一種快速區分HP-PRRS疫苗GDr180株與野毒株的引物、探針及方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDr180株與野毒株的引物、探針及方法。該方法結合了實時熒光定量PCR技術及熔解曲線分析技術，根據熔解曲線Tm值差異鑒定GDr180株與野毒株；操作簡單：只需在PCR反應之前加探針即可；檢測速度快且高通量：全部操作過程只需3小時，極大縮短了分型所需時間；費用相對較低：只需要一條普通探針即可達到鑒別檢測的目地；準確性高、特異性好，重復性好，可以準確、快速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應用。
【專利說明】
_種快速區分HP-PRRS疫苗GDr 180株與野毒株的引物、探針及 方法
技術領域
[0001] 本發明涉及病毒活疫苗毒株與野毒株的鑒別方法，具體涉及一種快速區分高致病 性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的檢測方法及其引物和探針。
【背景技術】
[0002] 2006年夏，在中國南方爆發了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP_PRRS)疫情，這次疫情發病快、病 死率高、治愈率低，在半年內波及全國各地，給我國養豬業造成嚴重的損失。HP-PRRS是由豬 繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)變異株引起的一種急性高致死性疫病，該變異株稱為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 病毒(HP-PRRSV)。目前我國主要采取以疫苗免疫為主的綜合性防控措施，對豬實施強制免 疫，使用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為活疫苗（江西株JXA1-R、湖南株Hun4-F112、天津株 TJM-F92、廣東株 GDrl80)。
[0003] 由于高致病性豬藍耳病疫苗種類較多，加之國內外學者與養豬企業對HP-PRRS疫 苗使用觀點的差異，導致我國目前豬藍耳病疫苗的使用相對混亂。多種疫苗株同時使用增 加了病毒重組的風險，同時部分疫苗有毒力返強的可能性。所以，對發病豬進行病原檢測， 有效、盡早地診斷感染病原是疫苗株還是野毒株，對于豬場有效控制動物疫病，最大限度減 少經濟損失具有重要意義。HP-PRRS疫苗株⑶rl80于2015年5月獲得農業部頒發的三類新獸 藥注冊證書并上市。針對HP-PRRS疫苗株⑶rl80與野毒株的鑒別診斷方法僅有一篇采用MGB 探針法的報道(張文利，等.高致病性PRRSV⑶疫苗株與野毒株雙重熒光定量RT-PCR鑒別 方法的建立[J]，中國預防獸醫學報.2012, 11(34): 898-902)。雖然該方法具有較高靈 敏度和特異性，但該方法涉及到兩條MGB探針，成本較高，難以普及使用。所以建立一種成本 低，靈敏度高，特異性強，推廣易，可快速區分HP-PRRSV活疫苗GDrl80株與野毒株的檢測方 法具有重要的意義。
[0004] 焚光恪解曲線分析技術（fluorescence melting curve analysis，FMCA)是一種 結合了實時熒光定量PCR技術(RT-PCR)及熔解曲線分析(Melting Curve Analysis，MCA)技 術的新的基因分型診斷檢測技術（Ahn JJ, Kim Y, Lee SY, Hong JY, Kim GW, Hwang SY. Fluorescence melting curve analysis using self-quenching dual-labeled peptide nucleic acid probes for simultaneously identifying multiple DNA sequences. Anal Biochem. 2015, 484:143-7·)。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 GDrl80株與野毒株的引物和探針。
[0006] 本發明的目的在于提供一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 ⑶r 180株與野毒株的方法。
[0007] 本發明的再一目的在于提供一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 GDr 180株與野毒株的試劑盒。
[0008] 本發明所采取的技術方案是： 一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗株GDrlSO株與野毒株的引物，其核 苷酸序列如下所示： 引物P1:5'-GGTTGACATGCTGACTTG-3'（SEQIDN0:1)， 引物P2:5'-CACTGAACCAATGGTGAG-3'（SEQ ID N0:2)。
[0009] 一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的探針，其 核苷酸序列如下所示： 探針P:5'-CCCAAGGATGATTCTCGAGACACCG _3'（SEQ ID N0:3)。
[0010] -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的試劑盒， 該試劑盒含有上述所述的引物。
[0011] 進一步的，該試劑盒還含有上述所述的探針。
[0012] 一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的方法，包 括以下步驟： 1) 從樣品中提取病毒核酸； 2) 以核酸為模板，用上述所述的引物對PI、P2、探針P進行FMCA擴增反應獲得擴增產物； 3) 對擴增產物進行FMCA分析，確定病毒類型。
[0013] 進一步的，步驟2沖FMCA擴增反應體系為： 核酸模板 1 yL PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.5 yL 2X1 Step Buffer 6.25yL 2.0Mm 引物 PI 0.5pL lOMm 引物 P2 0.5pL lOMm 探針P 0.25pL RNase Free ddH2〇 3.5pL 總體積 12.5yL。
[0014] 進一步的，步驟2)中的FMCA擴增反應程序為:50°C反轉錄30min; 95°C預變性2min; 95°C 變性 20s，55°C 退火 20s，72°C 延伸 20s;循環 55 次;98°C 變性 2min，40°C 雜合 2min，55°C 到 75°C以l°C/s的熔解速率進行熔解曲線分析。
[0015] 進一步的，步驟3)中所述FMCA分析的具體分析過程為： 以標準陽性樣品高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO為陽性對照，若待檢樣品 和陽性對照之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定為HP-PRRSV疫苗株GDrl80; 以標準陽性樣品高致病性豬繁殖與呼吸綜合征野毒GD株為陽性對照，若待檢樣品和陽 性對照之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定為HP-PRRSV野毒株。
[0016] 本發明的有益效果是： 1)本發明首次建立了一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與 野毒株的熔解曲線分析方法、引物和探針，操作簡單：只需在PCR反應之前加探針即可;檢測 速度快且高通量:全部操作過程只需3小時，極大縮短了分型所需時間；費用相對較低：只需 要一條普通探針即可達到鑒別診斷的目地;準確性高、特異性好，重復性好，可以準確、快 速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應用。
[0017] 2)本發明的FMCA引物，對HP-PRRSV疫苗株GDr 180及野毒株，均有很好的擴增性，有 助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時間。
[0018] 3)本發明的探針P對疫苗株⑶rl80有完全的匹配性，對HP-PRRSV野毒株僅有一個 堿基的差異，有助于提高分析效率，減少病毒分型的時間。
[0019] 4)本發明的FMCA引物和探針特異性好，只與疫苗株GDrl80和野毒株結合，不與其 他常見豬源病毒，如豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV)、豬偽狂犬病毒 (Pseudorabies Virus, PRV)、豬圓環2型（Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬細小病 毒(Porcine parvovirus, PPV)等核酸結合，特異性擴增HP-PRRSV核酸，有利于提高本發明 對HP-PRRSV疫苗株GDrl80和野毒株分析的正確性。
[0020] 5)本發明利用一步法FMCA方法來提高區別HP-PRRSV疫苗株GDrl80及野毒株的準 確性和重復性。本發明方法成本低，靈敏度高，特異性強，具有較高的臨床應用推廣價值。
【附圖說明】
[0021] 圖1為⑶rl80和⑶標準樣品FMCA峰型化熔解曲線圖； 圖2為臨床樣品FMCA峰型化熔解曲線圖；以標準品⑶rl80和⑶作為陽性對照;紅色熔解 曲線為HP-PRRSV疫苗株GDr 180陽性對照品，藍色熔解曲線為HP-PRRSV野毒株GD陽性對照 品，其它的為臨床野毒樣本及水對照樣品； 圖3為FMCA方法特異性試驗結果;紅色熔解曲線為HP-PRRSV疫苗株⑶r 180陽性對照品， 藍色熔解曲線為HP-PRRSV野毒株⑶陽性對照品，其它的為CSFV、PRV、PCV2和PPV核酸樣本及 水對照樣品； 圖4為質粒陽性樣本FMCA方法靈敏度試驗結果;其中A為質粒p-GDrl80梯度稀釋擴增曲 線，B為質粒p-GDrl80梯度稀釋恪解曲線;C為質粒p-GD梯度稀釋擴增曲線，D為質粒p-GD梯 度稀釋熔解曲線。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0023]實施例1 一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株 的引物和探針 1)FMCA引物： 經過對所設計的大量引物進行篩選后，發現引物堿基序列SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2 對FMCA方法區分HP-PRRSV疫苗GDr 180株和野毒株的效果最好，其堿基序列如下所示。
[0024] P1:5，-GGTTGACATGCTGACTTG-3，（SEQ ID N0:1)， P2：5，-CACTGAACCAATGGTGAG-3，(SEQ ID N0：2)〇
[0025] 2)探針 經過對所設計的大量探針進行篩選后，發現探針堿基序列SEQ ID N0:3對FMCA方法區 分HP-PRRSV疫苗GDrlSO株和野毒株的效果最好，其堿基序列如下所示。
[0026] 探針P: 5 ' -FAM-CCCAAGGATGATTCTCGAGACACCG-BHQ1-3 '（SEQ ID NO: 3)，或其核苷 酸反向互補序列。
[0027] 實施例2 -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株 的檢測方法 標準樣品的FMCA分析 1 )PRRSV標準品核酸的提取： 分別取HP-PRRSV疫苗⑶r 180株，加入3mL PBS鹽酸緩沖溶液進行溶解，取HP-PRRSV野毒 ⑶株細胞培養液，分別取200yL按TAKARA公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4.0的說明書進行核酸提取。
[0028] 2)陽性標準樣品的FMCA操作步驟 為了驗證所設計的引物和探針對實際樣品的鑒別能力，本研究利用HP-PRRSV疫苗株 GDr 180和HP-PRRSV野毒GD株作為標準樣品進行FMCA分析。分別以上述標準樣品提取核酸作 為核酸模板，分別進行FMCA擴增反應和分析。
[0029] FMCA 分析： 參照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit產品說明書，按以下組成配制FMCA反應液。
[0030] RT-PCR擴增反應程序為50°C反轉錄30min; 95°C預變性2min; 95°C變性20s，55°C退 火20s，72°C延伸20s;循環55次。
[0031] FMCA運行程序：98°C變性2min，40°C雜合2min，55°C到75°C以l°C/s的熔解速率進 行恪解曲線分析。FMCA試驗結果用LightCycler? 96 SW 1.1軟件進行分析。
[0032] 3)陽性標準樣品FMCA結果分析 RT-PCR擴增產物用ROCHE LightCycler 96分析儀進行分析。
[0033]圖1為⑶rl80和⑶標準樣品FMCA峰型化熔解曲線圖。分析結果顯示，熔解曲線分析 方法能夠區分HP-PRRSV疫苗株⑶rl80和HP-PRRSV野毒株。其中，GDrl80熔解峰Tm值較高為 68.42 ± 0.2°C，⑶熔解峰Tm值較低為63.65 ± 0.1°C，兩者熔解峰Tm差異明顯（約4.7°C )。 [0034]實施例3 -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株 的方法 臨床樣品FMCA分析 1)從樣本中提取病毒核酸:分別取疑似感染有HP-PRRSV的豬肺臟組織樣品2g，加入3mL PBS鹽酸緩沖溶液進行研磨，將研磨好的勻漿液4000 Xg離心8 min，并吸取離心上清液 至_80°C保存備用；或血清樣本200yL;組織樣品勻漿液和血清樣品按TAKARA公司的 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的說明書進行核酸提取。
[0035] 2)以提取的病毒核酸為模板，以上述實施例2中所述的方法進行FMCA分析，結果分 析方法如下： 以標準品GDrlSO為陽性對照，待檢樣品和陽性對照之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于 1.0°C時判定為HP-PRRSV疫苗株GDrl80; 以標準品GD為陽性對照，待檢樣品和陽性對照之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C 時判定為HP-PRRSV野毒株。
[0036] 為了驗證所建立的方法對實際臨床樣品的鑒別能力。本發明對廣東省養殖場收集 到的1 〇份HP-PRRSV臨床樣品進行FMCA分析，分析結果如圖2，從中可以看出，10份臨床樣品 中共檢測出1份HP-PRRSV疫苗株GDrl80(9號樣本)和9份HP-PRRSV野毒株（1-8號、10號樣 本）。1份HP-PRRSV疫苗株GDrl80(9號樣本)熔解峰Tm值為68.38°C，與陽性對照樣品⑶rl80 熔解峰Δ Tm值絕對值小于1°C(0.04°C)，9份HP-PRRSV野毒株（1-8號、10號樣本)熔解峰Tm值 為64.02 ± 0.36°C，與陽性對照樣品⑶熔解峰Δ Tm值絕對值小于1°C (0.56 ± 0.36°C )。
[0037] 實施例4 一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株 的方法 特異性實驗 下面對本發明建立的FMCA檢測方法進行特異性檢測。
[0038] 分別提取其他常見豬病毒核酸，如豬痕病毒（classical swine fever virus， CSFV)、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV)、豬圓環2型（Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬細小病毒(Porcine parvovirus, PPV)的核酸為模板，以上述實施例3中所述 的方法進行FMCA分析，分別驗證引物P1/P2和探針P特異性，同時以HP-PRRSV疫苗株⑶rl80 和HP-PRRSV野毒⑶株為陽性對照，水作為陰性對照進行FMCA分析。
[0039]分析結果如圖3所示，從圖上可看出，本發明FMCA檢測方法能特異性擴增出HP-PRRSV并形成特異的熔解峰型，而其它常見病毒，如CSFV、PRV、PCV2和PPV樣品均未形成特異 的熔解峰型，表明本發明使用的探針p、引物P1/P2特異性高，適合作為FMCA探針和引物。 [0040]實施例5 -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株 的檢測方法 靈敏度試驗 下面對本發明建立的檢測方法進行靈敏度檢測。
[0041 ] 分別以HP-PRRSV疫苗株GDrl80和HP-PRRSV野毒GD株Nsp3基因構建陽性質粒P- GDrl80和p-GD(Nsp3基因中含有本發明檢測的目的基因片段），將陽性質粒分別進行定量和 梯度稀釋后進行FMCA分析，檢測本發明檢測方法最低檢測限。
[0042] 其中FMCA反應參考TAKARA公司的Ex Taq? Version 2.0說明書配制擴增反應體 系，為：
PCR擴增反應程序為95°C預變性2min; 95°C變性20s，55°C退火20s，72°C延伸20s;循環 55次。
[0043]其余按照上述實施例3中所述的方法進行分析。
[0044]圖4為質粒陽性樣本FMCA方法靈敏度試驗結果;A為質粒p-GDrl80梯度稀釋擴增曲 線，B為質粒p-GDrl80梯度稀釋恪解曲線;C為質粒p-GD梯度稀釋擴增曲線，D為質粒p-GD梯 度稀釋熔解曲線，數據卜10表示的質粒濃度依次為1.〇χ1〇 9、1.〇χ1〇8、1.〇χ1〇7、1.〇χ1〇6、 l.OxlO^l.OxlO'l.OxlO^l.OxlO^l.OxlO^l.OxloQcopies/yL;從圖4中可看出，本發明 FMCA方法對陽性質粒p_GDrl80和p-GD最低檢測限分別為1.0xl0Qcopy/yL和1.0xl0 Qcopy/y L〇
[0045]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗株GDrlSO株與野毒株的引物，其 核苷酸序列如下所示： 引物P1:5'-GGTTGACATGCTGACTTG-3'（SEQIDN0:1)， 引物P2:5'-CACTGAACCAATGGTGAG-3'（SEQ ID NO:2)。2. -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的探針，其核 苷酸序列如下所示： 探針P:5'_ CCCAAGGATGATTCTCGAGACACCG-3'（SEQ ID NO:3)。3. -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的試劑盒，其 特征在于:該試劑盒含有權利要求1所述的引物。4. 根據權利要求3中所述的試劑盒，其特征在于：該試劑盒還含有權利要求2所述的探 針。5. -種快速區分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO株與野毒株的方法，其特 征在于:包括以下步驟： 1) 從樣品中提取病毒核酸； 2) 以核酸為模板，用權利要求1所述的引物對P1、P2、權利要求2所述的探針P進行FMCA 擴增反應獲得擴增產物； 3 )對擴增產物進行FMCA分析，確定病毒類型。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于:步驟2)中FMCA擴增反應體系為： 核酸模板 I yL PrimeScript I Step Enzyme Mix 0.5 yL 2X1 Step Buffer 6.25yL 2 .OMm 引物 Pl 0.5pL IOMm 引物 P2 0.5pL IOMm 探針P 0.25pL RNase Free ddH2〇 3.5pL 總體積 12.5yL。7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟2)中的FMCA擴增反應程序為：50°C反 轉錄 30min; 95°C 預變性 2min; 95°C 變性 20s，55°C 退火 20s，72°C 延伸 20s;循環 55 次，98°C 變 性2min，40°C雜合2min，55°C到75°C以l°C/s的熔解速率進行熔解曲線分析。8. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟3)中所述FMCA分析的具體分析過程 為： 以標準陽性樣品高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗GDrlSO為陽性對照，若待檢樣品 和陽性對照之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定為HP-PRRSV疫苗株GDrl80; 以標準陽性樣品高致病性豬繁殖與呼吸綜合征野毒GD株為陽性對照，若待檢樣品和陽 性對照之間熔解峰Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定為HP-PRRSV野毒株。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907890SQ201610296854
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】劉志成, 張建峰, 沈海燕, 張春紅, 孫俊穎, 康樺華
【申請人】廣東省農業科學院動物衛生研究所