重組專性厭氧革蘭氏陽性菌的制作方法

重組專性厭氧革蘭氏陽性菌的制作方法
【專利摘要】本發明的目的在于通過抗TRAIL?R1抗體和抗TRAIL?R2抗體有效地誘導癌細胞死亡，同時減輕對正常細胞的毒性。一種重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，以可表達狀態含有編碼融合蛋白質的核酸，該融合蛋白質含有3個以上的抗TRAIL?R1單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL?R2單鏈抗體。
【專利說明】
重組專性厭氧革蘭氏陽性菌
技術領域
[0001] 本發明涉及將重組專性厭氧革蘭氏陽性菌作為有效成分的抗腫瘤劑和腫瘤檢測 用標記物。
【背景技術】
[0002] TRAIL(TNF_related apoptosis-inducing ligand)屬于TNF超家族，是對各種癌 細胞誘導細胞死亡(apoptosis細胞凋亡）的蛋白質。TRAIL在生物體內形成三聚體，在細胞 內與具有死亡結構域的TRAIL受體(TRAIL-RUTRAIL-R2)結合。已知TRAIL結合時TRAIL受體 聚集形成三聚體，由此將細胞死亡信號傳導到細胞內。已知TRAIL的受體除了上述TRAIL-尺1、了1^11^-1?2以外，還有了1^11^-1?31^11^-1?4和屬于可溶性受體的骨保護素（圖1) (^1^11^-R3、TRAIL-R4和骨保護素完全或部分地缺失死亡結構域，這些受體即使結合TRAIL也不誘導 細胞死亡，因此稱為誘餌受體。
[0003] TRAIL由于在正常細胞中不易引起細胞死亡，因此作為抗腫瘤藥正在進行開發。然 而，為了利用TRAIL對癌細胞有效地誘導細胞死亡，需要開發不與上述誘餌受體結合，有效 地與TRAIL-R1和TRAIL-R2結合，向細胞內傳導細胞死亡信號的系統。對TRAIL-R1和TRAIL-R2的激動性(agon i s t)抗體由于不與上述誘t耳受體結合，所以能夠比TRAIL更有效地誘導細 胞死亡，且血中的半衰期長，因此能夠延長給藥間隔。因此，這些抗體現在處于臨床階段(非 專利文獻 1)。然而，HGS-ETR1 (抗 hTRAIL(人 TRAIL)-R1 激動性抗體)和 HGS-ETR2(抗 hTRAIL-R2激動性抗體)是二價的，因此在沒有具有Fc受體的NK細胞、巨噬細胞所致的抗體的交聯的 情況下，無法誘導TRAIL受體形成三聚體（圖2a)。因此，存在這些抗體在臨床試驗中沒有體 現顯著的治療效果的問題(非專利文獻2)。
[0004] 作為在NK細胞、巨噬細胞不參與的情況下能夠直接使癌細胞膜上的hTRAIL-R2分 子凝聚來傳導細胞死亡信號的強效激動性抗體，已知有HGS-TR2J(KMTR2)(非專利文獻3) (圖2b)。另外，也已知針對hTRAIL-R2的美洲駝單鏈VHH抗體的3~5聚體在NK細胞、巨噬細胞 不參與的情況下對表達hTRAIL-R2的癌細胞非常強效地誘導細胞死亡（專利文獻1)(圖3)。 另一方面，認為hTRAIL-Rl和hTRAIL-R2不僅在癌細胞中表達，也在各種人正常組織中表達， 特別是人正常肝細胞對hTRAIL、抗hTRAIL-R激動性抗體是敏感性的（非專利文獻4和非專利 文獻5)，因此hTRAIL-R激動性抗體作為副作用引起肝損傷。
[0005] 現有技術文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻 1:PCT W0/2011/098520
[0008] 非專利文獻
[0009] 非專利文獻l:Ghobrial等，2005，CA Cancer J Clin. ,55(3)，ρρ· 178-194
[0010] 非專利文獻2:Micheau等，2013，Br J Pharmacol. ,169(8)，ρρ· 1723-1744
[0011] 非專利文獻3:Motoki等，2005，Clin Cancer Res. ,11(8)，ρρ·3126-3135
[0012] 非專利文獻4:加等，2000，恥七]^(1.，6(5)4口.564-567
[0013] 非專利文獻5:Mori等，2004，Cell Death Differ. ,11(2)，ρρ·203-207

【發明內容】

[0014] 本發明的目的在于通過抗TRAIL-R1抗體和抗TRAIL-R2抗體有效地誘導癌細胞死 亡，同時減少對正常細胞的毒性。
[0015] 本發明人為了解決上述課題進行了深入研究，結果首次發現制作雙歧桿菌，通過 該重組雙歧桿菌的靜脈給藥能夠誘導腫瘤局部的癌細胞死亡，所述雙歧桿菌表達、分泌具 有強效激動劑活性的抗hTRAIL-R2VHH抗體。另外，本發明人取得了能夠識別癌細胞膜上的 hTRAIL-Rl分子的新型抗hTRAIL-RIVHH抗體。根據本發明，通過腫瘤部位局部給予具有強效 激動劑活性的抗hTRAIL-Rl和抗hTRAIL-R2抗體，能夠減少對正常細胞的毒性，并且有效地 誘導癌細胞死亡。
[0016] 本發明基于該研究結果而完成，具體提供以下發明。
[0017] (1) -種重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，以可表達狀態含有編碼融合蛋白質的核酸， 該融合蛋白質含有信號肽以及3個以上的抗TRAIL-R1單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL-R2 單鏈抗體。
[0018] (2)根據（1)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，專性厭氧革蘭氏陽性菌為 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 〇
[0019] (3)根據(1)或(2)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗TRAIL-R1單鏈 抗體，
[0020] ⑶R1含有由序列號22表示的氨基酸序列，
[0021 ] ⑶R2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和
[0022]⑶R3含有由序列號24表示的氨基酸序列。
[0023] (4)根據（1)~（3)中任一項所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗 TRAIL-R2單鏈抗體，
[0024]⑶R1含有由序列號15表示的氨基酸序列，
[0025] ⑶R2含有由序列號16表示的氨基酸序列，和
[0026] ⑶R3含有由序列號17表示的氨基酸序列。
[0027] (5)根據（1)~(4)中任一項所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，上述融合蛋 白質進一步含有功能性肽。
[0028] (6)根據(5)所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，功能性肽為標記蛋白質。
[0029] (7)-種抗腫瘤劑，將（1)~(6)中任一項所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌作為 有效成分。
[0030] (8)-種抗 TRAIL-R1 抗體，其中，
[0031]⑶R1含有由序列號22表示的氨基酸序列，
[0032] ⑶R2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和
[0033]⑶R3含有由序列號24表示的氨基酸序列。
[0034]本說明書包含作為本申請的優先權的基礎的日本專利申請2014-003441號的說明 書和/或附圖中記載的內容。
[0035]根據本發明，通過腫瘤部位局部給予具有強效激動劑活性的抗hTRAIL-Rl抗體和 抗hTRAIL-R2抗體，能夠減少對正常細胞的毒性，并且有效地誘導癌細胞死亡。
【附圖說明】
[0036]圖1是TRAIL及其受體的結構和誘導細胞死亡的信號傳導的簡圖。
[0037]圖2是表示對TRAIL-R的通常抗體a和具有激動劑活性的抗體b的細胞死亡信號的 細胞內傳導的差異的簡圖（通常抗體的情況下，介由TRAIL的細胞凋亡需要NK細胞、巨噬細 胞c所致的交聯。KMTR2抗體的情況下，介由TRAIL的細胞凋亡不需要NK細胞、巨噬細胞所致 的交聯）。
[0038]圖3是表示單鏈VHH抗體的3~5聚體(該圖中為VHH4)在沒有NK細胞、巨噬細胞所致 的交聯的情況下對表達hTRAIL-R的癌細胞誘導細胞凋亡的簡圖。
[0039] 圖 4 表示純化 hTRAIL-Rl:Fc(a)、hTRAIL-R2:Fc(b(l)WPmTRAILQJntTRAIL)-R2: Fc (b (2))的SDS-PAGE (SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳）圖像。
[0040] 圖5表示純化后的4E6單體的SDS-PAGE圖像。箭頭表示4E6單體。
[0041 ] 圖6表示由ELISA得到的4E6單體對hTRAIL-R2: Fc抗原的結合活性的測定結果。 [0042] 圖7表示由Biacore X-100得到的4E6單體與hTRAIL-R2:Fc抗原的解離常數的測定 結果。
[0043]圖8表示純化后的4P6單體的SDS-PAGE圖像。
[0044]圖9表示由ELISA得到的4P6單體和4E6單體的結合特異性的解析結果。
[0045] 圖10表示由Biacore X-100得到的4P6單體與hTRAIL-Rl :Fc抗原的解離常數的測 定結果。
[0046] 圖11表示4P6單體和4E6單體的拮抗活性。
[0047] 圖12是在大腸桿菌中表達的4E6二聚體Toxin(a)、4E6二聚體EGFP(b)和4E6四聚體 (c)的基因結構的示意圖。
[0048] 圖13表示純化的大腸桿菌表達重組蛋白質(a: 4E6二聚體Toxin、b: 4E6二聚體EGFP 和c: 4E6四聚體）的SDS-PAGE圖像。
[0049] 圖14表示重組蛋白質（a: 4E6二聚體Toxin和4E6二聚體EGFP以及b: 4E6單體和4E6 四聚體)對人大腸癌細胞C〇1〇205細胞的細胞死亡誘導活性。
[0050] 圖15表示利用4E6二聚體EGFP的癌細胞(a:Colo205細胞和b:BxPC-3細胞）的熒光 染色。縱軸表示細胞數，橫軸表示4E6二聚體EGFP的熒光強度。
[0051 ] 圖16表示在大腸桿菌中表達的抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)對人大腸 癌細胞C〇1〇205細胞(a)和胰腺癌細胞BxPC-3細胞(b)的細胞死亡誘導作用。
[0052] 圖17表示由雙歧桿菌培養上清液lmL純化而得的4E6四聚體和4E6二聚體EGFP的 SDS-PAGE圖像。4E6四聚體顯示3克隆的結果，4E6二聚體EGFP顯示2克隆的結果。
[0053] 圖18表示由雙歧桿菌培養上清液純化而得的4E6四聚體(4E6四聚體)對C〇1〇205細 胞的癌細胞死亡誘導活性。
[0054]圖19表示移植了C〇1〇205細胞的裸小鼠中的分泌4E6四聚體的雙歧桿菌的抗腫瘤 效果。腫瘤體積以mm3計，由平均值+標準誤差(η = 6)表示。
[0055]圖20表示在移植了C〇1〇205細胞的裸小鼠中給予分泌4Ε6四聚體的雙歧桿菌時的 體重變化。體重由平均值+標準偏差(η = 6)表示。
[0056]圖21表示移植了 BxPC-3細胞的裸小鼠中的分泌4E6四聚體的雙歧桿菌的抗腫瘤效 果。腫瘤體積以mm3計，由平均值+標準誤差(η = 6)表示。
[0057]圖22表示在移植了BxPC-3細胞的裸小鼠中給予分泌4Ε6四聚體的雙歧桿菌時的體 重變化。體重由平均值+標準偏差(η = 6)表示。
[0058]圖23表示純化的大腸桿菌表達重組蛋白質(4Ρ6三聚體)的SDS-PAGE圖像。
[0059] 圖24表示在大腸桿菌中表達的抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4Ρ6三聚體)對人大腸 癌細胞C〇1〇205細胞的細胞死亡誘導作用。
[0060]圖25表示由雙歧桿菌培養上清液純化而得的4P6三聚體的SDS-PAGE圖像。
[00611圖26表示由雙歧桿菌培養上清液純化而得的抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三 聚體)對人大腸癌細胞C010205細胞(a)和胰腺癌細胞BxPC-3細胞(b)的細胞死亡誘導作用。 [0062] 圖27表示移植了 BxPC-3-Luc#2細胞的裸小鼠中的分泌4P6三聚體的雙歧桿菌的抗 腫瘤效果。腫瘤體積以mm3計，由平均值+標準誤差(n = 5)表示。
[0063] 圖28表示在移植了 BxPC-3-Luc#2細胞的裸小鼠中給予分泌4P6三聚體的雙歧桿菌 時的體重變化。體重由平均值+標準誤差(η = 5)表示。
【具體實施方式】
[0064]以下對本發明進行具體說明。
[0065] 1.重組專性厭氧革蘭氏陽性菌
[0066] 1-1.概要和定義
[0067] 本發明的第1方式為重組專性厭氧革蘭氏陽性菌（以下，通常簡稱為"重組細菌"）。 本發明的重組細菌是以可表達狀態含有編碼融合蛋白質的核酸的藥劑遞送載體。
[0068] "專性厭氧革蘭氏陽性菌"是指被分類為革蘭氏陽性菌的專性厭氧菌。在此，"專性 厭氧菌"也被稱為嚴格厭氧菌，是具有在高氧存在下不能增殖而滅絕的性質的細菌。因此， 在哺乳動物的體內，可以在低氧下在厭氧狀態的消化器官內、主要在腸內增殖，但在存在溶 解氧的血液等體液中、通常的組織內無法增殖。"革蘭氏陽性菌"是指通過革蘭氏染色被染 成紫色或藏青色的細菌的通稱。革蘭氏陽性菌已知有桿菌、球菌、螺旋菌，但在本說明書中 沒有特別限定。由于革蘭氏陽性菌不含有內毒素(Endotoxin)，因此死后也不釋放出內毒 素。因此，從安全性方面考慮，優選作為本發明的藥劑遞送載體。作為本發明的重組細菌，例 如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)(本說明書中，以下將雙歧桿菌屬總稱為"雙歧桿菌"）、梭 菌屬（(：1〇^4(111 1111)可以符合。優選為雙歧桿菌。這是由于雙歧桿菌不分泌外毒素 (Exotoxin)，且日常被用作乳酸菌，對人體等的安全性得到確認。雙歧桿菌可以是任意的種 類，但優選生活在人的腸道內的種類，具體而言為雙叉雙歧桿菌(B.bifidum)、長雙歧桿菌 (B . Ion gum)、短雙歧桿菌（B.brave)、嬰兒雙歧桿菌（B.inf antis)和青春雙歧桿菌 (B.adolescentis)〇
[0069] 1-2.構成
[0070] 本發明的專性厭氧革蘭氏陽性菌以可表達狀態含有編碼融合蛋白質的核酸（以 下，通常稱為"融合基因"）。以下，對表征本發明的重組細菌的融合基因和使其為可表達狀 態的表達盒的構成進行具體說明。
[0071] 1-2-1.融合基因的構成
[0072] 在本說明書中"編碼融合蛋白質的核酸(融合基因)"是指利用基因重組技術融合 多個基因等構建的、編碼融合蛋白質的外源性核酸。融合基因以被插入到后述的表達盒內 的狀態被導入到本發明的重組細菌內。
[0073] 本說明書中"融合蛋白質"是指含有信號肽、3個以上的單鏈抗體和任意的功能性 肽并將它們連接而成的細胞外分泌性蛋白質。信號肽、單鏈抗體和功能性肽可以直接連接， 也可以介由連接肽間接地連接。連接肽的長度和氨基酸序列只要不阻礙單鏈抗體和功能性 肽各自的功能，就沒有特別限定。例如，優選20個氨基酸以下或15個氨基酸以下不自折疊的 氨基酸序列等。作為本發明中使用的連接肽，例如可舉出IE G RM D連接肽（序列號2 7)和 (GGSGG)2連接肽(序列號28)。以下，對構成融合蛋白質的信號肽、單鏈抗體和功能性肽進行 具體說明。
[0074] (1)信號肽
[0075] 信號肽是細胞內生物合成的蛋白質向細胞外轉移所必需的肽。通常，在N末端側配 置Lys和Arg這樣具有正電荷的氨基酸，與其連接地配置Ala、Leu、Val、lie、Val和Phe這樣疏 水性高的氨基酸序列。另外，在信號肽的C末端側，可以具有促進信號肽的切割和分泌的信 號序列后插入序列和/或包含從融合蛋白質中切割信號肽的信號肽酶識別部位的氨基酸序 列。信號肽擔負將在本發明的細菌內表達的上述融合蛋白質介由存在于膜的轉位因子等分 泌到細胞外的功能。信號肽的氨基酸序列沒有特別限定。可以利用能夠在專性厭氧革蘭氏 陽性菌內發揮功能的公知的所有信號序列的氨基酸序列。另外，信號肽的氨基酸長度也沒 有特別限定。通常在3個氨基酸~60個氨基酸的范圍內即可。但是，為了防止融合蛋白質的 分子量過大，優選氨基酸長度短的信號肽。
[0076] 信號肽配置于融合蛋白質的N末端側。
[0077] (2)單鏈抗體
[0078] 上述融合蛋白質包含3個以上的單鏈抗體。本說明書中"單鏈抗體"是指由單鏈多 肽構成、且能夠單獨識別靶物質并結合的抗體。這是因為由兩條鏈以上構成的抗體由于分 子量過大，因此在專性厭氧革蘭氏陽性菌內不表達的可能性、構建不出具有抗體功能的適 當的立體結構的可能性高。因此，本發明的單鏈抗體優選為每1個的分子量為35kDa以下的 低分子抗體。天然抗體和人工抗體不限。
[0079] 本發明的單鏈抗體典型的是由互補性決定區（CDR)和框架區(FR)所組成的可變區 而構成。互補性決定區是顯示可變性、對抗體賦予結合特異性的區域。另一方面，框架區是 可變區的相對保守的部分。完整的可變結構域包括由3個CDR連接的4個FR。3個CDR從其N末 端依次被稱為CDR1、CDR2和CDR3，4個FR從其N末端依次被稱為FR1、FR2、FR3和FR4。因此，在 可變區內，上述CDR和FR從氨基酸末端到羧基末端方向按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4的順序排列。
[0080] 本說明書中"天然抗體"是指具有與任意一種脊椎動物產生的抗體相同的氨基酸 序列的抗體。作為天然抗體的單鏈抗體的具體例，例如可舉出駱駝科的動物產生的單鏈抗 體(Hamers-Casterman C.，et al.，1993，Nature 363:446-448)(以下，本說明書中稱為"胳 駝科單鏈抗體"）。駱駝科單鏈抗體是沒有L鏈而僅由Η鏈構成的抗體，能僅以Η鏈的V H區域與 抗原結合，因此分子量約為14kDa，僅為通常的抗體的十分之一左右。另外，一般具有抗原親 和性高，對熱、酸和堿的耐性高的性質（Deffar，K.，et al.，2009，African Journal of Biotechnology 8(12):2645-2652)。因此，作為本發明中的單鏈抗體非常適合。駱駝科的動 物物種只要能夠產生駱駝科單鏈抗體，則其種類不限。例如，也可以利用來自美洲駝、羊駝、 駱駝等任一動物物種的抗體。
[0081] 本說明書中"人工抗體"是指人工構建的抗體。例如除在上述天然抗體的氨基酸序 列中導入適當變異的單鏈抗體以外，還可舉出自然界中原則上不存在的進行了結構上的改 變的單鏈抗體。作為這樣的人工抗體的具體例，可舉出嵌合抗體、人源化抗體、單鏈Fv (scFv:single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995，Pierce Chemical C。·，Rockford, IL)、雙鏈抗體（diabody)、三鏈抗體 (tr iabody)或四鏈抗體(tetrabody)等。
[0082] "嵌合抗體"是指抗體分子的可變區和恒定區分別來自不同種類的動物的抗體。嵌 合抗體的制作可以使用公知的方法進行，例如可以如下得到，即通過將編碼抗體V區域的核 酸和編碼人抗體C區域的核酸連接，將其整合到表達載體并導入宿主而產生。
[0083] "人源化抗體"是指也被稱為重構(reshaped)人抗體的修飾抗體。人源化抗體通過 將來自免疫動物的抗體的CDR移植到人抗體的互補性決定區而構建。還已知其一般的基因 重組技術。
[0084]單鏈Fv是具有在免疫球蛋白分子中將位于L鏈和Η鏈的可變區（即，分別為I和Vh) 通過足夠長的柔軟性接頭連接而包含于1跟多肽鏈的結構的、分子量約35kDa以下的合成抗 體。單鏈Fv內的兩個可變區可以相互自集合而形成一個功能性抗原結合部位。
[0085]上述融合蛋白質中，單鏈抗體為了使TRAIL聚集形成三聚體而必須含有3個以上。 但是，抗體數變多時，融合蛋白質的分子量變大，因此通常優選數個，例如3~6個、3~5個或 3~4個。各個單鏈抗體優選由適當的連接肽連接。連接肽的長度、氨基酸序列只要不阻礙各 個單鏈抗體的抗原結合活性，就沒有特別限定。
[0086] 上述融合蛋白質含有3個以上識別相同抗原的單鏈抗體。例如，將hTRAIL-R1作為 抗原時，上述融合蛋白質均含有3個以上識別相同的hTRAIL-Rl的單鏈抗體。
[0087] 本發明中，抗體的"價"是指1分子抗體所具有的抗原結合部位的個數。例如，IgG是 1分子中具有2個抗原結合部位的2價的抗體。上述單鏈抗體是每1分子具有1個抗原結合部 位的1價的抗體。本發明的融合蛋白質由于含有3個以上的單鏈抗體，因此整體為3價以上。
[0088] 單鏈抗體只要在融合蛋白質中是信號肽的C末端側，則與后述的功能性肽的順序 就沒有特別限制，但優選配置于功能性肽的N末端側。
[0089]本發明中的單鏈抗體的靶物質為TRAIL-R1或TRAIL-R2。如上所述本發明的重組細 菌僅能在厭氧環境下增殖，因此在生物體內成為厭氧環境下的細胞適合作為靶細胞。具體 而言，作為適合的靶細胞，可舉出腫瘤細胞或腸道上皮細胞。以下，對抗TRAIL-R1抗體和抗 TRAIL-R2抗體進行具體說明。
[0090] (i)抗TRAIL-R1 抗體
[0091] 本發明中，"抗TRAIL-R1 單鏈抗體"是指針對TRAIL-R1 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAIL 受體 1) 的單鏈抗體。本發明中使用的抗 TRAIL-R1 單鏈 抗體只要與TRAIL-R1特異性結合，就沒有特別限定。作為可在本發明中使用的抗TRAIL-R1 單鏈抗體，例如可舉出在本說明書的實施例中取得并使用的4P6。4P6是來自羊駝的單鏈VHH 抗體，CDR1含有由序列號22表示的氨基酸序列，CDR2含有由序列號23表示的氨基酸序列，以 及CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列。本發明中使用的抗TRAIL-R1單鏈抗體的框架區 的序列沒有特別限定，但例如可以使用Maass D.R.，et al·，2007, J Immunol Methods. 324:13-25中記載的羊§它單鏈抗體(例如，上述文獻中記載的Clone A02)的框架區 的序列。因此，抗TRAIL-R1單鏈抗體沒有限定，但例如FR1可以含有由序列號18表示的氨基 酸序列，FR2可以含有由序列號19表示的氨基酸序列，FR3可以含有由序列號20表示的氨基 酸序列和FR4可以含有由序列號21表示的氨基酸序列。
[0092]本發明中使用的融合蛋白質特別優選具有與TRAIL-R1結合而誘導細胞凋亡的激 動劑活性。TRAE-R1通過聚集成三聚體以上來誘導細胞凋亡，因此為了使TRAE-R1活化，上 述融合蛋白質如上所述特別優選含有3個以上、4個以上、5個以上或6個以上例如3個、4個、5 個或6個的抗TRAIL-R1單鏈抗體。
[0093]作為本發明的一個方式，可舉出⑶R1含有由序列號22表示的氨基酸序列、CDR2含 有由序列號23表示的氨基酸序列和CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列的抗TRAIL-R1 抗體。該抗體的框架區的序列沒有特別限定，但例如可以使用上述的Maass D.R的文獻中記 載的序列，因此，FR1可以含有由序列號18表示的氨基酸序列，FR2可以含有由序列號19表示 的氨基酸序列，FR3可以含有由序列號20表示的氨基酸序列和FR4可以含有由序列號21表示 的氨基酸序列。為了使TRAIL-R1活化，優選該抗體為3價以上。另外，該抗體可以為如上所述 的人工抗體，例如嵌合抗體或人源化抗體。
[0094] 對TRAIL-R1的激動性抗體介由TRAIL-R1誘導細胞凋亡，因此本發明的抗體可以用 作細胞凋亡誘導劑。
[0095] (ii)抗TRAIL-R2 抗體
[0096] 本發明中，"抗TRAIL-R2單鏈抗體"是指針對TRAIL-R2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2，TRAIL受體2)的單鏈抗體。本發明中使用的抗TRAIL-R2單鏈 抗體只要與TRAIL-R2特異性結合，就沒有特別限定。作為本發明中使用的抗TRAIL-R2單鏈 抗體，例如，可舉出上述文獻W02011 /098520中記載的4E6。4E6為美洲駝單鏈VHH抗體，其 CDR1含有由序列號15表示的氨基酸序列，CDR2含有由序列號16表示的氨基酸序列和CDR3含 有由序列號17表示的氨基酸序列。
[0097] 本發明中使用的融合蛋白質特別優選具有與TRAIL-R2結合而誘導細胞凋亡的激 動劑活性。TRAIL-R2通過聚集成三聚體以上來誘導細胞凋亡，因此為了使TRAIL-R2活化，上 述融合蛋白質如上所述特別優選含有3個以上、4個以上、5個以上或6個以上例如3個、4個、5 個或6個的抗TRAIL-R2單鏈抗體。
[0098] 針對TRAIL-R2的激動性抗體介由TRAIL-R2誘導細胞凋亡，因此本發明的抗體可以 用作細胞凋亡誘導劑。
[0099] (3)功能性肽
[0100]上述融合蛋白質中任意含有功能性肽。本說明書中"功能性肽"是指在生物體內或 細胞內具有特定的生物活性例如酶活性、催化活性、作為底物的功能或生物學抑制或增強 功能（例如，細胞毒活性）的肽。具體而言，例如可舉出熒光蛋白質或發光蛋白質、酶或外毒 素。
[0101 ]功能性肽的來源生物物種不限。另外，功能性肽可以為天然型或非天然型中的任 一種。天然型的功能性多肽是指自然界中存在的肽。另一方面，非天然型的功能性多肽是指 基于天然型的功能性多肽的氨基酸序列，在不喪失該功能性肽具所有的特有的功能的范圍 內，在氨基酸序列中導入了適當變異(進行了氨基酸的添加、缺失、取代的變異)的修飾肽。
[0102] 上述融合蛋白質中可以含有2個以上功能性肽。但是，含有多個功能性肽的情況 下，由于融合蛋白質整體的分子量過大，因此可以將功能性肽的總分子量設為80kDa以下， 優選設為40kDa以下。包含2個以上功能性肽的情況下，各個功能性肽的種類可以相同也可 以不同。例如可舉出將外毒素與酶或者外毒素與熒光蛋白質或發光蛋白質組合而成的功能 性肽。包含2個以上功能性肽的情況下，各個功能性肽可以直接連接，但優選以各個功能性 肽能夠有效地發揮獨自的功能的方式用適當的連接肽連接。連接肽的長度、氨基酸序列只 要不阻礙功能性肽的功能，就沒有特別限定。通過在1個融合蛋白質中包含2個以上的不同 的功能性肽，能夠對單鏈抗體所識別的靶物質賦予不同的功能。
[0103] 功能性肽只要在融合蛋白質中在信號肽的C末端側，就沒有特別限制，但優選配置 于上述單鏈抗體的C末端側。
[0104] 以下，對在本發明的重組細菌中可以作為功能性肽起作用的上述的熒光蛋白質或 發光蛋白質、酶、或者外毒素進行具體說明。
[0105] (i)焚光蛋白質或發光蛋白質(標記蛋白質）
[0106] 對于作為功能性肽的熒光蛋白質的種類，只要堿基序列已知，就沒有特別限定。可 以為上述天然型和非天然型中的任一種。但是，出于上述理由優選氨基酸長度短的熒光蛋 白質。另外，激發波長、熒光波長也沒有特別限定。這些波長根據情況和需要而適當地選擇 即可。作為具體的熒光蛋白質，例如可舉出CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、APC、GFP等。
[0107] 另外，對于發光蛋白質，也是只要堿基序列已知，其種類就沒有特別限定。與上述 熒光蛋白質同樣，可以為天然型和非天然型中的任一種，但優選氨基酸長度短的發光蛋白 質。作為具體的發光蛋白質，例如可舉出水母發光蛋白等。
[0108] (ii)酶
[0109] 對于作為功能性肽的酶的種類，只要堿基序列已知，就沒有特別限定。可以為與靶 物質直接作用的酶，也可以是不與靶物質直接作用而在其周邊發揮功能的酶。作為后者的 具體例，可舉出有助于發光的熒光素酶、過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶)等。在上述單 鏈抗體上連接有酶的融合蛋白質可以作為免疫酶(Immunoenzyme)發揮功能。
[0110] (iii)外毒素
[0111] "外毒素"（Exotoxin)是指細菌分泌到菌體外的毒性蛋白質。外毒素只要具有細胞 毒活性且其堿基序列已知，則其種類不限。例如可舉出綠膿桿菌毒素 (Pseudomonas toxin; PT)及其衍生物例如從PT除去了細胞粘接結構域的外毒素 A、白喉毒素 (Diphtheria toxin: DT)及其衍生物以及蓖麻毒素（Ricin)及其衍生物（Brinkmann U.&Pastan 1.,1994, Biochimica et Biophysica Acta，1198(l):27_45)。已知綠胺桿菌外毒素 A被攝入到癌細 胞內后，通過對EF-2進行ADP核糖基化而失活來抑制蛋白質合成，發揮較強的殺滅細胞效 果。在上述單鏈抗體上連接有外毒素的融合蛋白質可以作為免疫毒素（Immunotoxin)發揮 功能。
[0112] 1-2-2.表達盒的構成
[0113] 本說明書中"表達盒"是指含有上述融合基因并處于能夠將該融合基因作為融合 蛋白質表達的狀態的表達系統。本說明書中，"能表達的狀態"是指以該表達盒中含有的融 合基因能夠在重組細菌內表達的方式配置在基因表達所需要的元件的控制下的狀態。基因 表達中需要的元件可舉出啟動子和終止子。
[0114] 啟動子只要是能夠在重組細菌內工作的啟動子，就沒有特別限制，但優選來自使 用的專性厭氧革蘭氏陽性菌的啟動子。例如，專性厭氧革蘭氏陽性菌使用雙歧桿菌的長雙 歧桿菌的情況下，可舉出長雙歧桿菌的hup基因啟動子(序列號25)。另外，啟動子中根據其 表達控制的性質，已知有過表達型啟動子、組成型啟動子、位點特異性啟動子、階段特異性 啟動子或誘導型啟動子等。本發明中的表達盒中使用的啟動子是哪一種啟動子，沒有特別 限定。根據需要適當地選擇即可。優選為過表達型啟動子或組成型啟動子。在上述表達盒 中，啟動子配置在上述融合基因的起始密碼子的上游的5'側。
[0115] 終止子只要是能夠在重組細菌內終結由上述啟動子轉錄的基因的轉錄的序列，就 沒有特別限定。例如，可舉出組蛋白那樣的蛋白質終止子(HUT)(序列號26)。優選來自與啟 動子相同的生物物種的終止子，更優選在啟動子的來源生物物種的基因組的基礎上與該啟 動子成組的終止子。在上述表達盒中，終止子配置在上述融合基因的終止密碼子的下游的 3,側。
[0116] 為了使上述融合蛋白質在重組細菌內穩定地表達，可以將包含表達盒的載體作為 表達載體導入該菌體內。或者，也可以介由同源性重組而插入到該菌的基因組內。使用表達 載體的情況下，載體可以使用質粒等。載體使用含有能夠在本發明的重組細菌內復制且在 菌體內穩定地保持的適當的選擇標記基因的載體。載體可以是在大腸桿菌等其他細菌內也 能夠復制的穿梭載體。例如可舉出pKKT427、pBESAF2、pPSABl等。插入到重組細菌的基因組 內的情況下，可以僅將融合基因以成為可表達狀態的方式插入到重組細菌的基因組中。即， 可以在重組細菌的內源性的啟動子、終止子的控制下插入融合基因。
[0117] 表達盒可以是在1個表達盒內含有1個融合基因的單順反子，也可以是含有2個以 上融合基因的多順反子。
[0118] 1-3.重組專性厭氧革蘭氏陽性菌的制造方法
[0119] 本發明的重組細菌可以使用該領域中公知的分子遺傳學的方法來制造。例如，如 果為上述融合基因，則使用例如Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubelet al. , Short Protocols in Molecular Biology，3rd Ed·，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology( 1995)，John Wiley&Sons所記載的方法構建分別編碼信號肽和單鏈抗 體的核酸即可。
[0120] 為了取得上述單鏈抗體，可以使用編碼與TRAIL-R1或TRAIL-R2結合的抗體的基因 的堿基序列信息。該抗體的堿基序列信息例如可以參照前述的CDR和FR的堿基序列。
[0121] 重新制作針對TRAIL-R1或TRAIL-R2的抗體的情況下，針對TRAIL-R1或TRAIL-R2的 單克隆抗體的制作根據在該領域內公知的方法進行即可。以下例示該制作例。
[0122] 將作為靶的TRAIL-R1或TRAIL-R2的細胞外結構域作為免疫原，給予駱駝科的動物 而進行免疫。如果需要，可以添加佐劑以有效地進行免疫。作為佐劑的例子，可舉出市售的 弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)等，可以將它們單獨使用或混合使用。免疫原溶 液的1次給藥量是相當于每1只上述動物含有約50~200yg的免疫原即可。免疫的間隔沒有 特別限定，初次免疫后，以幾天到幾周間隔、優選以1~4周間隔進行2~10次、優選5~7次追 加免疫。初次免疫之后，利用ELISA(Enzyme_Linked Immuno Sorbent Assay)法等反復進行 免疫動物的血清中的抗體效價的測定。接著，從免疫的動物采取抗體產生細胞。作為抗體產 生細胞，可舉出脾臟細胞、淋巴結細胞、末梢血細胞等，優選末梢血細胞。接下來，從末梢血 細胞提取RNA，使用寡聚dT引物和無規6mer引物合成cDNA。從該cDNA通過PCR擴增駱駝科單 鏈抗體的可變區（V.區域）的基因，在pCANTAB6(McCafferty J.，et al.，1994， Appl.Biochem.Biotech. ,47,157-173)等噬菌粒載體上整合上述基因，用電穿孔法導入到 大腸桿菌TG1中。使M13K07輔助噬菌體感染上述的大腸桿菌TG1，回收噬菌體，由此取得駱駝 科單鏈抗體可變區(Vhh區域)表達噬菌體文庫。標準地成為1 X 107pfu種以上的文庫。
[0123] 為了挑選表達針對靶抗原的抗體的噬菌體而進行生物淘選。上述生物淘選為如下 方法:使抗體噬菌體文庫與固定化的靶抗原反應，通過清洗將未結合的噬菌體除去后，使結 合的噬菌體洗脫并感染大腸桿菌而增殖，將上述操作進行3次至5次，由此濃縮相對于靶抗 原為特異性的噬菌體。使淘選的噬菌體再次感染大腸桿菌TG1后，將含有插入有V HH的 pCANTAB噬菌粒載體的TG1克隆分離，在各個TG1克隆中感染K07輔助噬菌體，得到展示Vhh抗 體的克隆化噬菌體。從其中選擇與抗原反應的克隆。可以從取得的噬菌體中得到抗體的堿 基序列。
[0124] 融合基因使用分子遺傳學的方法以可表達的方式被插入上述表達盒內。表達盒根 據需要而整合到例如質粒等載體中。為了在載體中整合表達盒，可以采用以適當的限制酶 切割表達盒的5 '末端和3'末端，在載體內的多克隆位點等對應的限制部位插入的方法等。 另外，載體是在本發明的重組細菌內可表達的表達用載體的情況下，也可以通過將上述融 合基因插入到該表達用載體的表達控制區域內（載體內的啟動子和終止子間的多克隆位點 等），與構建表達盒的同時構建目標表達載體。關于這些具體的方法，例如請參照上述Green and Sambrook(2012)中記載的方法。
[0125] 目標重組細菌可以通過將上述表達載體、表達盒或融合基因導入到作為藥劑遞送 載體的專性厭氧革蘭氏陽性菌中來制造。將表達載體等向目標專性厭氧革蘭氏陽性菌內導 入的方法使用該領域內公知的分子生物學方法即可。例如可以使用電穿孔法 (e 1 ectroporation法）、磷酸鈣法這樣的公知的方法。關于這些具體的方法，例如請參考上 述Green and Sambrook(2012)中記載的方法。
[0126] 2.抗腫瘤劑
[0127] 2-1.概要
[0128] 本發明的第2方式為抗腫瘤劑。本發明中"抗腫瘤劑"是指對腫瘤細胞具有細胞毒 活性，使該細胞達到細胞凋亡，結果能夠抑制腫瘤細胞的增殖的藥劑。但是，其藥效只要能 夠抑制腫瘤細胞的增殖即可，可以不根除腫瘤細胞。
[0129] 本發明的抗腫瘤劑的特征在于將第1方式的重組細菌作為有效成分。根據本發明 的抗腫瘤劑，通過作為有效成分的重組細菌僅在腫瘤內增殖，在腫瘤內分泌3個以上的抗 TRAIL-R1單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL-R2單鏈抗體，能夠有效地誘導腫瘤的細胞凋 亡，使腫瘤萎縮。
[0130] 2-2.構成
[0131] 本發明的抗腫瘤劑如上所述將第1方式的重組細菌作為有效成分。此時的重組細 菌的融合基因編碼如下單鏈抗體，即識別并結合TRAIL-R1的單鏈抗體和/或識別并結合 TRAIL-R2的單鏈抗體，TRAIL-R1和TRAIL-R2都是作為靶細胞的腫瘤細胞的表面抗原中的一 種。因此，作為本發明的抗腫瘤劑的有效成分的重組細菌分泌細胞外分泌性抗腫瘤細胞融 合蛋白質。
[0132] 成為本發明的抗腫瘤劑的靶標的腫瘤只要是表達TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的腫 瘤，無論良性、惡性，可以為任一種腫瘤。作為靶腫瘤，例如可舉出腦腫瘤、甲狀腺癌、口腔 癌、食道癌、胃癌、大腸癌、咽喉癌、肺癌、肝癌、腎癌、腎上腺癌、胰腺癌、膽道癌、子宮頸癌、 子宮體癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、肥大細胞瘤或黑色素瘤。
[0133] 本發明的重組細菌表達融合基因的情況下，作為其產物的細胞外分泌性抗腫瘤細 胞融合蛋白質被分泌到細胞外。分泌的融合蛋白質通過以單鏈抗體部分與作為靶物質的腫 瘤細胞結合，將TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多聚化來誘導細胞凋亡。
[0134] 作為本發明的有效成分的重組細菌以活菌狀態被包含在抗腫瘤劑中。本發明的第 1方式中記載的重組細菌在高濃度的氧存在下不能增殖，不久滅絕。因此，在生物體內，僅能 在氧分壓低的部位增殖、生存。作為這樣的部位的代表例，可舉出在進行性癌中所看到的腫 瘤(實體癌）的中心部位或腸道內。因此，本發明的抗腫瘤劑通過注射等進行體內給藥的情 況下，可以成為腫瘤選擇遞送性高的抗腫瘤劑。
[0135] 另外，本發明的抗腫瘤劑可以在不阻礙或抑制作為有效成分的重組細菌的生存、 增殖、融合蛋白質的表達和分泌的范圍內與其他抗腫瘤劑并用。
[0136] 本發明的抗腫瘤劑，以在活菌狀態下維持或保存重組細菌為前提，原則上可以用 該領域內公知的方法進行制劑化。例如，使用Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co.，Easton，Pa.)中記載的方法即可。具體的制劑化的方法因給藥方 法而不同。給藥方法大致區分為口服給藥和非口服給藥，但本發明的抗腫瘤劑的情況下，更 優選非口服給藥。
[0137] 對本發明的抗腫瘤劑進行非口服給藥時，作為其具體例，可舉出通過注射進行給 藥。通過注射給予本發明的抗腫瘤劑時，可以制備成懸浮液劑的形式，即將重組細菌與制藥 上可允許的溶劑混合，根據需要加入制藥上可允許的擔載體而成。
[0138] "制藥上可允許的溶劑"可以為水或水以外的藥學上可允許的水溶液或者油性液 體中的任一種。作為水溶液，例如可舉出含有生理鹽水、葡萄糖、其他輔助劑的等張液。作為 輔助劑，例如可舉出D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉、另外還有低濃度的非離子型 表面活性劑（例如、聚山梨醇酯80(TM)、HC0-60)、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯類等。作 為油性液體，可舉出芝麻油、大豆油，也可以與作為增溶劑的苯甲酸芐酯或芐醇并用。另外， 也可以與緩沖劑例如磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液、無痛化劑例如鹽酸普魯卡因、穩定劑例 如芐醇、苯酚、抗氧化劑配合。
[0139] 注射劑通過與制藥上允許的賦形劑、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、pH調節 劑等適當地組合，以一般認可的制藥實施所要求的單位用量形態混和來進行制劑化即可。 [0140]注射可舉出例如血管內注射、淋巴管內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射 等，但從作為本發明的抗腫瘤劑有效成分的重組細菌在腫瘤內增殖、抑制該腫瘤細胞的增 殖的機理考慮，在腫瘤灶的位置不明確的情況下，優選作為全身給藥的血管內注射或淋巴 管內注射等循環系統內給藥。血管內注射有靜脈內注射和動脈內注射等，在給予本發明的 抗腫瘤劑時可以為任一種。另一方面，在腫瘤灶的位置確定的情況下，除上述全身給藥以 外，也可以是對腫瘤直接給藥的局部給藥。
[0141] 將本發明的抗腫瘤劑口服給藥的情況下，除了作為有效成分的重組細菌以外，可 以添加制藥上可允許的擔載體。
[0142] "制藥上可允許的擔載體"是指為了使藥劑的制劑化、對生物體的適用容易，且維 持作為有效成分的重組細菌的生存，在不阻礙或不抑制該菌體的作用的范圍內添加的物 質。例如可舉出賦形劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、乳化劑、流動添加調節劑或潤滑劑。
[0143] 作為"賦形劑"，例如可舉出單糖、二糖類、環糊精和多糖類這樣的糖(具體而言，沒 有限定，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麥芽糊精、淀粉和 纖維素）、金屬鹽(例如，磷酸鈉或磷酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂）、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、 高分子量的聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、或者它們的組合。
[0144] 作為"粘合劑"，例如可舉出使用了玉米、小麥、稻米或馬鈴薯的淀粉而成的淀粉 糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯基吡咯烷 酬等。
[0145] 作為"崩解劑"，例如可舉出上述淀粉、羧甲基淀粉、交聯聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、 海藻酸或海藻酸鈉或者它們的鹽。
[0146] 作為"填充劑"，例如可舉出上述糖和/或磷酸鈣(例如，磷酸三鈣或磷酸氫鈣）。
[0147] 作為"乳化劑"，例如可舉出失水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸 酯、丙二醇脂肪酸酯。
[0148] 作為"流動添加調節劑"和"潤滑劑"，例如可舉出硅酸鹽、滑石、硬脂酸鹽或聚乙二 醇。
[0149] 此外，也可以根據需要含有矯味矯臭劑、懸浮劑、稀釋劑、表面活性劑、增量劑、賦 濕劑、保濕劑(例如，甘油、淀粉等）、吸附劑(例如，淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠體狀硅酸 等）、崩解抑制劑(例如，白糖、硬脂、可可脂、氫化油等）、涂布劑、著色劑、保存劑、抗氧化劑、 香料、調味劑、甜味劑、緩沖劑等。根據需要適當地使用上述的擔載體的一種或二種以上即 可。
[0150] 作為經口疫苗劑的劑型，例如，可以舉出固體劑型(包括片劑、丸劑、舌下劑、膠囊 劑、滴劑）、顆粒劑、粉劑、散劑、液劑等。此外，固體劑型可以根據需要制成實施了該領域內 公知的包衣的劑型，例如糖衣片、明膠包衣片、腸溶片、膜包衣片、雙層片、多層片。劑型的具 體形狀、大小只要都是各自的劑型在該領域內公知的劑型的范圍內即可，沒有特別限定。
[0151] 本發明的抗腫瘤劑中的重組細菌的含量原則上是按1次給藥可達到該菌體能夠在 靶腫瘤中生存且增殖的狀態的量，且對應用該重組細菌的受試者幾乎或完全沒有有害的副 作用的量即可。這樣的含量因抗腫瘤劑的靶細胞的種類、癌的進行度、腫瘤的大小、全身的 腫瘤灶數、抗腫瘤劑的劑型和給藥方法而不同，因此考察各自的條件而適當地決定。
[0152] 本說明書的抗腫瘤劑的給藥對象是具有腫瘤或具有腫瘤可能性高的受試者。本說 明書中"受試者"是指適用本發明的抗腫瘤劑的動物。例如哺乳動物，優選為人、狗、貓、馬、 小鼠、大鼠、兔子、牛、猴子等，更優選為人。
[0153] 2-3.效果
[0154] 根據本發明的抗腫瘤劑，作為有效成分的重組細菌僅在氧分壓低的腫瘤內生存和 增殖，分泌抗腫瘤細胞融合蛋白質。因此，可以將該融合蛋白質有效地傳導到腫瘤細胞，且 繼續起作用。另外，通過融合蛋白質的作用而抑制腫瘤細胞的增殖，腫瘤萎縮，由此組織中 的氧分壓高時，屬于專性厭氧革蘭氏陽性菌的重組細菌無法生存，因此能夠從生物體內自 動地排除。由此，能夠提供一種與以往的細菌療法相比，在利用非病原性的專性厭氧菌在不 對實體癌給予其他抗腫瘤藥的情況下，通過單獨向靜脈內給藥而能發揮抗腫瘤效果的安全 且簡便的治療方法。
[0155] 另外，本發明的抗腫瘤劑可以靜脈內注射，因此具有對受試者的侵襲性也低的優 點。
[0156] 3.腫瘤檢測用標記物
[0157] 3-1.概要
[0158] 本發明的第3方式為腫瘤檢測用標記物。本發明中"腫瘤檢測用標記物"是指能夠 在生物體內檢測腫瘤的標記物。
[0159] 本發明的腫瘤檢測用標記物的特征在于將第1方式的重組細菌作為有效成分。根 據本發明的腫瘤檢測用標記物，作為有效成分的重組細菌僅在腫瘤內增殖，在腫瘤內分泌 酶、熒光蛋白質或發光蛋白質，由此能夠監控生物體內的腫瘤的位置、大小。
[0160] 3-2.構成
[0161] 基本的構成遵循第2方式的抗腫瘤劑。因此，這里主要對與上述抗腫瘤劑不同的方 面進行說明，對于重復的構成，原則上省略。
[0162] 本發明的腫瘤檢測用標記物如上所述將第1方式的重組細菌作為有效成分。此時 的重組細菌的融合基因編碼識別作為靶細胞的腫瘤細胞的表面抗原并與其結合的單鏈抗 體，編碼功能性肽為標記蛋白質或誘導標記化的蛋白質。作為標記蛋白質，例如可舉出前述 的熒光蛋白質或發光蛋白質。另外，作為誘導標記化的蛋白質，可舉出以熒光素、魯米諾這 樣的發光素或熒光素為底物的酶(熒光素酶、過氧化物酶）。因此，作為本發明的腫瘤檢測用 標記物的有效成分的重組細菌分泌細胞外分泌性抗腫瘤細胞免疫標記物(免疫標記物）。
[0163] 本發明的重組細菌表達融合基因時，作為其產物的細胞外分泌性抗腫瘤細胞免疫 標記物被分泌到細胞外。分泌的免疫標記物在單鏈抗體部分與作為靶物質的腫瘤細胞的細 胞膜上的TRAIL-R1或TRAIL-R2結合，該細胞被標記化。具體而言，功能性肽為發光蛋白質或 熒光蛋白質這樣的標記蛋白質的情況下，腫瘤細胞被與單鏈抗體部分連接的這些標記蛋白 質直接標記。另一方面，功能性肽為酶的情況下，腫瘤細胞被與單鏈抗體部分連接的酶進行 酶標記。
[0164] 本發明的腫瘤檢測用標記物可以與第2方式的抗腫瘤劑并用。此時，作為有效成分 的重組細菌可以是將腫瘤檢測用標記物和抗腫瘤劑作為各自獨立的分子進行分泌的、即分 泌含有識別相同靶物質的單鏈抗體的不同融合蛋白質的、相同的或不同的重組細菌，也可 以是分泌在功能性蛋白質部分含有外毒素和標記蛋白質或酶的1種融合蛋白質的重組細 菌。這些情況下，能夠在對相同的腫瘤細胞標記化的同時，利用外毒素的作用來毒殺腫瘤細 胞。
[0165] 另外，也可以在不阻礙或抑制作為有效成分的重組細菌的生存、增殖、免疫標記物 的表達和分泌的范圍內，與其他抗腫瘤劑并用。
[0166] 3-3.檢測
[0167] 將本發明的腫瘤檢測用標記物給予受試者的情況下，如果該個體具有腫瘤，則作 為有效成分的重組細菌在該腫瘤內增殖，分泌抗腫瘤細胞免疫標記物。分泌的免疫標記物 將腫瘤細胞標記化。對于標記化的腫瘤細胞的檢測，在免疫標記物為發光蛋白質或熒光蛋 白質這樣的標記蛋白質的情況下，檢測該標記蛋白質自身發出的發光或熒光即可，另外，在 免疫標記物為酶標記的情況下，檢測給予至生物體內的熒光素等底物的由酶反應產生的發 光或熒光即可。免疫標記物的檢測方法沒有特別限定。由于大多腫瘤存在于生物體內部，因 此可以在通過開腹等手術使腫瘤露出后檢測免疫標記物，也可以從體外非侵襲地檢測生物 體內的發光或熒光。優選為從體外檢測的方法。作為從體外檢測來自免疫標記物的發光或 焚光的方法，沒有限定，但例如可以使用體內生物影像法。可以使用例如Ka t z，M. H. e t a 1.， 2003,Cancer Res .63:5521-5525, Schmitt,C.A.et al.,2002,Cancer Cell,1:289-298, Katz al · ,2003, J. Surg.Res · , 113:151-160等中記載的方法進行檢測。可以利用市 售的IVIS Imaging System(Caliper)、與其類似的裝置進行檢測。
[0168] 3-4.效果
[0169] 根據本發明的腫瘤檢測用標記物，可以基于免疫標記物從生物體外部監控生物體 內的腫瘤的位置和大小。另外，通過并用本發明的腫瘤檢測用標記物和第2方式的抗腫瘤 劑，從而在利用免疫毒素抑制腫瘤細胞的增殖的同時，利用免疫標記物從生物體外部檢測 生物體內的腫瘤，由此能夠經時監控腫瘤的萎縮、治愈效果。
[0170] 實施例
[0171] <實施例1:雙歧桿菌表達用抗人TRAIL-R2基因表達盒的制作>
[0172] (1)雙歧桿菌表達用抗hTRAIL-R2VHH抗體4聚體(4E6四聚體)的基因表達盒 [0173]對以下基因進行DNA合成(序列號1)，即，使用來自長雙歧桿菌hup基因的啟動子區 域(序列號25)、來自長雙歧桿菌的usp分泌信號序列（序列號29)、DTY(信號序列后插入序 列）、W0/2011/098520中記載的4E6的氨基酸序列、來自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2連接肽(序 列號28)和來自組蛋白樣蛋白質的終止子(HUT)(序列號26)，在C末端添加編碼His-Tag序列 的 DNA。
[0174] (2)雙歧桿菌表達用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠膿桿菌外毒素 A亞單位融合體 (4E6二聚體Toxin)的基因表達盒
[0175] 對以下基因進行DNA合成(序列號2)，即，使用來自長雙歧桿菌hup基因的啟動子區 域(序列號25)、來自長雙歧桿菌的usp分泌信號序列（序列號29)、DTY(信號序列后插入序 列）、W0/2011/098520中記載的4E6的氨基酸序列、來自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2連接肽(序 列號28)、綠膿桿菌外毒素 A(被pJH8(從ATCC購入)編碼的ExotoxinA的DNA序列）和來自組蛋 白樣蛋白質的終止子(HUT)(序列號26)，在C末端添加編碼His-Tag序列的DNA。
[0176] (3)雙歧桿菌表達用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠色熒光蛋白質融合體(4E6二聚 體EGFP)的基因表達盒
[0177] 使用來自長雙歧桿菌hup基因的啟動子區域(序列號25)、來自長雙歧桿菌的usp分 泌信號序列（序列號29)、DTY(信號序列后插入序列）和來自組蛋白樣蛋白質的終止子(HUT) (序列號26)，在4E6二聚體基因的3'末端添加編碼來自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2連接肽(序 列號28)+EGFP(Zhang G.et al.，1996，Biochem Biophys Res Commun,227(3) :707-711)基 因+His-Tag序列的DNA序列（序列號3)。
[0178] <實施例2: hTRAIL-Rl: Fc，hTRAIL-R2: Fc，mTRAIL-R2: Fc分泌表達果蠅培養細胞 的制作和重組蛋白質的純化>
[0179] (1)基因表達盒的制作
[0180] (1-1)果蠅培養細胞表達用人TRAIL-R1:羊駝Fc(hTRAIL-Rl:Fc)的基因表達盒 [0181 ]合成由ΚρηΙ位點、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucleic Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信號（Life Technologies)、hTRAIL-Rl細胞外區域 (Accession No.AAC51226,109~239氨基酸）、IEGRMD接頭（序列號27)、羊駝（alpaca) IgGlFc(Accession Ν〇·ΑΜ773729，102~335氨基酸）、His-Tag序列、終止密碼子和Xhol位點 構成的DNAJ序列號4)
[0182] (1-2)果蠅培養細胞表達用人TRAIL-R2:羊駝Fc(hTRAIL-R2:Fc)的基因表達盒
[0183] 合成由ΚρηΙ位點、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucl ei c Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信號（Life Technologies)、hTRAIL-R2 細胞外區域 (Accession No.Q6FH58,54~182氨基酸）、IEGRMD接頭（序列號27)，羊駝(alpaca)IgGIFc (Accession No.AM773729,102~335氨基酸）、His-Tag序列、終止密碼子和Xhol位點構成的 DNAJ序列號5)
[0184] (1-3)果蠅培養細胞表達用小鼠 TRAIL-R2:羊駝Fc(mTRAIL-R2:Fc)的基因表達盒
[0185] 合成由ΚρηΙ位點、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucl ei c Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信號（Life Technologies)、mTRAIL-R2 細胞外區域 (Accession No.Q9QZM4,52~177氨基酸）、IEGRMD接頭（序列號27)、羊駝(alpaca)IgGIFc (Accession No.AM773729,102~335氨基酸）、His-Tag序列、終止密碼子和Xhol位點構成的 DNAJ序列號6)
[0186] (2)hTRAIL-Rl:Fc，hTRAIL-R2:Fc，mTRAIL-R2:Fc 分泌表達果蠅培養細胞的制作和 重組蛋白質的純化
[0187] 為了得到融合了 hTRAIL-Rl、hTRAIL-R2、mTRAIL-R2的細胞外區域和羊駝IgGl的Fc 的蛋白質，制作在作為果蠅培養細胞的S2細胞中分泌表達這些重組蛋白質的載體pAc5.1/ 11丁1^11^-1?卟。、？厶。5.1/1^1^11^-1?2卩。、？厶。5.1/11^1^11^-1?2卩。。在？厶。5.1八5-^8厶質粒（1^& Technologies)的Kpnl、XhoI位點插入重組蛋白質的S2分泌表達基因盒。通過磷酸f丐法，以 與含有潮霉素抗性基因的pCoHygro質粒(Life Technologies)為19:1的比例導入到S2細胞 中。細胞在含有300yg/mL潮霉素 （Life Technologies)、10%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的Schneider ' s果繩培養基(Life Technologies)中培養，得到耐藥細胞。耐 藥細胞（IX 107細胞/mL)在含有20mM谷氨酰胺的EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies) 中培養，第7天回收培養上清液。重組蛋白質使用TALON樹脂(TAKARA BIO)進行純化。具體而 言，在填充有TAL0N樹脂的柱中添加培養上清液后，用清洗緩沖液(25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、5mM咪唑）清洗，用洗脫緩沖液（25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、150mM咪唑）洗脫重組 蛋白質。純化蛋白質進行SDS-聚丙稀酰胺電泳，用Coomassie Brilliant Blue (CBB)R_250 (Bio-Rad)染色，確認各蛋白質的純化(圖4)。
[0188] <實施例3:E.coli BL21(DE3)中的重組4E6單體蛋白質的表達?純化和結合活性 >
[0189] (1)大腸桿菌表達用抗hTRAIL_R2VHH抗體/Myc-Tag(4E6單體)基因表達盒的制作
[0190] 根據W0/2011/098520中記載的4E6VHH單體的氨基酸序列信息，對大腸桿菌表達用 的基因進行DNA合成(序列號7)。
[0191] (2)4E6單體的利用大腸桿菌的表達?純化
[0192] 表達4E6單體的載體插入到pET22b( + )的Nde和Notl部位。向E.coli BL21Star? (DE3)0ne Shot (Life technologies)中導入該表達載體質粒DNA。根據附屬手冊使用100mL 的加入了 l〇〇yg/mL安比西林(Sigma-Aldrich)的2YT培養基在37°C下培養重組大腸桿菌，達 到0D6q() = 0.4~0.5時，添加0.5mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C下培 養3小時。培養結束后，回收大腸桿菌，再次懸浮于10mL的提取緩沖液(50mM磷酸鈉 pH7.8， 300mM NaCl，EDTA_Free蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail)(Roche))。 在冰中使用Sonifier 250(Branson)，以Output Control 2、Duty cycle 80% 的條件進行2 次1分鐘的超聲波處理，粉碎菌體。以15000rpm在4°C對處理后的懸浮液離心20分鐘，回收上 清液。融合蛋白質的純化使用His Trap柱(GE Healthcare UK)。將超聲波處理懸浮液的離 心上清液直接通過His Trap柱，用結合緩沖液(20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清 洗柱子后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫融合蛋白質。將純化樣品供于15%丙烯酰胺SDS 電泳，用CBB染色，確認純化到約15KDa的4E6單體蛋白質，與BSA(牛血清白蛋白蛋白質）的染 色相比，計算4E6單體的濃度。其結果，4E6單體的濃度為~3ygAU(圖5)。
[0193] (3)通過ELISA確認4E6單體對hTRAIL-R2:Fc抗原的結合活性
[0194] hTRAIL-R2:Fc像實施例2那樣進行制備。在96孔免疫板(Nunc)中以50yL/孔添加 0.1Μ NaHC03(Blank)、或含有lyg/mL或 10yg/mL的BSA的0.1Μ NaHC03(BSA陰性抗原）、或含有 lyg/mL或 10yg/mL的hTRAIL-R2: Fc的0 · 1M NaHC03，在4°C放置一晚。向其中加入350yL/孔的 SuperBlock-PBS(Thermo 3(^611衍打(3)在室溫下放置1小時。用40(^17孔的？85-1'(含有 0.05%Tween20的磷酸緩沖生理鹽水）清洗后，加入40μL/孔的含有lμg/mL的4E6單體的 SuperBlock-roS，在室溫下反應1小時。再次，用400yL/孔的roS-T清洗3次，加入40yL/孔的 以SuperBlock-PBS稀釋了 500倍的抗Myc小鼠單克隆抗體9E10(Santa Cruz Biotechnology)，在室溫下反應1小時。用400yL/孔的PBS-T清洗3次，以40yL/孔加入抗小鼠 IgG山羊抗體HRP，室溫下放置1小時。其后，用400yL/孔的PBS-T清洗3次，以50yL/孔加入ΤΜΒ 試劑(和光純藥），反應10分鐘左右后，用〇. 5Μ硫酸使反應停止。其后，測定450nm的吸光度， 計算以重復三次進行的測定的平均值和標準偏差。純化的4E6單體蛋白質與hTRAIL-R2: Fc 特異性結合(圖6)。
[0195] (4)4E6單體與hTRAIL_R2ECD(細胞外區域，extracellular domain)的解離常數 (KD)的測定
[0196] 通過使用了Biacore X_100(GE Healthcare)的表面等離子共振法對4E6單體與 hTRAIL-R2:Fc(參照實施例2)的結合親和性進行解析。測定根據Biacore X-100所附的說明 書按照多循環動力學（7少于f彳夕少力彳氺于4夕只）法進行，在〇 · 919nM、1 · 838nM、 3 · 675nM、7 · 35nM、14 · 7nM、29 · 4nM、58 · 8nM 和117 · 6nM 對 4E6 單體進行測定。
[0197] 將各濃度下的傳感圖和擬合曲線示于圖7 3E6單體與重組人TRAIL-R2:Fc抗原的 Kd 值為7·5Χ10-ηΜ。
[0198] <實施例4:新型抗hTRAIL-RIVHH抗體(4Ρ6單體)的取得>
[0199] (1)新型抗hTRAIL-RIVHH抗體(4P6單體)基因的分離
[0200] 抗TRAIL-R1VHH抗體在此之前并不為人所知，因此通過以下方法制作。即，參考由 Maass等發表的文獻（J Immunol Methods ·，2007，324，13-25)，通過菌體展示法對與 hTRAIL-Rl:人Fc(R&D Systems)結合的VHH抗體基因進行分離。將100yg的hTRAIL-Rl:羊駝 Fc每隔1~2周對羊駝免疫6次，8周后，回收白細胞，使用RNeasy(Qiagen，Venlo， Netherland)提取RNA。利用PrimeScriptll lststrand cDNA synthesis kit(TAKARA BIO) 由該RNA使用寡聚dT引物、無規6引物合成cDNAjHH抗體基因利用PrimeSTAR GXL DNA polymerase(TAKARA BIO)以將95°C1 分鐘進行 1 個循環，將98°C10秒、55°C15秒、68°C1 分鐘 進行25個循環的方式進行PCR而擴增。對于該擴增產物，以將95°C1分鐘進行1個循環，將98 °C 10秒、60 °C 15秒、68 °C 1分鐘進行20個循環的方式同樣地進行PCR，擴增抗體基因。PCR使用 具有引物DNA序列1 (序列號8)和引物DNA序列2(序列號9)的DNA序列的引物。分離的抗體基 因的序列（4P6)使用BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies)，通過循環測序法確 定。其結果，分離的抗體的CDR1具有由序列號22表示的氨基酸序列，CDR2具有由序列號23表 示的氨基酸序列和CDR3具有由序列號24表示的氨基酸序列。
[0201 ] (2)果蠅培養細胞表達用4P6單體基因表達盒的制作
[0202] 合成由ΚρηΙ位點、翻譯起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucleic Acids Res · 15，1353-1361)、Bip分泌信號（Life Technologies)、4P6基因、His_Tag序列、Myc-Tag 序列、終止密碼子和Xhol位點構成的DNA。
[0203] (3)抗hTRAIL-RIVHH抗體單體(4P6單體)分泌表達果蠅培養細胞的制作和重組蛋 白質的純化
[0204] 通過在pAc5· l/V5_HisA質粒(Life Technologies)的Kpnl、XhoI位點之間插入上 述（2)的基因表達盒，制成在作為果蠅培養細胞的S2細胞中分泌表達4P6單體的載體 pAc5.1/4P6單體。利用磷酸鈣法將該質粒以與含有潮霉素抗性基因的pCoHygro質粒為19:1 的比例導入到S2細胞中。細胞在含有300yg/mL潮霉素 (Life Technologies)、10%胎牛血清 的Schneider ' s果繩培養基(Life Technologies)中培養，得到耐藥細胞。耐藥細胞在含有 20mM谷氨酰胺的EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)中培養，得到培養上清液。4P6單 體通過HisTrap柱(GE Healthcare)進行純化。純化蛋白質進行12.5%SDS-聚丙稀酰胺電 泳，用Oriο 1 e熒光凝膠染料(Bio-Rad)染色（圖8)。
[0205] <實施例5:抗hTRAIL-RIVHH抗體單體(4P6單體)的結合特異性和與hTRAIL-Rl的 親和性的測定>
[0206] (1 )4P6單體和4E6單體的由ELISA得到的結合特異性的解析
[0207] 通過ELISA研究4P6單體與TRAIL-R1選擇性結合的情況。向96孔的Nunc免疫板 (Thermo Scientific)中加入 50yL 的溶解于 0· 1M NaHC03 的 lyg/mL 的 hTRAIL-Rl :Fc， hTRAIL_R2 :Fc、mTRAIL_R2 :Fc(參照實施例2)、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin)，在4 °(：放置一晚。加入300yL的SuperBlock(TBS)封閉緩沖液(Thermo Scientific)，室溫下放置 1小時。除去各孔的溶液后，以50yL/孔加入以10yg/mL溶解于封閉緩沖液的4P6單體或4E6單 體，室溫下放置1小時。用含有0 · 05 %TWeen20的PBS清洗3次后，加入50yL的以67ng/mL溶解 于封閉緩沖液的9E10抗Myc抗體(Santa Cruz Biotechnology)，室溫下放置1小時。清洗3次 后，加入50yL的溶解于封閉緩沖液的抗小鼠 IgG HRP，室溫下放置1小時。清洗3次后，加入50 yL的TMB溶液(和光純藥），室溫下放置10分鐘。加入50yL的0.5M硫酸，測定450nm的吸光度。 每2個孔對各樣品進行解析，計算測定值的平均值和誤差。可以確認4P6單體與hTRAIL-Rl特 異性結合，4E6單體與hTRAIL-R2特異性結合(圖9)。
[0208] (2)抗 hTRAIL-RIVHH 抗體單體（4P6 單體）與 hTRAIL-Rl ECD(細胞外區域， extracellular domain)的解離常數的測定
[0209] 通過使用了Biacore X_100(GE Healthcare)的表面等離子共振法對4P6單體與重 組人TRAIL-R1ECD的結合親和性進行解析。將hTRAIL-Rl:Fc(hTRAIL-Rl:Fc，參照實施例2) 以約1000RU固定于傳感芯片(CM5)。測定按照BiacoreX-100所附的說明書用單循環動力（シ ^夕、、少^'彳夕少力彳氺于彳夕只）法進行，按0 · ΙηΜ、0 · 5nM、2 · 5nM、12 · 5nM、62 · 5nM的順序連 續添加4P6單體進行測定。將傳感圖和擬合曲線示于圖HLKd值(解離常數)為3.4Χ10-ηΜ。 [0 210] ⑶4Ρ6單體和4Ε6單體的拮抗活性
[0211 ] 對4Ρ6單體是否與癌細胞的hTRAIL-Rl結合、對誘導細胞死亡的hTRAIL顯示詰抗活 性進行解析。將人大腸癌Col〇205細胞懸浮在添加有10 %胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養基（Sigma)中，以3X103cells/50yL培養基/孔向Falcon 96 孔培養板（Beeton Dickinson)中加入細胞。培養一晚，添加各50yL的終濃度100ng/mL的 TRAIL和以各種濃度含有4P6單體、抗hTRAIL-R2 VHH抗體(4E6單體)的培養基。再培養一晚， 加入10yL的活細胞數量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養2小時后測定450nm的吸光度。 將未加入細胞的只是培養基的孔作為背景扣除。將僅有細胞的孔設為100%，將其相對值作 為數據。由各濃度3個孔的平均值+標準偏差表示。如圖11所示，4P6單體、4E6單體單獨無法 抑制由TRAIL所致的細胞死亡。但是，同時加入4P6單體和4E6單體時，用量依賴性地抑制細 胞死亡。由于hTRAIL、4P6單體、4E6單體的分子量幾乎相等，因此VHH抗體100ng/mL與 hTRAIL100ng/mL的摩爾濃度幾乎相等。根據以上結果，顯示4P6單體、4E6單體不僅分別與細 胞表面的hTRAIL-Rl、hTRAIL-R2結合，還作為拮抗劑起作用。
[0212] 如此，能夠取得與hTRAIL-Rl特異性結合、還可以作為拮抗劑起作用的新型抗體 4P6〇
[0213] <實施例6:4E6二聚體Toxin、4E6二聚體EGFP和4E6四聚體、重組E.coli BL21 (DE3)的制作和重組蛋白質的表達?純化>
[0214] (1)基因表達盒的制作
[0215] (1-1)大腸桿菌表達用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠膿桿菌外毒素 A亞單位融合 體(4E6二聚體Toxin)基因表達盒的制作
[0216] 大腸桿菌表達用4E6二聚體Toxin基因，以插入到pBluescriptII( + )質粒的雙歧桿 菌表達用4E6二聚體Toxin基因表達盒(序列號2)作為模板，使用引物DNA序列5(序列號12) 和6(序列號13)進行PCR的擴增。PCR的條件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BI0)作為DNA聚合酶以將95°C1分鐘進行1個循環，將98°C10秒、60°C15秒、68°C2分鐘進行25 個循環的方式實施。擴增產物使用MinElute柱(Qiagen)根據附加的協議進行純化，用Ndel 和Notl進行限制酶消化后，用1.2%瓊脂糖進行電泳，從凝膠中切出目標條帶，使用DNA凝膠 提取試劑盒(Qiagen)根據附加的協議進行純化分離。將其插入到pET_22b( + )(Novagen)的 Ndel和Notl部位，構建如下的4E6二聚體Toxin(圖12a)，即，在N末端具有Strep Tag (Schmidt T.G.，Skerra A.，2007，Nat Protoc.2(6):1528-1535)，用（GGSGG)2連接肽（序列 號28)連接2個VHH單體彼此，介由Xbal序列（SerArg)使綠膿桿菌外毒素亞單位A(Toxin)與 4E6二聚體的C末端結合。
[0217] (1-2)大腸桿菌表達用抗hTRAIL-R2VHH抗體二聚體綠色熒光蛋白質融合體(4E6二 聚體EGFP)基因表達盒的制作
[0218] 大腸桿菌表達用4E6二聚體EGFP基因，以插入到pBluescriptII( + )質粒中的雙歧 桿菌表達用4E6二聚體Toxin基因表達盒（序列號3)作為模板，使用引物DNA序列5(序列號 12)和7(序列號14)進行PCR的擴增。PCR的條件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TAKARA BIO)作為DNA聚合酶，以將95°C 1分鐘進行1個循環，將98°C 10秒、60°C 15秒、68°C2 分鐘進行25個循環的方式實施。擴增產物使用MinElute柱(Qiagen)根據附加的協議進行純 化，用Ndel和Notl進行限制酶消化后，用1.2%瓊脂糖進行電泳，從凝膠切出目標條帶，使用 DNA凝膠提取試劑盒（Qiagen)根據附加的協議進行純化分離。將其插入到pET-22b( + ) (Novagen)的Ndel和Notl部位，構建如下的4E6二聚體EGFP(圖12b)，即，在N末端具有Strep Tag，用(GGSGG) 2連接肽(序列號28)連接2個VHH單體彼此，介由XbaI序列（SerArg)使在N末 端結合有(GGSGG) 2連接肽(序列號28)的綠色熒光蛋白質(EGFP)與4E6二聚體的C末端結合。 [0219] (1-3)大腸桿菌表達用抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)基因表達盒的制 作
[0220] 大腸桿菌表達用4E6四聚體基因，以插入到pEX-K質粒的雙歧桿菌表達用4E6四聚 體基因表達盒(序列號1)作為模板，使用引物DNA序列3(序列號10)和4(序列號11)進行PCR 的擴增。PCR的條件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA ΒΙ0)作為DNA聚合酶， 以將95 °C 1分鐘進行1個循環，將98 °C 10秒、60 °C 15秒、68 °C 2分鐘進行25個循環的方式實施。 擴增產物使用MinElute柱(Qiagen)根據附加的協議進行純化，用Ndel和Notl進行限制酶消 化后，用1.2%瓊脂糖進行電泳，從凝膠切出目標條帶，使用DNA凝膠提取試劑盒(Qiagen)根 據附加的協議進行純化分離。將其插入到pET-22b( + ) (Novagen)的Ndel和Notl部位，構建在 N末端具有Strep Tag、用3個(GGSGG)2連接肽(序列號28)連接4個VHH單體彼此的4E6四聚體 (圖 12c)。
[0221] (2)大腸桿菌中的重組蛋白質的表達
[0222] 將如上所述制作的4E6四聚體、4E6二聚體Toxin和4E6二聚體EGFP基因插入到 pET22b( + )的Ndel和Notl部位。向E · coli RosettaGami (DE3)2(Novagen)導入該表達載體質 粒DNA，按照所附手冊使用200mL的加入了 100yg/mL安比西林(Sigma-Aldri ch)的2YT培養基 在37°C培養重組大腸桿菌，達到0D6Q() = ().4~0.5時，添加 ImM IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖 苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C培養3小時。培養結束后，回收大腸桿菌，再次懸浮在20mL的提取緩 沖液（50mM磷酸鈉 pH7.8、300mM NaCl、EDTA-Free蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail)(Roche))中，在冰中使用Sonifier 250 (Branson)，以Output Control 2、Duty cycle 80%的條件進行2次1分鐘的超聲波處理，粉碎菌體。將處理后的懸 浮液以15000rpm在4°C離心20分鐘，回收上清液。融合蛋白質的純化使用HisTrap柱 (GEHealthcare)。將超聲波處理懸浮液的離心上清液直接通過HisTrap柱，用結合緩沖液 (20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫融合 蛋白質。將純化樣品供于10%丙烯酰胺SDS電泳，用CBB染色，確認純化的重組蛋白質，與BSA (牛血清白蛋白蛋白質）的染色相比，計算目標蛋白質帶的濃度（圖二聚體 Toxin、4E6二聚體EGFP、4E6四聚體的濃度分別計算為0.8mg/mL、l .2mg/mL、l .6mg/mL。
[0223] <實施例7:4E6二聚體Toxin和4E6四聚體的癌細胞死亡誘導活性的測定>
[0224] 研究4E6二聚體Toxin融合蛋白質是否對培養hTRAIL-R2表達人癌細胞(C〇1〇205， 由American Type Culture Collection得到）具有細胞死亡誘導作用。向Falcon 96孔培養 板(Becton Dickinson)以5 X 104cells/50yL培養基（含有0 · 2%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養基)/孔加入細胞，培養2小時后，將如上所述純化的4E6二聚 體 Toxin、4E6 二聚體 EGFP 以終濃度成為 2000、800、160、32、6.4、1.28、0.256、(h0512ng/mL 的 培養基（2 X終濃度)各添加50yL。在培養第2天加入10yL的MTT試劑(Nacalai Tesque)。再培 養2小時后以lOOyL/孔加入增溶劑，用吸量管將細胞溶解，測定OD57〇nm的吸光度。將無細胞 添加的培養基的孔的測定值作為背景值從總測定值中減去。將未添加抗體的空白對照的孔 設為100%，用其相對值表示。測定重復三次進行，取3個孔的平均值。如圖14a所示，抗 TRAIL-R2VHH抗體二聚體和Toxin融合體、即免疫毒素完全不誘導細胞死亡。
[0225] 為了確認4E6二聚體與細胞結合的情況，進行了以下試驗。即，對人大腸癌C〇1〇205 細胞、胰腺癌BxPC-3細胞，使各2 X 105細胞在50yL的含有10yg/mL 4E6二聚體EGFP和2%胎 牛血清的磷酸緩沖生理鹽水(pH7.4)中進行30分鐘冰上反應。用上述的加入血清的磷酸緩 沖生理鹽水清洗2次，利用FACSVerse(BD Biosciences)解析細胞的熒光強度。2種細胞均被 4E6二聚體EGFP染色。另一方面，對于對照二聚體EGFP，任一細胞均未被染色（圖15)。因此， 認為4E6二聚體與細胞結合。
[0226] 根據以上結果，認為4E6二聚體Toxin雖與細胞膜上的TRAIL-R2結合，但無法使 TRAIL-R2分子聚集為三聚體以上，且也不會被攝取到細胞內，因此無法對C〇1〇205細胞誘導 細胞死亡。
[0227] 接著，為了研究4E6單體和4E6四聚體是否具有細胞死亡誘導作用，將如上所述純 化的4E6單體、4E6四聚體以終濃度成為25000、5000、1000、200、40、8、1.6、0.32pg/mL的培養 基(2 X終濃度)各添加50yL。其結果，4E6單體未引起細胞死亡，但具有使TRAIL-R2分子聚集 成三聚體以上的活性的4E6四聚體對C〇1〇205細胞強效誘導細胞死亡（圖14b)。
[0228] 這些結果顯示具有使TRAIL-R聚集成三聚體以上的活性的抗hTRAIL-R VHH抗體四 聚體與抗hTRAIL-R VHH抗體二聚體Toxin相比，能夠有效地誘導癌細胞死亡。
[0229] <實施例8:大腸桿菌中表達的4E6四聚體對人大腸癌細胞和胰腺癌細胞的細胞死 亡誘導作用>
[0230] 研究4E6四聚體對人大腸癌細胞C〇1〇205和胰腺癌細胞BxPC-3(由American Type Culture Col lection得到）的癌細胞死亡誘導作用。細胞懸浮于添加有10 %胎牛血清 (Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養基（Sigma)，向Falcon96孔培養板(Becton Dickinson)以3X10 3cells/50yL/孔加入細胞，培養一晚后，添加各50yL的含有4E6四聚體、 hTRAIL(和光純藥）的培養基。C〇1〇205細胞培養一晚，BxPC-3細胞培養兩晚后，加入10yL的 活細胞數量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，進一步培養4~6小時，測定450nm的吸光度。將 未加入細胞的只是培養基的孔作為背景扣除。將僅有細胞的孔設為1〇〇%，將其相對值作為 數據。用各濃度3個孔的平均值+標準偏差表示。如圖16所示，4E6四聚體濃度依賴性地誘導 C〇1〇205細胞、BxPC-3細胞的細胞死亡，IC5Q分別為2pmol/L、8pmol/L。用大腸桿菌制作的 hTRAIL的IC5Q為400pmol/L，可知4E6四聚體能夠以比hTRAIL低的濃度誘導細胞死亡。
[0231] <實施例9:4E6四聚體和4E6二聚體EGFP在雙歧桿菌中的分泌表達和純化>
[0232] (1)通過電穿孔制作重組雙歧桿菌
[0233] 將用于在雙歧桿菌中分泌表達4E6四聚體和4E6二聚體EGFP的載體基因盒(參照實 施例 1)插入PKKT427載體（Yasui K.，et al.，Nucleic Acids Res.2009)的Hindlll與Notl 之間，通過電穿孔法導入至長雙歧桿菌105-A。電穿孔以2.41^、25以？、200〇的條件進行。
[0234] (2)由雙歧桿菌分泌表達的4E6四聚體、4E6二聚體EGFP的純化
[0235] 將（1)中得到的重組雙歧桿菌加入到含有lOOyg/mL壯觀霉素的MRS液體培養基 (Lactobacilli MRS Broth,Difco Laboratories，Detroit，MI)、50mM鹿糖、3·4mg/mL L_抗 壞血酸鈉鹽和〇.2mg/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽中，進行一晚厭氧培養。厭氧培養使用加入了作 為脫氧劑的AnaeroPack-Kenki (三菱瓦斯化學，東京，日本)的密閉容器進行。測定培養一晚 的培養液的吸光度(600nm)，以吸光度變為0.1的方式加入到新的液體培養基中。厭氧培養6 ~7小時，以4°C、9400 X g離心10分鐘，采取培養上清液。重組蛋白質的純化用HisTrap柱(GE Healthcare)進行。將培養上清液通過HisTrap柱，用結合緩沖液(50mM磷酸鈉、0.3M NaCl、 20mM咪唑pH7.8)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫蛋白質。將與由培養上清液lmL 純化的量相當的純化蛋白質進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Oriole熒光凝膠染料(Bio-Rad)染色 （圖 17) JE6 四聚體、 4E6 二聚體 EGFP 都在推測分子量附近 （約 60kDa) 被檢測到 。對 于培養上清液中的分泌量，4E6四聚體預計為400ng/mL，4E6二聚體EGFP預計為3.2ng/mL。根 據以上結果可知任一重組蛋白質均有分泌，4E6四聚體與4E6二聚體EGFP相比被效率良好地 分泌表達。
[0236] <實施例10:雙歧桿菌中分泌表達的抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體）的 癌細胞死亡誘導活性>
[0237] 研究4E6四聚體對人大腸癌C〇1〇205細胞（American Type Culture Collection) 的癌細胞死亡誘導活性。細胞懸浮于添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals) 的 RPMI1640 培養基（Sigma)，以3X103cells/50yl 培養基 / 孔向 Falcon96 孔培養板(Becton Dickinson)加入細胞。培養一晚，添加各50yL的以終濃度0.3pM~10nM含有4E6四聚體、 TRAIL的培養基。進一步培養一晚，加入10yL的活細胞數量測定試劑SF(Nacalai Tesque)， 培養6小時后測定450nm的吸光度。將未加入細胞的只是培養基的孔作為背景扣除。將僅有 細胞的孔作為100%，將其相對值作為數據。用各濃度3個孔的平均值+標準偏差表示。如圖 18所示，4E6四聚體濃度依賴性地抑制增殖，IC 5Q為0.02nmol/L。另一方面，由大腸桿菌制作 的hTRAIL(和光純藥)的IC5Q為0.4nmol/L。因此，可知在雙歧桿菌中分泌表達的4E6四聚體與 hTRAIL相比細胞死亡誘導活性高。
[0238] <實施例11:C〇1〇205細胞移植的異種移植模型(Xenograft model)中的重組長雙 歧桿菌通過靜脈內給藥得到的抗腫瘤效果的研究>
[0239] 在向裸小鼠的皮下移植人大腸癌C〇1〇205細胞形成實體癌的異種移植模型中，研 究將分泌表達抗hTRAIL-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)的重組長雙歧桿菌105-A向靜脈內 給藥時的抗腫瘤效果。具體而言，對6周齡的雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2 X 106的C〇1〇205 細胞，9天后以各組（n = 6,未處置、4E6四聚體、4E6二聚體EGFP)的腫瘤塊的體積成為約 280mm3的方式分組后，將按照實施例9制作的重組雙歧桿菌以每1只1.5 X 109個向靜脈內給 藥。使用的長雙歧桿菌105-A通過離心和在生理鹽水中的再次懸浮進行制備。為了補充體內 的長雙歧桿菌105-A的營養，每天將lmL的20%半乳糖苷果糖向腹腔內給藥。對于腫瘤直徑， 從雙歧桿菌給藥當天開始〇、2、4、7、11、14、18、21天后使用游標卡尺進行測量。腫瘤體積由 "(短徑)2x(長徑)/2"的計算公式計算。將結果示于圖19。在雙歧桿菌給藥后第21天，分泌 表達4E6四聚體的重組雙歧桿菌與未處置相比，抑制了 51%的腫瘤增殖。另一方面，作為陰 性對照的分泌4E6二聚體EGFP的雙歧桿菌給藥組中未發現腫瘤增殖抑制效果。
[0240]與腫瘤直徑的測量同時，從雙歧桿菌給藥當天開始0、2、4、7、11、14、18、21天后測 量各組的體重。如圖20所示，與未處置、4E6二聚體EGFP組相比，4E6四聚體組中未檢測到體 重減少。根據這些結果，認為4E6四聚體不產生引起體重減少這樣的副作用，通過細胞死亡 誘導活性抑制腫瘤增殖。
[0241] <實施例12: BxPC-3細胞移植的異種移植模型中的重組長雙歧桿菌通過靜脈內給 藥產生的抗腫瘤效果的研究>
[0242] 在向裸小鼠的皮下移植人胰腺癌BxPC-3細胞形成實體癌的異種移植模型中，研究 將分泌表達抗hTRAI L-R2VHH抗體四聚體(4E6四聚體)的重組長雙歧桿菌105-A向靜脈內給 藥時的抗腫瘤效果。具體而言，向8周齡的雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2 X106的BxPC-3細 胞，8天后以各組(η = 6，未處置，4E6四聚體，4E6二聚體EGFP)的腫瘤塊的體積成為約230mm3 的方式分組后，將按照實施例9制作的重組雙歧桿菌以每1只1.5 X 109個向靜脈內給藥。使 用的長雙歧桿菌105-A通過離心和在生理鹽水中的再次懸浮進行制備。為了補充體內的長 雙歧桿菌105-A的營養，每天將lmL的20 %半乳糖苷果糖向腹腔內給藥。對于腫瘤直徑，從雙 歧桿菌給藥當天開始0、3、6、10、13、17天后使用游標卡尺進行測量。腫瘤體積由"(短徑) 2\ (長徑)/2"的計算公式計算。將結果示于圖21。在雙歧桿菌給藥后第17天，分泌表達4E6四聚 體的重組雙歧桿菌與未處置相比，抑制了 52%的腫瘤增殖。另一方面，在作為陰性對照的分 泌4E6二聚體EGFP的雙歧桿菌給藥組中未發現腫瘤增殖抑制效果。
[0243] 與腫瘤直徑的測量同時，從雙歧桿菌給藥當天開始0、3、6、10、13、17天后測量各組 的體重。如圖22所示，與未處置、4E6二聚體EGFP組相比，4E6四聚體組中未檢測到體重減少。 根據這些結果，認為4E6四聚體不產生引起體重減少這樣的副作用，通過細胞死亡誘導活性 抑制腫瘤增殖。
[0244] <實施例13:4P6三聚體重組E.coli BL21(DE3)的制作和重組蛋白質的表達?純 化>
[0245] (1)大腸桿菌表達用抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體)基因表達盒的制作
[0246] 將在N末端具有Strep Tag、在C末端具有His-Tag序列、按照實施例4(1)取得的抗 hTRAIL-RIVHH抗體的3個單體彼此用2個(GGSGG)2連接肽（序列號28)連接而形成4P6三聚 體，將編碼該4P6三聚體的基因插入到pET-22b( + )(Novagen)的Ndel和Notl部位，構建大腸 桿菌表達用4P6三聚體基因表達盒(參照實施例6)。
[0247] (2)大腸桿菌中的重組蛋白質的表達
[0248] 將如上所述制作的質粒載體導入E.coli BL21Star?(DE3)0ne Shot(Life technologies)。根據隨附手冊使用200mL的加入了 100yg/mL安比西林（Sigma-Aldrich)的 2YT培養基在37°C培養重組大腸桿菌，達到0D6q() = 0.4~0.5時，添加 ImM IPTG(異丙基-β-硫 代半乳糖苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C培養3小時。培養結束后，回收大腸桿菌，再次懸浮于20mL 的提取緩沖液(50mM磷酸鈉 pH7.8、300mM NaCl、EDTA-Free蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail) (Roche))。在冰中使用Sonifier 250(Branson)以 Output Control 2、Duty cycle 80%的條件進行2次1分鐘的超聲波處理，粉碎菌體。將處理后的懸浮液以 9400 Xg在4 °C離心20分鐘，回收上清液。融合蛋白質的純化使用His Trap柱（GE Healthcare UK)。將超聲波處理懸浮液的離心上清液直接通過His Trap柱，用結合緩沖液 (20mM磷酸鈉、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫融合 蛋白質。進而，將洗脫組分添加于Strep-Tactin柱（IBA)，根據隨附手冊進行純化。對相當于 50ng的BSA的純化蛋白質進行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，用Oriole焚光凝膠染料(Bio-Rad) 染色（圖23K4P6三聚體在推測分子量附近(約42kDa)被檢測到。根據以上結果，可知4P6三 聚體可以在大腸桿菌中表達、純化。
[0249] <實施例14:大腸桿菌中表達的4P6三聚體的癌細胞死亡誘導活性的測定>
[0250] 研究4P6三聚體對大腸癌C〇1〇205細胞（American Type Culture Collection)的 癌細胞死亡誘導活性。細胞懸浮于添加了10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)的 RPMI1640培養基（Sigma)，以3X 103cells/50yl培養基/孔向Falcon96孔培養板（Becton Dickinson)加入細胞。培養一晚后，添加各50yL的以終濃度10pM~10nM含有4P6三聚體的培 養基。再培養兩晚后，加入l〇yL的活細胞數量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養4小時后 測定450nm的吸光度。將未加入細胞的只是培養基的孔作為背景扣除。將僅有細胞的孔設為 100 %，將其相對值作為數據。用各濃度3個孔的平均值+標準偏差表示。如圖24所示，4P6三 聚體濃度依賴性地抑制C〇1〇205細胞的增殖，IC 5Q為0.4nmol/L。由大腸桿菌制作的hTRAIL (和光純藥）的IC5Q為0.4nmol/L，大腸桿菌中表達的4P6三聚體顯示與hTRAE相同程度的細 胞死亡誘導活性。
[0251] <實施例15:抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體)在雙歧桿菌中的分泌表達 和純化>
[0252] (1)通過電穿孔制作重組雙歧桿菌
[0253] 將實施例1 (1)中的表達盒的4E6四聚體的部分替換為按照實施例4(1)取得的4P6 的三聚體，將這樣制作的用于在雙歧桿菌中分泌表達4P6三聚體的載體基因盒插入到 pKKT427載體(Yasui K.，et al.，Nucleic Acids Res.2009)的Hindlll與Notl之間，通過電 穿孔法導入到長雙歧桿菌105-A中。電穿孔以2.41^、25以？、200〇的條件進行。
[0254] (2)雙歧桿菌中分泌表達的4P6三聚體的純化
[0255] 將（1)中得到的重組雙歧桿菌加入到含有lOOyg/mL壯觀霉素的MRS液體培養基 (Lactobacilli MRS Broth,Difco Laboratories，Detroit，MI)、50mM鹿糖、3·4mg/mL L_抗 壞血酸鈉鹽和〇.2mg/mL L-半胱氨酸鹽酸鹽中，進行一晚厭氧培養。厭氧培養使用加入了作 為脫氧劑的AnaeroPack-Kenki (三菱氣體化學，東京，日本)的密閉容器而進行。測定培養了 一晚的培養液的吸光度(600nm)，以吸光度變為0.1的方式加入到新的液體培養基中。厭氧 培養7小時，在4°C以9400 X g離心10分鐘，采取培養上清液。重組蛋白質的純化用HisTrap柱 (GE Healthcare)進行。將培養上清液通過HisTrap柱，用結合緩沖液（50mM磷酸鈉、0.3M NaCl、20mM咪唑pH7.8)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脫液洗脫蛋白質。將與由培養上清 液0.6mL純化的量相當的純化蛋白質進行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，用Or i ο 1 e焚光凝膠染料 (Bio-Rad)染色（圖25) JP6三聚體在推測分子量附近（約42kDa)被檢測到。使用BSA進行定 量，結果4P6三聚體的培養上清液中的分泌量估計為30ng/mL。根據以上結果可知4P6三聚體 在雙歧桿菌中被分泌表達。
[0256] <實施例16:雙歧桿菌中分泌表達的抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體）的 癌細胞死亡誘導活性>
[0257] 研究4P6三聚體對人大腸癌C〇1〇205細胞（American Type Culture Collection) 和胰腺癌BxPC-3細胞(American Type Culture Collection)的癌細胞死亡誘導活性。細胞 懸浮于添加有 10%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培養基（Sigma)， 以3 X 103cells/50yl培養基/孔向Falcon96孔培養板(Becton Dickinson)加入細胞。培養 一晚，添加各50yL的以終濃度0.3pM~10nM含有4P6三聚體的培養基。再培養兩晚，加入10yL 的活細胞數量測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養2小時后測定450nm的吸光度。將未加入 細胞的只是培養基的孔作為背景扣除。將僅有細胞的孔設為1〇〇%，將其相對值作為數據。 用各濃度3個孔的平均值+標準偏差表示。如圖26a所示，4P6三聚體濃度依賴性地抑制 C〇1〇205細胞的增殖，IC5Q為0.08nmol/L。由大腸桿菌制作的hTRAIL(和光純藥）的IC 50為 0.4nmol/L，可知雙歧桿菌中分泌表達的4P6三聚體與hTRAIL相比細胞死亡誘導活性高。如 圖26b所示，4P6三聚體也濃度依賴性地抑制BxPC-3細胞的增殖。
[0258] <實施例17:BxPC-3-Luc#2細胞移植的異種移植模型中的分泌表達4P6三聚體的 重組長雙歧桿菌通過靜脈內給藥得到的抗腫瘤效果的研究>
[0259]在向裸小鼠的皮下移植人胰腺癌BxPC-3-Luc#2細胞（由JCRB細胞庫得到）形成實 體癌的異種移植模型中，研究將分泌表達抗hTRAIL-RIVHH抗體三聚體(4P6三聚體）的重組 長雙歧桿菌105-A向靜脈內給藥時的抗腫瘤效果。具體而言，對6周齡的雌性KSN/Slc裸小鼠 皮下移植3X10 6的BxPC-3-Luc#2細胞，15天后以各組(n = 5,未處置、4P6三聚體、僅pKKT427 載體）的腫瘤塊的體積成為約135mm3的方式分組后，將按照實施例15制作的重組雙歧桿菌 以每1只3 X108個向靜脈內給藥。使用的長雙歧桿菌105-A通過離心和在生理鹽水中的再次 懸浮而制備。為了補充體內的長雙歧桿菌105-A的營養，每天將lmL的20 %半乳糖苷果糖向 腹腔內給藥。對于腫瘤直徑，從移植腫瘤當天開始15、19、21、24、28、31、35天后使用游標卡 尺進行測量。腫瘤體積由"(短徑) 2X(長徑)/2"的計算公式計算。將結果示于圖27。在雙歧 桿菌給藥后第20天，分泌表達4P6三聚體的重組雙歧桿菌與未處置相比，抑制了 65%的腫瘤 增殖。另一方面，在作為陰性對照的導入了 PKKT427的雙歧桿菌給藥組中未發現腫瘤增殖抑 制效果。
[0260] 在腫瘤直徑的測量同時，從移植腫瘤當天開始15、19、21、24、28、31、35天后測量各 組的體重。如圖28所示，與未處置、導入pKKT427的雙歧桿菌組相比，4P6三聚體組中未檢測 到體重減少。根據這些結果，認為4P6三聚體不產生引起體重減少這樣的副作用，通過細胞 死亡誘導活性抑制腫瘤增殖。
[0261] 產業上的可利用性
[0262]根據本發明，能夠減少對正常細胞的毒性，并且通過具有強效激動劑活性的抗 hTRAIL-Rl抗體和抗hTRAIL-R2抗體的腫瘤部位局部給藥而有效地誘導癌細胞死亡。
[0263]將本說明書中引用的全部出版物、專利和專利申請作為參考直接引入本說明書 中。
【主權項】
1. 一種重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，以可表達狀態含有編碼融合蛋白質的核酸，該融 合蛋白質含有信號肽以及3個以上的抗TRAIL-Rl單鏈抗體和/或3個以上的抗TRAIL-R2單鏈 抗體。2. 根據權利要求1所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，專性厭氧革蘭氏陽性菌為 雙歧桿菌屬即Bif idobacterium。3. 根據權利要求1或2所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗TRAIL-Rl單鏈 抗體而言， CDRl含有由序列號22表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列。4. 根據權利要求1~3中任一項所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，對于抗 TRAIL-R2單鏈抗體而言， CDRl含有由序列號15表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列號16表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列號17表示的氨基酸序列。5. 根據權利要求1~4中任一項所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，所述融合蛋 白質進一步含有功能性肽。6. 根據權利要求5所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌，其中，功能性肽為標記蛋白質。7. -種抗腫瘤劑，將權利要求1~6中任一項所述的重組專性厭氧革蘭氏陽性菌作為有 效成分。8. -種抗TRAIL-Rl抗體，其特征在于， CDRl含有由序列號22表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列號23表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列號24表示的氨基酸序列。
【文檔編號】A61P35/00GK105916975SQ201480072570
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年12月24日
【發明人】西川毅, 平裕郎, 平裕一郎, 平郁子, 石田功
【申請人】學校法人帝京平成大學