檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA 的方法、試劑盒及其應用
【專利摘要】本申請公開了檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，提取pgRNA后，使用RNase?free Dnase I純化提取的HBV pgRNA，采用qRT?PCR的方法達到對pgRNA的定量檢測，本申請還提供了檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的試劑盒。本申請，達到了如下效果：1)采用血液檢測，無創，常規且可大規模應用；2)可檢測血液中超低載量的PgRNA；4)該試劑盒及其在預測NA停藥的應用可深入研究中國乙肝PgRNA形態，為開發PgRNA藥物提供基礎研究數據。給“乙肝臨床指南十大待解決問題之一”的“尋找預測NA停藥的臨床標準及生物學標志”的問題解決提供了方案。
【專利說明】
檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、試劑盒及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 乙肝病毒顆粒在人體內的生命過程已經研究得很透徹:HBV的復制過程中存在逆 轉錄的步驟，因此其生活周期不同于其它DNA病毒，由于逆轉錄酶的特性，HBV的突變率要高 很多。
[0003] HBV DNA在完整病毒中以松弛環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的形式存 在，HBV病毒顆粒進入肝細胞后，脫去外面的衣殼，其rcDNA進入細胞核，形成共價閉合環狀 DNA(covalentlt closed circular DNA，cccDNA)，以cccDNA為模板，轉錄形成前基因組RNA (PgRNA)和其它mRNA，PgRNA在逆轉錄酶的作用下形成rcDNA，rcDNA與相關蛋白組裝形成HBV 病毒顆粒。一些臨床試驗的研究結果表明，之所以部分HBV DNA已經檢測不到，結果呈現陰 性的乙肝患者的病情仍在繼續，其根本原因在于患者體內病毒顆粒的核心部件沒有清除干 凈，也沒有停止工作。其中，HBV cccDNA就是目前臨床上較為公認的"核心部件"之一。但是， 現有的拉米夫定(LAM)等NA抗病毒藥物并不能完全清除HBV cccDNA，經過較長一段時間抗 病毒治療后的乙肝患者穩定感染的細胞中，細胞核內cccDNA仍舊維持在一定的水平，每個 肝細胞內約有5-50個拷貝。但是，HBV cccDNA主要存在于肝臟細胞中，取材及檢測都非常困 難。
[0004]
[0005] 嗜肝DNA病毒科中的乙型肝炎病毒(HBV)是經典的DNA逆轉錄病毒，其進入細胞后 以DNA作為模板轉錄出四種轉錄體(RNA)，轉錄體中有一種稱為前基因組RNA，也即是PgRNA。 這種RNA上帶有包裝信號，能夠被包裝入核心顆粒。研究表明，僅有PgRNA能夠被包裝入核心 顆粒，其它類型的轉錄體都不能被包裝進入核心顆粒，這也就意味著HBV的DNA基因組僅能 由包裝入核心顆粒的PgRNA逆轉錄得到，即DNA-RNA-DNA。鑒于PgRNA的在乙肝病毒顆粒復制 過程中的重要性，它很可能成為新的NA停藥指標。
[0006] 國內外，現在都沒有獲批的或科研型的成品商業化試劑盒，故，開發HBV PgRNA成 品試劑盒具有一定的市場獨家性和應用創新性。另外，在科學研究領域，國內對PgRNA的研 究寥寥無幾，國外對PgRNA的研究也多集中在與HBV DNA、HBsAg等直接相關性上，沒有 "PgRNA與抗病毒治療停藥后復發"的關系研究。
[0007] 現階段，乙肝治療的目標是最大限度的長期抑制HBV病毒顆粒的復制，減輕肝細胞 炎性壞死及肝纖維化，達到延緩和減少肝功能衰竭、肝硬化失代償、肝癌及其他并發癥的發 生，從而改善生活質量和延長生存時間。
[0008] 在乙肝治療用藥時，現在評估"何時停藥"，也即是評估"治療終點"的指標，除了常 規生化指標HBeAg、HBsAg和ALT之外，寫入臨床指南的分子生物學指標就是HBV DNA，大致情 況如下：
[0009] 1)HBV DNA:依據此指標判斷"何時停藥"，存在延長治療的"過度治療"和停藥后復 發反彈的"再治療"問題。另外，臨床指南也明確指出此停藥指標存在的問題，并提出十大待 解決問題之一:尋找預測NA停藥的臨床標準及生物學標志。
[0010] 2)HBV cccDNA:檢測HBV cccDNA的技術已不是問題，常見的有RT-PCR(實時聚合酶 鏈式反應技術)和FISH(熒光原位雜交技術）。但是，國內外還沒有CFDA/FDA批準的試劑盒應 用，國內只存在少數科研型商品化試劑盒。HBV cccDNA檢測應用為何步履維艱、難以推廣 呢？主要原因有:① cccDNA主要存在于肝細胞中，在血液、組織液中HBV基因組以rcDNA形式 存在。若要檢測cccDNA，就必須以肝組織為標本。有創活檢在絕大多數醫院不是常規項目， 而且肝組織標本檢測cccDNA難度很大;②大量的實驗結果表明都沒能在外周血單個核細胞 中檢出cccDNA;③重癥肝炎前期及重癥期間的患者血清中都未能檢出cccDNA;④總之， cccDNA在肝組織中存在的特殊性，導致cccDNA檢測技術和應用難度都很大。
[0011] 3)盡管HBV PgRNA也主要存在于肝細胞中，但是，類似于臨床ALT(丙谷轉氨酶）、 AST (谷草轉氨酶)在肝細胞遭到破壞后會釋放入血液一樣，預測HBV PgRNA也會存在于血液 中，并與疾病的嚴重程度相關。專利預實驗結果也已充分證實了乙肝患者血液中存在HBV PgRNA的結論，只是血液中HBV PgRNA含量較低，其本身也較容易被RNase降解。所以，開發穩 定、可靠、靈敏的HBV PgRNA定量檢測方法是解決問題的技術關鍵所在，專利已完成相關技 術難點的攻關。
[0012] 4)臨床上常用的拉米夫定(LAM)等抗病毒藥物抑制的是PgRNA逆轉錄，而cccDNA的 含量又相對穩定，再加上"乙肝病毒DNA基因組僅能由包裝入核心顆粒的PgRNA逆轉錄得到" 的特殊地位，血液中的HBV PgRNA含量可能是一個更好的評價患者病情的指標。
[0013] 5)臨床上服用抗病毒藥物的患者停藥后1年內，約一半的患者表現出持續的病毒 學應答，但是還有約50%的患者停藥后很快就會復發反彈，專利預測這與患者體內"盡管 HBV DNA低載量，但是HBV PgRNA高載量"的原因有關，HBV PgRNA可能成為預測NA停藥的新 指標。
[0014] 因此，采用高靈敏度、操作簡單、檢測時間短的RT-qPCR技術對抗病毒治療的乙肝 患者血液樣本實施HBV PgRNA含量的定量測定，給"乙肝臨床指南十大待解決問題之一"的 "尋找預測NA停藥的臨床標準及生物學標志"的問題解決提供了新的思路與可能。
[0015] HBV PgRNA:國內外，既沒有獲批的、科研型的HBV PgRNA成品商業化試劑盒，也沒 有PgRNA與"NA停藥后復發"相關性上的研究。核苷(酸)類似物(NA)抗病毒治療是抑制PgRNA 的逆轉錄，最終結果是逐漸耗竭肝細胞內的cccDNA，而肝內cccDNA的含量又相對穩定(5-50 個拷貝），再加上近年來的實驗研究和專利預實驗已證實乙肝患者血液中PgRNA的存在性并 可以檢測到。故此"血HBV PgRNA定量檢測試劑盒"具有市場獨家性和應用創新性，有良好的 經濟前景和應用前景。
【發明內容】
[0016] 本申請解決的主要問題是提供檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、試劑 盒，以解決無法實現的技術問題。
[0017] 為了解決上述技術問題，本發明公開了檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方 法，，其特征在于，其包括如下實現步驟：
[0018]樣本處理:取外周血3-5ml注入無菌收集管，室溫放置；
[0019] HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取試劑盒，提取乙型肝炎患者血清或血漿中的 HBV RNA，獲得HBV RNA粗品；
[0020] HBV pgRNA的純化：使用使用RNase-free Dnase I純化提取的HBV pgRNA，包括如 下步驟：
[0021] 1)建立如下反應體系：
[0022] RNase-Free DNase 10X反應緩沖液lul;
[0023] RNase-Free DNaselul/ug；
[0024] RNA無核酸酶的水補足至10ul;
[0025] 將獲得的HBV pgRNA粗品溶于洗脫液中，取l-8ul加入如下反應體系中；
[0026] 2) 37 Γ孵育半小時；
[0027] 3)加入lul終止液終止反應；
[0028] 4)65°C孵育10分鐘，使DNase失活，得到HBV pgRNA的純品；
[0029] pgRNA的定量檢測:使用qRT-PCR定量檢測pgRNA，包括:如下步驟：
[0030] 1)配制qRT-PCR反應體系，
[0031] qRT-PCR 反應體系：
[0032] PCR 反應液 12.5yL;
[0033] 引物探針混合液1.5ul;
[0034] 滅菌蒸餾水6yL;
[0035] 所述引物的上游引物包含如SEQ ID N0:3所示的堿基序列；
[0036] 下游引物包含如SEQ ID N0:6所示的堿基序列；
[0037] 所述探針，包含如SEQ ID NO:7所示的堿基序列；
[0038] 2)各反應管在漩渦振蕩器上振蕩30秒混勻，瞬時離心后按20μ!7管分裝至PCR儀樣 品反應管中待用；
[0039] 3)將HBV pgRNA純品、陰性質控品、4個定量標準品用洗脫液溶解，各吸取5yL加入 相應的PCR儀樣品反應管中，蓋上管蓋并做好標記，用迷你離心機離心10秒，將管壁上的液 體全部甩至管底，平穩放入儀器樣品擴增槽；
[0040] 4)將振蕩均勻的反應管置于qPCR儀中，根據相應的qPCR儀的使用說明，設置PCR熱 循環條件，完成qRT-PCR反應；
[0041] 結果分析及判定:采用SPSS 21.0統計軟件對結果進行分析。
[0042]優選地，所述PCR的反應條件：（1)預變性的條件，95°C3min; (2)變性的條件，94°C 15secX40個循環；（3)退火，延伸，熒光采集，60°C35secX40個循環；（4)儀器冷卻，25°C lmin〇
[0043]優選地，所述HBV pgRNA的提取的步驟，包括：
[0044] 1)在樣品反應管中加入1 OyL蛋白酶K、4yL助沉劑、300yL病毒裂解液，20yL磁珠，充 分振蕩混勻；
[0045] 2)加入200yL待處理樣本，振蕩混勻各離心管，室溫顛倒混勻10分鐘，使磁珠和核 酸充分結合；
[0046] 3)將離心管放在磁力架上靜置1分鐘，磁珠吸附完全，溶液澄清后棄去上清液，吸 附在離心管蓋上的磁珠可通過反復顛倒磁力架沖洗下來；
[0047] 4)加入500yL洗液A，漩渦振蕩使磁珠重新懸浮，然后置于磁力架上，1分鐘磁分離 后去上清；
[0048] 5)加入500yL洗液B，漩渦振蕩使磁珠重新懸浮，然后置于磁力架上，1分鐘磁分離 后去上清；
[0049] 6)將離心管放置在磁力架上，緩慢加入550yL洗液C，靜置1分鐘磁分離后棄去上清 液，取下離心管；
[0050] 7)加入50yL洗脫液，用移液器緩慢吹打混勻，55 °C溫育5分鐘，期間輕輕晃動溶液 兩次；
[0051] 8)將離心管放在磁力架上靜置1分鐘，磁分離后將上清液轉移至新的滅菌離心管 中，獲得HBV pgRNA粗品。
[0052] 應用上述方法獲得的PCR擴增產物序列如SEQ ID N0:8所示。
[0053]優選地，所述樣本處理的步驟，包括：
[0054]血清樣本采集:抽取靜脈血3_5mL，注入無菌收集管，待樣本自行析出血清或直接 室溫1600rpm離心5分鐘分離出血清；
[0055]血漿樣本采集:抽取靜脈血3-5mL，注入含有EDTA的無菌收集管，立即輕輕顛倒混 勾，待樣本自行析出血衆或直接室溫1600rpm離心5分鐘分離出血衆。
[0056]本發明還提供了檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的試劑盒，其特征在于，該試 劑盒包括有權利要求1所述的引物和探針。
[0057] 優選地，該試劑盒，還包括：陰性質控品、定量標準品I、定量標準品II、定量標準品 III、定量標準品IV。
[0058] 優選地，所述試劑盒包括:蛋白酶K、助沉劑、病毒裂解液、磁珠、洗液A、洗液B、洗液 C、洗脫液、引物探針混合液、反應液、樣本稀釋液、陰性質控品、定量標準品I、定量標準品 11、定量標準品III、定量標準品IV、內標模板，各組份含量為： 蛋白酶 Κ： 240μΙχ1; 助沉劑 96 μLχ? ; 病毒裂解液 7.2mlxl ; 磁珠 480 μΙχ1 洗液 A 12ηι|χ1 * 洗液 Β 12._mlxl :; 洗液 C 13,2 mix 1: 洗脫液 1200 μLχ?
[0059] 引物探針混合液 126 μLχ? ; 反應液 630 μ1χ 1; 樣本稀釋液 1 ιη1χ 1 ; 陰性質控品 2.Ι0μΜ ; 定量標準品I 210μΜ ; 定量標準品II 210μ|χ1; 定董標準品III 210 μLχ?; 定量標準品IV 210μ|χ1 * 內標模板 200 μLχ 1 〇
[0060] 本發明提供的檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的試劑盒應用于乙肝患者血液 中HBV PgRNA的檢測。所述檢測包括HBV PgRNA定性檢測和/或定量檢測。該試劑盒使用方 便，檢測靈敏度極高，檢測結果可靠。
[0061] 與現有技術相比，本發明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測方法、試劑 盒，達到了如下效果：
[0062] 1)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測方法為血液檢測，無創，常規且可大規模 應用，解決HBV cccDNA依賴肝穿的問題。
[0063] 2)本申請提供的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測方法、試劑盒超越常規病 原體RT-PCR技術，可檢測血液中超低載量的PgRNA。
[0064] 3)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測的試劑盒解決臨床上依賴HBV DNA指標， 判斷抗病毒治療停藥后，出現"停藥后復發"的問題，給"乙肝臨床指南十大待解決問題之 一"的"尋找預測NA停藥的臨床標準及生物學標志"的問題解決提供了方案。
[0065] 4)HBV PgRNA試劑盒及其在預測NA停藥的應用可深入研究中國乙肝PgRNA形態，為 開發PgRNA藥物提供基礎研究數據。
【附圖說明】
[0066] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0067] 圖1是本發明實施例1所述的qPCR的結果分析圖。
[0068]圖2是本發明實施例1所述的qPCR的結果分析圖。
[0069] 圖3是本發明實施例1所述的qPCR的結果分析圖。
[0070] 圖4是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0071] 圖5是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0072] 圖6是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0073] 圖7是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0074] 圖8是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0075] 圖9是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0076] 圖10是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0077] 圖11是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0078] 圖12是本發明實施例2所述的實驗結果圖。 圖13是本發明實施例2所述的實驗結果圖。 圖14是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0079] 圖15是本發明實施例2所述的實驗結果圖。
[0080] 圖16是本發明實施例3所述的實驗結果圖。
[0081]圖17是本發明實施例4所述的實驗結果圖。
[0082] 圖18是本發明實施例4所述的實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0083] 如在說明書及權利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定組件。本領域技術人員應 可理解，硬件制造商可能會用不同名詞來稱呼同一個組件。本說明書及權利要求并不以名 稱的差異來作為區分組件的方式，而是以組件在功能上的差異來作為區分的準則。如在通 篇說明書及權利要求當中所提及的"包含"為一開放式用語，故應解釋成"包含但不限定 于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內，本領域技術人員能夠在一定誤差范圍內解決所述 技術問題，基本達到所述技術效果。說明書后續描述為實施本申請的較佳實施方式，然所述 描述乃以說明本申請的一般原則為目的，并非用以限定本申請的范圍。本申請的保護范圍 當視所附權利要求所界定者為準。
[0084] 以下結合附圖對本申請作進一步詳細說明，但不作為對本申請的限定。
[0085] 實施例1
[0086] 1.樣本采集:采集血清或血漿。
[0087] 1)血清樣品采集：用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3~ 5mL，注入無菌收集管，室溫放置不超過4小時，待樣本自行析出血清或直接室溫1600rpm離 心5分鐘分離出血清，轉移到1.5mL滅菌離心管中備用。
[0088] 2)血漿樣品采集：用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3~ 5mL，注入含有EDTA的無菌收集管，立即輕輕顛倒混勻，室溫放置不超過4小時，待樣本自行 析出血漿或直接室溫1600rpm離心5分鐘分離出血漿，轉移到1.5mL滅菌離心管中備用。 [0089] 2.HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取試劑盒，提取乙型肝炎患者血清或血漿中 的HBV RNA。
[0090] 實驗開始前取出試劑盒所需組分，輕微振蕩，使其充分混勻，如試劑中有沉淀，請 溶解后使用，樣本如為冷凍冷藏檢測前先恢復至室溫。操作時，如發現管壁和管蓋有液體， 短暫離心使液體甩入管底，再置于磁力架上。
[0091] 1)取N+5個1.5mL滅菌離心管(N為需要提取臨床樣本的數量，另5個離心管用于試 劑盒定量標準品及陰性質控品的提取），分別加入l〇yL蛋白酶K、4yL助沉劑、300yL病毒裂解 液，20yL磁珠(使用前充分振蕩混勻），加入200yL待處理樣本，振蕩混勻各離心管，室溫顛倒 混勻10分鐘，使磁珠和核酸充分結合。
[0092] 2)將離心管放在磁力架上靜置1分鐘，磁珠吸附完全，溶液澄清后棄去上清液，吸 附在離心管蓋上的磁珠可通過反復顛倒磁力架沖洗下來；
[0093] 3)加入500yL洗液A，漩渦振蕩使磁珠重新懸浮，然后置于磁力架上，1分鐘磁分離 后去上清；
[0094] 4)加入500yL洗液B，漩渦振蕩使磁珠重新懸浮，然后置于磁力架上，1分鐘磁分離 后去上清；
[0095] 5)將離心管放置在磁力架上，緩慢加入550yL洗液C，靜置1分鐘磁分離后棄去上清 液，取下離心管；
[0096] 6)加入50yL洗脫液，用移液器緩慢吹打混勻，55 °C溫育5分鐘，期間輕輕晃動溶液 兩次；
[0097] 7)將離心管放在磁力架上靜置1分鐘，磁分離后將上清液轉移至新的滅菌離心管 中，獲得HBV pgRNA粗品。
[0098] 3.HBV pgRNA的純化：使用使用RNase-free Dnase I純化提取的HBV pgRNA。
[0099] 1)建立如下反應體系：
[0100] RNase-Free DNase 10X反應緩沖液lul;
[0101] RNase-Free DNaselul/ug；
[0102] RNA無核酸酶的水補足至10ul;
[0103] 將獲得的HBV pgRNA粗品溶于洗脫液中，取l-8ul加入如下反應體系中；
[0104] 2) 37 °C孵育半小時；
[0105] 3)加入lul終止液終止反應；
[0106] 4)65°C孵育10分鐘，使DNase失活，得到HBV pgRNA的純品；
[0107] 4 · pgRNA的定量檢測:使用qRT-PCR定量檢測pgRNA。
[0108] 實驗開始前取出試劑盒各組分，充分解凍并持續振蕩15秒混勻。準備相應數量的 PCR儀樣品反應管，除樣本外還應包括1個陰性質控品及4個定量標準品反應管。
[0109] 1)配置反應液
[0110] 確定反應數N，N =待檢樣本數(η) +質控品數(5)+1。計算加到反應混合物中的各個 試劑的量，計算如下表：
[0111]
[0112]
[0113] 所述引物:上游引物包含如SEQ ID N0:3所示的堿基序列；
[0114] 下游引物包含如SEQ ID N0:6所示的堿基序列；
[0115] 所述探針，包含如SEQ ID N0:7所示的堿基序列。
[0116] 2)在漩渦振蕩器上振蕩30秒混勻，瞬時離心后按20μ!7管分裝至PCR儀樣品反應管 中待用。
[0117] 4)將HBV pgRNA純品、陰性質控品、4個定量標準品用洗脫液溶解，各吸取5yL加入 相應的PCR儀樣品反應管中，蓋上管蓋并做好標記，用迷你離心機離心10秒，將管壁上的液 體全部甩至管底，平穩放入儀器樣品擴增槽。
[0118] 5)根據相應的qPCR儀的使用說明，設置PCR熱循環條件，完成qRT-PCR反應;具體條 件如下：
[0119]
[0120] 5.結果分析及判定:采用SPSS 21.0統計軟件對結果進行分析。
[0121]采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，以均數土標準差表示，P<0.05為差異有統 計學意義。
[0122] l)pgRNA的定性分析：
[0123] 檢測PCR擴增序列:得到如SEQ ID N0:7所示的堿基序列。
[0124] 通過"標準曲線法"進行：
[0125] 由于本申請中PCR擴增產物為159bp，這一段序列為pgRNA獨有的序列，其余RNA不 含有，所以，在排除HBV DNA污染的情況下：
[0126] 如果提取液中含有pgRNA，qPCR擴增將出現擴增曲線；
[0127] 如果提取液中不含有pgRNA，qPCR將沒有擴增曲線出現，即為陰性。
[0128] 2)pgRNA的定量分析:通過"標準曲線法"進行（以BIO-RAD CFX96為例）：
[0129] 需要4個梯度濃度的標準品，我們采用的是假病毒(或者質粒），分別為A，B，C，D，其 濃度為A: 1 · 0 X 10~6copies/ml，B: 1 ·0 X 10~5copies/ml，C: 1 ·0 X 10~4copies/ml，D: 1 ·0 X 10~3copies/ml，qPCR結果如圖1所示。SPSS21.0統計軟件自動繪制標準曲線如圖2所示，圖 中圓圈處為4個定量標準品，X處為待測樣本，根據待測樣本的Ct值，從標準曲線中讀出待 測樣本的量，軟件自動給出結果，如圖3所示。由圖3可得到:待測樣本的Ct值為33.69,相應 的 pgRNA 定量為 6 · 732xl0~4copies/ml。
[0130] 實施例2
[0131] 引物、探針的設計：
[0132] 目前，我國HBV基因型以B型和C型為主，還有少量D型，另外還存在少量的上述基因 型的融合型。
[0133] 本發明在設計引物和探針時，同時考慮并兼顧了B型、C型和D型。參照國際公認數 據庫NCBI中所有HBV B型、C型和D型的序列，經比對后，選取了PgRNA差異于其它mRNA的序列 部分，即大約1800bp~2800bp之間的部分進行分析。設計的引物和探針均位于HBV各基因型 保守區序列或者相對保守區序列，確保了"專利所用引物和探針"對中國HBV各類常見基因 型的兼容性。設計出如SEQ ID N0:l-N0:6所示的堿基序列的引物，如SEQ ID N0:7所示的堿 基序列的探針。
[0134] 引物、探針的篩選:PgRNA特異性引物，共3條上游引物(FI、F2、F3，對應如SEQ ID N0:l-N0:3所示的堿基序列），3條下游引物(Rl、R2、R3對應如SEQ ID N0:4-N0:6所示的堿 基序列），一條公用探針(FP對應如SEQ ID N0:7所示的堿基序列）：
[0135] 1.3條上游引物與3條下游引物兩兩組合共9種組合，所用探針均為FP，所以共9種 引物探針組合，具體如下表：
[0136]
[0137] 實驗結果:通過數次實驗多樣本的比較，整體實驗效果F3組合〉F2組合〉F1組合，部 分實驗結果如下圖4-圖6所示。下次實驗挑選出F3組合和F2組合繼續驗證。
[0138] 2.挑選出的F3組合和F2組合繼續實驗，共6種引物探針組合，分別命名為AB⑶EF， 具體如下表：
[0139]
[0140] 實驗結果:通過數次實驗多樣本的比較，C和F(即F2R3組合和F3R3組合)實驗效果 要好于其它組合，部分實驗結果如下圖7-圖12所示。下次實驗挑選出C和F繼續驗證。
[0141] 3.繼續驗證F2R3組合和F3R3組合。
[0142] 實驗結果:通過數次實驗多樣本的比較，F3R3組合整體實驗效果要好于F2R3組合， 部分實驗結果如下圖13-圖14所示。所以最后選出的引物探針組合為:F3R3FP。
[0143] HBV DNA病毒載量分別為1.0 X 108IU/ml~1.0 X lOhU/ml，梯度稀釋的8個濃度，用 自行設計的PgRNA特異性探針進行擴增。因為HBV DNA和PgRNA擴增的序列相同，因此用此引 物探針組合同樣可以擴增HBV DNA。具體實驗結果如圖15所示，1.0X108IU/ml~1.0X 103IU/ml濃度樣本結果均勻分布，1.0 X 102IU/ml~1.0 X lOhU/ml的樣本未擴出。
[0144] 實施例3
[0145] HBV pgRNA提取液DNA擴增驗證
[0146] 應用實施例2中篩選出的引物、探針PCR擴增HBV pgRNA，應用軟件SPSS 21.0統計 軟件分析結果，會得到如圖16所示的圖像。出現HBV DNA擴增曲線。病毒RNA提取液中會出現 殘留DNA的現象，殘留少量的HBV DNA會對后續的RNA逆轉錄擴增造成影響，因此必須去除。
[0147] 實施例4
[0148] 使用RNase-free Dnase I消除HBV DNA的驗證：
[0149] 應用如實施例1中的使用RNase-free Dnase I對獲得的HBV pgRNA處理后，對HBV pgRNA進行PCR擴增，應用軟件SPSS 21.0統計軟件分析結果，會得到如圖17所示的圖像，未 出現HBV DNA擴增曲線。因此該方法可以有效地純化HBV pgRNA，消除殘留的HBV DNA會對后 續的RNA逆轉錄擴增造成影響。
[0150] 對兩例純凈pgRNA樣本按照實施例1的方法監測分析，其病毒載量分別為1.9 X 105IU/ml和3.8 X 107IU/ml，PCR結果圖18所示。靠前的是載量為1.9 X 105IU/ml的樣本，靠后 的為3.8X107IU/ml的樣本。從圖中可以看出，HBV DNA載量較高的樣本PgRNA定量反而較 低。
[0151] 實施例5
[0152] PgRNA試劑盒組成如下表所示：
[0153]
[0154] 所述引物包含如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6所示的堿基序列，；
[0155] 所述探針包含如SEQ ID NO:7所示的堿基序列。
[0156] 上述試劑盒的技術指標：
[0157] 1)最低檢出限
[0158] 在 102copies/ml、5X 102copies/ml、l X 103copies/ml、2X 103copies/ml四個滴度 處進行十次重復檢測，至少在1 X l〇3copies/ml處陽性率為100%。
[0159] 2)精密度
[0160] 同一批試劑對濃度為lX103copies/ml的樣本進行10次重復檢測，Ct值的檢測結 果CVS 5% 〇
[0161] 3)線性范圍
[0162] 對濃度大于1 X 108copies/ml樣本進行倍比稀釋，分別進行檢測，線性范圍至少達 至Ijl X 103~1 X 108copies/ml。
[0163] 4)對不同基因型的覆蓋
[0164] 對中國常見的乙型肝炎病毒(B、C、D基因型）的pgRNA均能做到有效檢測。
[0165] 5)特異性
[0166] a.分別對含有!1(^、!《1^48￥、甲型肝炎病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒11 型、甲型流感病毒等病原體的樣本進行檢測，檢測結果均為陰性；
[0167] b.干擾物質:樣本中常見干擾物質高濃度的膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、總IgG對 PCR結果無明顯干擾；
[0168] c.藥物影響：常用抗病毒藥物高濃度的干擾素和拉米夫定對PCR檢測結果無明顯 干擾。
[0169] 6)穩定性
[0170]試劑盒有效期至少達到12個月。
[0171] 實施例6
[0172] 乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的試劑盒的應用：
[0173] 1.病例的入組：確診為慢性乙型肝炎病毒感染者，排除合并感染HCV、HIV患者，肝 硬化、肝癌患者，妊娠期婦女及嬰幼兒患者。研究對象分組如下：
[0174] (1 )a組:未經抗病毒治療的慢性HBV感染者，10例；
[0175] (2) b組:經抗病毒治療3個月以上的慢性HBV感染者，10例；
[0176] (3)c組:經抗病毒治療停藥3個月內病毒學復發或臨床復發的患者，10例；
[0177] (4)d組:經抗病毒治療停藥后1年內未復發的患者，10例。
[0178]記錄所有入組病人的臨床資料，包括病人的性別、年齡、血常規、乙肝五項、HbsAg 定量、HBV DNA載量、PgRNA定量、肝功能(ALT、AST)、抗病毒治療方案以及抗病毒治療持續時 間等，使用實施例5提供的試劑盒按照試劑盒操作標準測定標本中的PgRNA。
[0179] 3.統計數據，分析實驗結果，分析各組病例的PgRNA的含量。
[0180] 與現有技術相比，本發明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測方法、試劑 盒，達到了如下效果：
[0181] 1)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測方法為血液檢測，無創，常規且可大規模 應用，解決HBV cccDNA依賴肝穿的問題。
[0182] 2)本申請提供的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測方法、試劑盒超越常規病 原體RT-PCR技術，可檢測血液中超低載量的PgRNA。
[0183] 3)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測的試劑盒解決臨床上依賴HBV DNA指標， 判斷抗病毒治療停藥后，出現"停藥后復發"的問題，給"乙肝臨床指南十大待解決問題之 一"的"尋找預測NA停藥的臨床標準及生物學標志"的問題解決提供了方案。
[0184] 4)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的檢測的試劑盒及其在預測NA停藥的應用可深 入研究中國乙肝PgRNA形態，為開發PgRNA藥物提供基礎研究數據。
[0185] 由于方法部分已經對本申請實施例進行了詳細描述，這里對實施例中涉及的系統 與方法對應部分的展開描述省略，不再贅述。對于系統中具體內容的描述可參考方法實施 例的內容，這里不再具體限定。
[0186] 上述說明示出并描述了本申請的若干優選實施例，但如前所述，應當理解本申請 并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環境，并能夠在本文所述申請構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識 進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本申請的精神和范圍，則都應在本申 請所附權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在 于，其包括如下實現步驟： 樣本處理:取外周血3-5ml注入無菌收集管，室溫放置； 皿V PgRNA的提取：使用病毒RNA提取試劑盒，提取乙型肝炎患者血清或血漿中的皿V RNA，獲得皿V RNA粗品； HBV P排NA的純化：使用使用腳ase-free Dnase I純化提取的皿V PgRNA，包括如下步 驟： 1) 建立如下反應體系： RNase-Free 麗ase IOX反應緩沖液Iul; RNase-Free DNaselul/ug； RNA無核酸酶的水補足至IOul; 將獲得的HBV PgRNA粗品溶于洗脫液中，取I-Sul加入如下反應體系中； 2) 37 °C解育半小時； 3) 加入Iul終止液終止反應； 4) 65°C解育10分鐘，使面ase失活，得到HBV PgRNA的純品； PgRNA的定量檢測:使用qRT-PCR定量檢測PgRNA，包括:如下步驟： 1) 配制qRT-PCR反應體系， qRT-PCR反應體系： PCR反應液12.5化； 引物探針混合液1.加1; 滅菌蒸饋水化L 所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO:3所示的堿基序列； 下游引物包含如SEQ ID NO:6所示的堿基序列； 所述探針，包含如SEQ ID NO:7所示的堿基序列； 2) 各反應管在縱滿振蕩器上振蕩30秒混勻，瞬時離屯、后按20化/管分裝至PCR儀樣品反 應管中待用； 3) 將皿V PgRNA純品、陰性質控品、4個定量標準品用洗脫液溶解，各吸取化L加入相應 的PCR儀樣品反應管中，蓋上管蓋并做好標記，用迷你離屯、機離屯、10秒，將管壁上的液體全 部甩至管底，平穩放入儀器樣品擴增槽； 4) 將振蕩均勻的反應管置于qPCR儀中，根據相應的qPCR儀的使用說明，設置PCR熱循環 條件，完成qRT-PCR反應； 結果分析及判定:采用SPSS 21.0統計軟件對結果進行分析。2. 根據權利要求1所述的檢測乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述PCR的反應條件：（1)預變性的條件，95〇C3min; (2)變性的條件，94〇C 15sec X 40個循環； (3)退火，延伸，巧光采集，60°C35secX40個循環；（4)儀器冷卻，25°Clmin。3. 根據權利要求1所述的檢測乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述皿V PgRNA的提取的步驟，包括： 1)在樣品反應管中加入10化蛋白酶K、4化助沉劑、300化病毒裂解液，20化磁珠，充分振 蕩混勻； 2) 加入20化L待處理樣本，振蕩混勻各離屯、管，室溫顛倒混勻10分鐘，使磁珠和核酸充 分結合； 3) 將離屯、管放在磁力架上靜置1分鐘，磁珠吸附完全，溶液澄清后棄去上清液，吸附在 離屯、管蓋上的磁珠可通過反復顛倒磁力架沖洗下來； 4) 加入50化L洗液A，縱滿振蕩使磁珠重新懸浮，然后置于磁力架上，1分鐘磁分離后去 上清； 5) 加入50化L洗液B，縱滿振蕩使磁珠重新懸浮，然后置于磁力架上，1分鐘磁分離后去 上清； 6) 將離屯、管放置在磁力架上，緩慢加入55化L洗液C，靜置1分鐘磁分離后棄去上清液， 取下離屯、管； 7) 加入50化洗脫液，用移液器緩慢吹打混勻，55 °C溫育5分鐘，期間輕輕晃動溶液兩次； 8) 將離屯、管放在磁力架上靜置1分鐘，磁分離后將上清液轉移至新的滅菌離屯、管中，獲 得皿V PgRNA粗品。4. 根據權利要求1所述的檢測乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述引物的擴增產物序列如SEQ ID NO:8所示。5. 根據權利要求1所述的檢測乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述樣本處理的步驟，包括： 血清樣本采集:抽取靜脈血3-5mL，注入無菌收集管，待樣本自行析出血清或直接室溫 160化pm離屯、5分鐘分離出血清； 血漿樣本采集:抽取靜脈血3-5mL，注入含有抓TA的無菌收集管，立即輕輕顛倒混勻，待 樣本自行析出血漿或直接室溫ieOOrpm離屯、5分鐘分離出血漿。6. 檢測乙型肝炎患者血液中皿V PgRNA的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括有權利要 求1所述的引物和探針。7. 根據權利要求6所述的檢測乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的試劑盒，其特征在于， 該試劑盒，還包括：陰性質控品、定量標準品I、定量標準品11、定量標準品111、定量標準品 IV。8. 根據權利要求6或7任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:蛋白酶K、助 沉劑、病毒裂解液、磁珠、洗液A、洗液B、洗液C、洗脫液、引物探針混合液、反應液、樣本稀釋 液、陰性質控品、定量標準品I、定量標準品11、定量標準品111、定量標準品IV、內標模板，各 組份含量為：9. 權利要求6所述檢測乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒應用于乙肝患者血液中皿V PgRNA的檢測。10. 根據權利要求9所述的檢測乙型肝炎患者血液中皿V PgRNA的試劑盒，其特征在于， 所述檢測包括皿V PgRNA定性檢測和/或定量檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK105907891SQ201610364652
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】葉鋒, 劉明坤, 余榮
【申請人】北京旌準醫療科技有限公司