獲區域包括轉座子末端(TE)區 域并且其中所述應用特異性多核苷酸包括TE寡核苷酸。7. 根據權利要求1所述的方法，其中所述通用捕獲區域包括已知的序列。8. 根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括在執行步驟c)之前，在對于寡核苷酸與 應用特異性捕獲引物的通用捕獲區域雜交足夠的條件下施加寡核苷酸，以產生雙鏈DNA區 域。9. 根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括在執行步驟c)之前，在對于寡核苷酸與 應用特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域雜交足夠的條件下施加寡核苷酸，以產生雙鏈 DNA區域。10. 根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述應用特異性捕獲引物與核酸酶 接觸，其中未與應用特異性多核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物的應用特異性捕獲區域被 核酸酶除去。11. 如權利要求10所述的方法，其中所述核酸酶是外切核酸酶。12. 如權利要求11所述的方法，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶I。13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶III。14. 根據權利要求10所述的方法，其中所述核酸酶是內切核酸酶。15. 根據權利要求5所述的方法，所述方法還包括延伸與靶多核苷酸雜交的應用特異性 捕獲引物的靶特異性捕獲區域，以產生與所述靶多核苷酸互補的固定的延伸產物。16. 根據權利要求15所述的方法，所述方法還包括將所述通用捕獲引物與所述固定的 延伸產物退火。17. 根據權利要求16所述的方法，所述方法還包括通過PCR擴增所述固定的延伸產物以 產生多個固定的擴增子。18. 根據權利要求17所述的方法，所述方法還包括對所述多個固定的擴增子測序。19. 根據權利要求18所述的方法，其中測序包括橋式擴增步驟。20. 根據權利要求1所述的方法，其中提供固體支持物包括將所述應用特異性捕獲引物 固定到所述固體支持物上。21. 根據權利要求20所述的方法，其中所述應用特異性捕獲引物被直接固定到所述固 體支持物上。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述應用特異性捕獲引物的固定包括將通用捕 獲引物固定到所述固體支持物上。23. 根據權利要求22所述的方法，所述方法還包括將固定的通用捕獲引物轉化成應用 特異性捕獲引物。24. 根據權利要求23所述的方法，所述方法還包括將夾板寡核苷酸與所述通用捕獲引 物退火，其中所述夾板寡核苷酸包括與應用特異性捕獲引物的通用區域互補的通用區域和 與在應用特異性核苷酸中的應用特異性區域互補的應用特異性區域。25. 根據權利要求24所述的方法，所述方法還包括延伸所述通用捕獲引物以產生應用 特異性捕獲引物。26. 根據權利要求6所述的方法，所述方法還包括在執行步驟b)之后和執行步驟c)之 前，將轉座酶結合到TE區域-TE寡核苷酸雜合體以產生支持物結合的轉座體復合物。27. 根據權利要求26所述的方法，所述方法還包括在其中所述支持物結合的轉座體復 合物連接所述應用特異性捕獲引物的TE區域的3'-末端（"轉移鏈"）到靶多核苷酸的條件 下，將所述支持物結合的轉座體復合物與所述靶多核苷酸接觸，以產生固定的靶多核苷酸。28. 根據權利要求27所述的方法，所述方法還包括從所述固體支持物移除所述轉座酶 和TE寡核苷酸。29. 根據權利要求28所述的方法，所述方法還包括延伸所述固定的靶多核苷酸的3'-末 端。30. 根據權利要求29所述的方法，所述方法還包括通過PCR擴增所述固定的靶多核苷酸 以產生多個固定的擴增子。31. 根據權利要求30所述的方法，所述方法還包括對所述多個固定的擴增子測序。32. 根據權利要求31所述的方法，其中測序包括橋式擴增步驟。33. -種修飾固定的捕獲引物的方法，所述方法包括： a. 提供具有固定的應用特異性捕獲引物的固體支持物，所述應用特異性捕獲引物包 括： i .包括靶特異性捕獲區域的3 '部分，和 ii.包括通用捕獲區域的5'部分； b. 將靶多核苷酸與所述應用特異性捕獲引物在對于雜交足夠的條件下接觸以產生固 定的靶特異性多核苷酸； c. 延伸與所述固定的靶特異性多核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物以產生與所述固 定的靶特異性多核苷酸互補的固定的延伸產物； d. 在對于寡核苷酸與所述固定的應用特異性捕獲引物的所述通用捕獲區域雜交足夠 的條件下，施加寡核苷酸； e. 在對于核酸酶移除未與所述固定的靶特異性多核苷酸雜交的應用特異性捕獲引物 的靶特異性捕獲區域足夠的條件下，將所述固定的應用特異性捕獲引物與核酸酶接觸，以 將未雜交的應用特異性捕獲引物轉化成通用捕獲引物； f. 從所述通用捕獲引物移除所述寡核苷酸； g. 將所述通用捕獲引物與所述固定的延伸產物退火； h. 通過PCR擴增所述固定的延伸產物以產生多個固定的擴增子，和 i .對所述多個固定的擴增子測序，其中測序包括橋式擴增步驟。34. 根據權利要求33所述的方法，其中所述核酸酶是外切核酸酶。35. 根據權利要求33所述的方法，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶I。36. 根據權利要求1-35中任一項所述的方法，其中所述固體支持物包括平面的表面。37. 根據權利要求1-35中任一項所述的方法，其中所述固體支持物包括模式化的表面。38. 根據權利要求1-35中任一項所述的方法，其中所述固體支持物包括珠。39. 根據權利要求38所述的方法，其中捕獲引物被使用生物素固定到所述珠。40. 根據權利要求38所述的方法，其中捕獲引物被使用亞氨基生物素固定到所述珠。41. 根據權利要求38所述的方法，其中捕獲引物被使用脫硫生物素固定到所述珠。42. -種用于修飾固定的捕獲引物的試劑盒，所述試劑盒包括： a. 應用特異性捕獲引物，所述應用特異性捕獲引物包括： i .包括應用特異性捕獲區域的3 '部分，和 ii.包括通用捕獲區域的5'部分，和 b. 核酸酶。43. -種用于修飾固定的捕獲引物的試劑盒，所述試劑盒包括： a. 第一通用捕獲引物， b. 第二通用捕獲引物， c. 包括與在所述第一通用捕獲引物中的區域互補的區域和與在應用特異性多核苷酸 中的區域互補的區域的寡核苷酸。 d. 包括與在所述第二通用捕獲引物中的區域互補的區域和與在應用特異性多核苷酸 中的區域互補的區域的寡核苷酸，和 e. 核酸酶。44. 根據權利要求42或43所述的試劑盒，其中所述核酸酶是外切核酸酶。45. 根據權利要求42或43所述的試劑盒，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶I。46. 根據權利要求42或43所述的試劑盒，所述試劑盒還包括用于固定所述應用特異性 捕獲引物或所述通用捕獲引物的基底。47. 根據權利要求42或43所述的試劑盒，所述試劑盒還包括使用所述試劑盒的組分用 于修飾固定的捕獲引物的說明書。
【文檔編號】C12Q1/68GK105917004SQ201480073405
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年12月23日
【發明人】羅伯托·里加蒂, 尼爾·葛姆雷, 艾倫·E·埃克哈特, 喬納森·馬克·鮑特爾
【申請人】伊魯米納劍橋有限公司