成纖維細胞混合物及其制備和使用方法

成纖維細胞混合物及其制備和使用方法
【專利摘要】本公開提供了一種非自體產品，所述產品是兩種以上同源或異源的分離自不同個體的成纖維細胞的細胞或組織培養物、或來自培養物的提取物、或培養基的混合物。所述細胞或因子被共混在賦予接受者的皮膚所期望的特性的產品中，所述接受者不是所述混合物的來源。本公開還涉及制備和使用和/或培養所述成纖維細胞的方法，所述方法包括對所述混合物的效能進行優化以賦予接受者的皮膚一種或多種所期望的特性。
【專利說明】
成纖維細胞混合物及其制備和使用方法
技術領域
[0001] 本公開涉及兩種以上分離自不同個體的同源或異源的成纖維細胞的組織培養物、 或來自所述培養物的提取物、或者培養基的混合物。本公開還涉及應用此類成纖維細胞培 養物、細胞共培養物、來自細胞的提取物、形成所述細胞培養物或培養基的可擴散要素(單 獨或與環境條件配合)使細胞生長并誘導其產生其因子或要素（由所述細胞產生或提取自 所述細胞)的陣列。本公開還涉及將上述細胞或因子共混在產品中，所述產品對接受者的皮 膚賦予所期望的的特性，所述接受者不是所述混合物或任何個體成纖維細胞的來源，即，非 自體(non-autologous)。本公開還涉及制備和使用和/或培養所述成纖維細胞及其混合物 的方法，包括優化混合物中的所述細胞或因子的潛能或效能以對接受者的皮膚賦予所期望 的特性的方法。
【背景技術】
[0002] 成纖維細胞的主要功能之一是通過連續分泌胞外基質的前體來維持結締組織的 結構完整性。成纖維細胞分泌胞外基質的所有成分的前體，主要是基質和各種纖維或結構 蛋白。成纖維細胞也分泌小分子量可擴散因子，小分子量可擴散因子影響并協調相鄰細胞 的功能和產物從而增強組織響應。胞外基質的組成極大地決定了結締組織的物理性質。
[0003] 本領域已知有利用自體成纖維細胞（即，獲取成纖維細胞的供體也是經過培養的 所述成纖維細胞的接受者)的方法。在這類成纖維細胞的已知應用中，存在通過施用經培養 的成纖維細胞來促進傷口（例如，表皮傷口或痿管）愈合的方法;通過增大與聲帶缺陷相鄰 的組織進行的校正手術方法;和治療聲襞瘢痕以及修復皮膚和軟組織缺陷的方法。
[0004] 本領域還已知有由為了個體而培養的自體成纖維細胞所組成的劑量單元，該個體 同時也是供體。此外，存在生長成纖維細胞用于自體應用的方法。
[0005] 從兩種以上分離自不同個體的同源或異源的成纖維細胞的組織培養物或者來自 培養物的提取物或培養基的混合物獲得商用非自體產品。

【發明內容】

[0006] 本公開提供了非自體產品。
[0007] 本公開還提供了這樣的非自體產品：其為兩種以上來自相同性別的的成纖維細胞 培養物、由其獲得的提取物和/或從培養基回收的可擴散要素形成的同源和異源混合物。
[0008] 本公開還提出，來自相同性別的同源和/或異源的成纖維細胞培養物或其提取物 的每種混合物可以具有基于通過所述混合物所希望獲得的特性的"加權"因子。
[0009] 本公開還提出，可以影響成纖維細胞培養物或其提取物或形成細胞培養物的可擴 散要素，以便在產物或所得產品中產生變化。
[0010]另外，本公開提出，對于每種產品可以存在至少三種因子，其中一種或多種因子具 有更高的權重。
[0011]本公開還提出，所述因子包括但不限于:年齡、DNA測試、種族同質性、健康狀況、外 觀美麗度(符合由黃金比例(有時稱之為斐波拉契數列)所描述的經典美），以便在產物或不 同的所得產品中產生或創建變化。所述不同的所得產品可以用于提高、調節或處理本公開 組合物的使用者的一種或多種所期望的特性。
[0012] 本公開還提供了使用來自相同性別的成纖維細胞或其提取物或形成細胞培養物 的可擴散要素的異源和/或同源的混合物來提供非自體產品的方法。
[0013] 另外，本公開提供了制備（即，培養)混合物的方法，其包括增強所述混合物的有益 效果或調節所述混合物的效果的方面。
【附圖說明】
[0014] 圖1至4是展示整體表達譜的差異的測試結果的圖。
【具體實施方式】
[0015] 如上所述，本公開提供了兩種以上分離自相同性別的不同個體的同源或異源的成 纖維細胞的組織培養物、細胞共培養物、來自細胞或培養物的提取物、形成細胞培養物的可 擴散要素或者培養基的混合物。成纖維細胞培養物、細胞的共培養物、來自細胞或培養物的 提取物、形成細胞培養物的可擴散要素或培養基單獨或與環境條件配合使用，從而使生長 細胞并誘導所述細胞產生其要素（由所述細胞產生或提取自所述細胞)陣列。這些細胞、培 養物、細胞的共培養物、形成所述細胞培養物的可擴散要素和培養基和/或因子被共混到為 接受者的皮膚賦予所期望的特性的產品中。重要的是，因為接受者不是混合物或任何個體 成纖維細胞的來源，因此接受者與成纖維細胞之間的關系被稱之為"非自體"。由于產品旨 在用于特定性別，即女性或男性，因而每種產品中的細胞、共培養物、培養物、形成所述細胞 培養物的可擴散要素和培養基和/或要素源自所期望的的性別。
[0016] 由如上所述的細胞、培養物、培養基和/或要素產生或可從其提取的這些要素被共 混起來并包含在產品中。所述要素包括但不限于：包括表皮生長因子在內的生長因子、蛋 白、肽、細胞因子和存在于細胞或培養基中的所有其它生物分子。
[0017] 根據本公開，產品優選為局部組合物。優選的局部組合物是乳霜、精華液（serum) 或乳液。所述組合物可以包含遞送載劑，例如脂質體和膠束。所述組合物還可以包含轉運分 子，例如促進或提供分子雪橇運輸(molecular sledding)的蛋白或大分子。使用這類分子 使得能夠將所述要素遞送至接受者的表皮或真皮。然而，所述組合物可以是胃腸外（例如， 可注射或靜脈內等)組合物、通過裝置(例如，激光器、微針頭或吸入器等)遞送或者口腔牙 周組合物(包括漱口水）。
[0018] 還可以對組織培養成纖維細胞或者成纖維細胞或培養物或者來自培養物的提取 物、形成細胞培養物的可擴散要素或者培養基施以影響，以便在由細胞或培養基產生或可 從其提取的要素的陣列、要素的量和類型方面由于暴露于不同的化學物質、培養物、或培養 物生長培養基的環境要素而產生變化。例如，氧水平(缺氧、高氧或正常的氧水平）、Α0Χ、ρΗ、 溫度、和細胞在不同水平的紫外光和1^^、1^8、1^(：、11?和可見光的不同混合光下的暴露可能 作用于或影響成纖維細胞培養物或來自其的提取物。此外，環境條件可能影響培養的成纖 維細胞或成纖維細胞培養物、或來自培養物的提取物、或培養基、或要素。這類環境條件包 括但不限于P02、C0(高氧或缺氧條件）、對不同的紫外譜帶或其它形式能量的暴露以及溫度 等。
[0019] 如本文所用，術語"同源"是指使用的成纖維細胞培養物獲自下述供體，所述供體 構成的族群的血統80%以上、優選90%以上、更優選95%以上和最優選基本100%為單一民 族或種族。因此，成纖維細胞培養物獲自同源供體組(相同性別），例如以下的族群：日本女 性、西非女性或印度女性。由于數世紀之久的民族融合，術語"同源"通常不適用選自例如美 國或加勒比群島的那些族群。
[0020] 如本文所用，術語"異源"是指使用非種族同質性的成纖維細胞，例如獲自相同性 別但為不同族群或來源的組合的成纖維細胞，例如以下的族群:西非女性和日本女性、或西 非女性和印度女性、或日本女性和西歐女性。
[0021] 可以對本公開的同源和/或異源的成纖維細胞組織培養物的混合物進行"定制 (tailoring)"以便使包括的一個種族族群多于另一種種族族群。此外，"定制"可以包括考 慮基于期望從所述混合物獲得的特性而對因子進行"加權"。所述因子包括但不限于:年齡、 DNA測試、種族同質性、健康狀況、外觀美麗度(符合由黃金比例(有時稱之為斐波拉契數列） 所描述的經典美態），以便在產物或不同的所得產品中產生或創建變化。這些不同的所得產 品可以用于提高本公開的組合物的使用者的一種或多種所期望的特性。
[0022] 例如，成纖維細胞的組織培養物的混合物可以包括50%的來自西非女性的成纖維 細胞、30%的來自日本女性的成纖維細胞和20%的來自印度女性的成纖維細胞。每種百分 比可以獲自單個女性或構成同源混合組(對術語同源的定義如上所述）的女性組，例如，來 自西非國家馬里的多位女性。就需要改善或賦予接受者皮膚的特定色素或其它特性對于混 合物的成纖維細胞的選擇和因子的權重進行預測。因此應該理解，根據本公開的一個實施 方式，組合物提供了選出一個或多個種族族群的供體和可能的"加權"混合物，以獲得傳遞 至少一種性質(優選對皮膚)的所得產品。所述一種性質可以為例如增強的皮膚緊致性或光 滑度、或者皮膚更加飽滿。而且，所述一種性質可以在幾乎任何使用本公開該實施方式的組 合物的人(任何種族背景）中得以改善。
[0023] 要賦予接受者的皮膚的特定特性包括但不限于:膚色、皮膚彈性、皮膚光滑性、瘢 痕減少、皺紋減少、對炎性刺激的反應、水分保持能力、產生新的血管和輸送養分的傾向以 及皮膚厚度或密度、對外傷或自由基傷害的反應的改善、或者本領域技術人員基于本公開 顯而易見的皮膚特性的組合。由于可以"定制"同源和/或異源成纖維細胞培養物的混合物 來提供特定的期望的皮膚特性或皮膚特性的組合，本公開提供了為接受者的皮膚賦予特性 的無限可能性。因此，"定制"可以包括更大百分比的來自一個同源或異源的女性組的女性 的成纖維細胞培養物，因為已知或據信該女性或該組可提供所期望的特性。
[0024] 據信皮膚起皺紋是較淺色皮膚類型的問題。此外，斑駁的色素過度沉著和膚色不 均與較深色皮膚類型相關。此外，亞裔血統具有抵抗光老化的防護機制。因此，在決定包括 基于產品中所期望的皮膚特性或皮膚特性組合的權重的定制時可以考慮到上述因素。如下 文的測試數據所示，在相對于一組(或單培養物），"共培養物"中HAS1的增加顯示出改善的 抗皺、和光損害的避免或最小化。這強調了制造其中可以實現對組合物的定制或個人化的 本公開組合物的能力。本公開中的測試數據證明了細胞或共培養物的任意組合，并支持認 為來自細胞或培養物的提取物、形成細胞培養物的可擴散要素、培養基或外部因子的任意 組合能夠對組合物增加對HAS1 (透明質酸)生產的Collal刺激和/或MMP1抑制以生產抗老化 產品。
[0025] 在優選實施方式中，據信"加權"的混合物在各因子間存在等級之分。優選地，對于 種族同質性而言，考慮（1)健康狀況、（2)年齡和(3)美麗度因子的優先級順序。
[0026] 關于健康狀況因子，重要的是考慮排除患有遺傳疾病的供體。此外，應從供體"庫" 中排除由于環境條件所致的過早老化，例如，自由基生成，即日曬和較高的贅生物以及因吸 煙所致的過早老化。
[0027] 對于年齡因素，供體"庫"、尤其是女性，獲取成纖維細胞的供體的年齡優選年紀較 輕，因其皮膚和成纖維細胞正處在生命的最佳階段。所述年齡的范圍基于種族可能有所不 同。據信，優選的年齡范圍是18至35周歲，更優選18至30周歲。然而，可設想年齡范圍可以具 有更低下限，達成熟個體的年齡，這在美國為青少年，即約12周歲。
[0028] 對于美麗度因子，符合由黃金比例(有時稱為斐波拉契數列)所描述的經典美具備 許多希望的特征。這些希望的特征包括但不限于面部關鍵特征或要素(包括但不限于嘴、目艮 和眉弓）的角度和間距之間的幾何學關系。對于這類特征的選擇將包括在最終產品的"定 制"中。因此，可以將產品為預期的接受者定制。
[0029] 如上文所討論，還認為本公開可以用于其它目的。例如，本發明的組合物可以用于 使傷口愈合或減輕瘢痕。因此，可設想不僅表皮層而且內表皮、真皮和SQ都能受到本公開的 組合物和方法的影響。
[0030] 本公開還提供了制備（即，培養)成纖維細胞混合物以及對所述培養進行優化的方 法。眾所周知，成纖維細胞培養物要耗費相當的時間才能生長至足夠數量，并且通常需要對 成纖維細胞在培養基中傳代多次以獲得滿意的產率。此外，制備成纖維細胞的方法可以通 過例如外部和/或環境誘導等過程而改造。此外，成纖維細胞可以經遺傳修飾。再者，可以從 皮膚或非皮膚來源(例如，臍帶間充質干細胞)轉化成成纖維細胞。根據本公開，成纖維細胞 培養物可以根據本領域已知方法獲自如哺乳動物等動物。優選地，成纖維細胞培養物通過 從相同類型的組織分離成纖維細胞而獲得，所述組織是本公開的應用方法的目標。包括培 養基和培養技術(例如，傳代和選擇）的培養成纖維細胞的方法也是本領域已知的。通常的 培養基包括牛血清白蛋白或不存在FBS的胎牛血清。然而，成纖維細胞可以在供體的血清混 合物中培養。優選地，選擇生成膠原的成纖維細胞。
[0031 ]本公開設想，根據所述制備方法獲得的成纖維細胞培養物混合物的效能可以針對 改善的效力進行有益地修飾或進行優化。例如，效能的改善或要素的改變可以通過修改進 行培養和成纖維細胞生長的氧水平而實現。可以通過調節培養成纖維細胞的氧水平來調節 同源和/或異源的成纖維細胞培養物混合物的效能。
[0032] 根據本公開，與制備"定制"、"加權"的同源和/或異源成纖維細胞培養物的混合物 的能力結合時，通過調節生長成纖維細胞培養物的混合物的可選水平來調節所得成纖維細 胞培養混合物的效能的能力提供了更為廣闊的選擇，包括治療選擇。
[0033] 如本文所討論，在優選的實施方式中，所針對的是女性。然而，本公開也可用于男 性。因此，相同的原理和教導(如上文所討論)可以適用于男性。
[0034]將低傳代的來自非裔美國人[非裔美國人組]和亞裔[亞裔/韓裔組]背景的人類女 性的人皮膚成纖維細胞接種至6孔皿。在單一培養物中并以非裔美國人與亞裔/韓裔為50: 50組合比例接種兩組。進行細胞培養，直至在細胞達到匯合(緊密堆積的單層）后約二十四 (24)小時。在匯合后24小時，將細胞裂解并使用苯酚：氯仿提取法提取RNA(Trizol Reagent)。然后對RNA定量并評估RNA濃度。利用SABiosciences RT2Easy First Strand試 劑盒將所述RNA轉化為cDNA。根據試劑盒說明，將cDNA與SYBR綠檢測試劑混合并添加至其它 的SABiosciences RT2ECM and Adhesion分子陣列的孔內。將所述陣列加載至Bio-Rad iCycler內進行陣列分析和數據采集。利用專門針對所述陣列設計的基于網絡的軟件進行 分析。
[0035]由所述基于網絡的軟件對每個參數一個實驗復制樣品的結果針對對照細胞和暴 露細胞之間的倍數調制變化以及統計顯著性/P值測定進行評估。然后對調節異常(具有或 不具有統計顯著性)檢驗陣列上的基因，從而確定陣列的哪些區域具有最多的調節異常且 最可能是受到影響的過程。由于對于每個樣品僅運行一個陣列，無法生成P值且下文所列的 值僅針對生物學顯著性進行分析(相對于對照，基因表達值增加或減少超過2倍）。所有的基 因值相對于對照基因列表(Control Gene List)中的HPRTl、B2M、GAroH和RPLP0進行標準 化。將亞裔/韓裔細胞組設定為對照樣品，因此以下比較是相對于亞裔/韓裔表達水平的基 因調節異常，如下文基因表達值總結表中所示。
[0038]
[0039] 這些測試所顯示出的是可以獲得混合不同組或種族群的成纖維細胞或細胞或者 共培養的能力。這可以在細胞階段完成，而不是僅在培養基階段。此外，通過檢驗總體表達 譜(將陣列上所測試的每種基因的表達值作圖為線圖），觀察到非裔美國人細胞 v.s.非裔美 國人細胞與亞裔/韓裔細胞(下文稱為50:50比例的"共培養物(CoCulture)"）的表達譜的顯 著差異。在以亞裔/韓裔組作為對照并因此充當基線(或圖上的〇線），圖1一4所示的圖清楚 地展示出總體表達譜的差異。與僅比較非裔美國人組細胞與亞裔組細胞相比，共培養物顯 示出更大幅度的變化。在某些情況下，共培養物展示出相對非裔美國人細胞反方向的調節 異常（當共培養物上調時，非裔美國人細胞下調）。
[0040]
[UU41 j 開培喬物?不出對功酡組的.兇里為刺微丨生的雙奴（蛍日的生成増加），時非倚美 國人單培養物則展示出更為抑制性(蛋白的生成減少)的效應。共培養物還展示出在參與所 列出的功能組的大部分的基因中更高的活性。僅基底膜成分以及膠原蛋白&ECM結構成分途 徑展示出相同水平的調節異常(但它們仍展示出在共培養的細胞中更強的刺激性效應）。
[0042] 測試的結果說明了以下內容。能夠對兩種以上供體或不同種族群的成纖維細胞進 行混合。此外，測試支持了非裔美國人細胞與共培養物(50:50的非裔美國人和亞裔/韓裔） 中的那些細胞相比在表達譜上的顯著差異。即，共培養物提供了 ：（1)對蛋白生成的更大的 刺激性效果，（2)在涉及跨膜分子、粘附分子(細胞一細胞;細胞一基質等等）、ECM蛋白酶和 抑制劑的途徑中更大的程度；（3)不同的基因表達，（4)HAS1(透明質酸合成酶)的顯著增加， (5)C0L7A1的增加(根據科學文獻，C0L7A1的損失有助于皺紋形成）；和(6)更大量的MMP參 與。
[0043] 因此，顯然出人意料地發現了即使在細胞水平也能夠實現本公開所設想的定制 和/或個人化的共混。
[0044] 應該理解，本公開是局部組合物。優選地，所述局部組合物是涂敷于接受者的乳 霜。乳霜或乳霜產品具有載劑。所述載劑使得能夠涂敷在接受者的皮膚上而不會妨礙成纖 維細胞混合物的效果。據信載劑的大部分百分比是水。此外還設想，整個局部組合物或乳霜 中的成纖維細胞混合物的量小于百分之5(%)，且優選小于1%。據認為，小于1%將在局部 組合物中產生最佳的結果。
【主權項】
1. 一種非自體的局部產品，基于要對接受者的皮膚賦予的一種或多種所期望的產品特 性，該產品包含兩種以上分離自不同個體的同源或異源的成纖維細胞組織培養物或來自培 養物的提取物或培養基的混合物。2. -種非自體的局部產品，其單獨利用或與環境條件配合利用成纖維細胞培養物、來 自細胞的提取物、或培養基來使細胞生長并誘導其產生其要素陣列，所述要素陣列由所述 細胞產生或從所述細胞提取，并且所述細胞或因子被共混在對接受者的皮膚賦予一種或多 種所期望的特性的產品中。3. 權利要求2所述的產品，其中，所述混合物經定制能夠包含兩個以上的種族群。4. 權利要求3所述的產品，其中，在所述兩個以上的種族群中，來自一個種族群的供體 的百分比大于來自另外的一個或多個種族群的供體的百分比。5. 權利要求3所述的產品，其中，經定制的混合物包含對基于需要通過所述混合物獲得 的特性進行加權的因子的考量。6. 權利要求5所述的產品，其中，所述加權的因子包括一個因子。7. 權利要求5所述的產品，其中，所述一個因子是多個因子。8. 權利要求6所述的產品，其中，所述多個因子包括每個供體的年齡、種族同質性、健康 狀況和外在美麗度。9. 權利要求8所述的產品，其中，所述年齡因子包括僅處于12至35周歲的供體。10. 權利要求8所述的產品，其中，所述年齡因子包括僅處于18至30周歲的供體。11. 權利要求8所述的產品，其中，所述健康狀況因子包括排除患有遺傳疾病和因環境 條件導致過早老化的供體。12. 權利要求11所述的產品，其中，所述環境條件包括自由基生成。13. 權利要求12所述的產品，其中，所述自由基生成包括日曬、吸煙和較高的贅生物。14. 權利要求8所述的產品，其中，所述美麗度因子包括符合黃金比例。15. 權利要求2所述的產品，其中，所述局部產品選自由乳霜、精華液和乳液組成的組。16. 權利要求2所述的產品，其中，所述所期望的特性選自由以下特性組成的組:膚色、 皮膚彈性、皮膚光滑性、瘢痕減少、皺紋減少、對炎性刺激的反應、水分保持能力、產生新的 血管、輸送養分的傾向、皮膚厚度或密度、及其任意組合。17. 權利要求16所述的產品，其中，所述所期望的特性決定所述產品的定制和加權。18. 權利要求1所述的產品，其中，所述產品用于優化混合物對接受者的皮膚賦予所期 望的特性的潛能或效能。19. 一種制備非自體局部產品的方法，基于要對接受者的皮膚賦予的一種或多種所期 望的產品特性，由兩種以上分離自不同個體的同源或異源的成纖維細胞組織培養物或來自 培養物的提取物或培養基制備所述非自體局部產品。20. 權利要求19所述的方法，其中，能夠對所述產品進行定制以包含兩個以上的種族 群，其中一個種族群的供體的百分比大于另外的一個或多個種族群的供體的百分比。
【文檔編號】C12N5/0775GK105916979SQ201480062569
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年11月14日
【發明人】J·沙克奈, M·S·沃茲曼, D·H·麥克丹尼爾
【申請人】德瑪奇實驗室公司