miR-124在乳腺癌骨轉移疾病中的應用
【專利摘要】本發明涉及miR?124在乳腺癌骨轉移疾病中的應用，包括：miR?124在制備預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發生轉移的工具中的應用，以及miR?124在制備預防和/或治療乳腺癌骨轉移的藥物中的應用。本發明檢測miR?124在不同骨轉移能力乳腺癌細胞及小鼠乳腺癌骨轉移組織中的表達，初步明確它與乳腺癌骨轉移的關系，并進一步通過外源性上調或抑制腫瘤細胞中miR?124表達，觀察其對成骨細胞和破骨細胞的作用，進一步明確miR?124通過調控乳腺癌細胞和骨微環境之間的相互作用而抑制乳腺癌骨轉移。本發明首次驗證了miR?124在乳腺癌骨轉移發生中的作用，為乳腺癌骨轉移的治療提供了新的靶點。
【專利說明】
m i R-124在乳腺癌骨轉移疾病中的應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物醫藥技術領域，具體地說，涉及miR-124在診斷乳腺癌骨轉移、制 備抑制乳腺癌骨轉移的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是我國女性中最常見的惡性腫瘤，其發病率占女性腫瘤第一位，而死亡率 占第二位。盡管隨著診斷和治療水平的發展，早期乳腺癌更容易得到診斷，并已有標準的治 療選擇，生存率也有所提高。然而，晚期乳腺癌患者常發生局部進展或遠處轉移，目前仍無 公認的治療標準，生存期亦未得到顯著改善。乳腺癌遠處轉移最常見的部位是骨。在晚期乳 腺癌患者中，骨轉移的發生率高達65 %至75 %，而首發轉移部位為骨者占27-50 %。乳腺癌 骨轉移可引起骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等骨相關事件，嚴重影響患者的生存質量和總體 預后。
[0003] 目前認為乳腺癌骨轉移應視為全身性疾病，需采取綜合治療措施，以達到預防和 治療SREs，緩解疼痛，恢復功能，提高生活質量，延長生存期的目的。除了化療、內分泌治療 和分子靶向治療等全身治療以及手術治療和放療等局部治療外，骨調節藥物因可發揮預防 和治療骨轉移相關事件的作用，已在乳腺癌骨轉移患者的治療中占據重要地位。然而，骨調 節藥物并不能預防乳腺癌患者發生骨轉移，亦沒有證據證實其可延長患者的總體生存期。 因此，深入研究發生乳腺癌骨轉移的機制，尋找新的治療靶點，將有助于進一步改善患者的 生存質量，延長生存期。
[0004] 乳腺癌骨轉移過程中，腫瘤細胞經過迀移、侵襲、粘附等環節到達骨微環境后，和 骨微環境中的成骨細胞、破骨細胞、骨基質細胞之間產生復雜的相互作用，導致成骨/破骨 平衡打破，形成了主要表現為溶骨性病變的病灶，引發骨相關事件。在以上過程中，許多發 揮調控作用的基因或分子表達出現異常，可能成為新的作用靶點或診斷標志物，微小RNA (microRNA，miRNA)就是其中的研究熱點之一。作為基因轉錄后調控的重要元件之一，miRNA 可通過作用于與乳腺癌發生發展相關的信號轉導通路或骨微環境中的重要細胞因子或趨 化因子促進或抑制額腺癌骨轉移的發生。作為內源存在的非編碼雙鏈RNA，miRNA具有一定 的組織特異性和分子靶向性，通過外源性調控相關miRNA表達可能比傳統的放化療更安全， 可能成為治療乳腺癌骨轉移的新手段，具有良好的應用前景。
[0005] miR-124最早在小鼠腦組織中被克隆，隨后被證實在人胚胎干細胞中亦有表達。作 為腦組織中表達量最高的miRNA之一，已有許多研究表明miR-124主要參與了神經系統的發 育，其表達異常與多種神經系統疾病相關。近來有越來越多的研究關注miR-124在惡性腫瘤 發生發展中的作用。但目前為止，關于miR-124在乳腺癌骨轉移中的作用尚未見報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一個目的是，提供miR-124在制備預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺 癌是否發生轉移的工具中的應用。
[0007] 本發明的第二個目的是，提供一種預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發 生轉移的芯片。
[0008] 本發明的第三個目的是，提供一種預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發 生轉移的試劑盒。
[0009] 本發明的第四個目的是，提供miR-124在制備預防和/或治療乳腺癌骨轉移的藥物 中的應用。
[0010] 本發明的第五個目的是，提供miR-124在制備抑制成骨細胞促進破骨細胞分化的 藥物中的應用。
[0011] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：
[0012] 本發明提供了 miR-124在制備預判乳腺癌骨轉移的風險的工具中的應用。
[0013] 本發明還提供了 miR-124在制備診斷乳腺癌是否發生轉移的工具中的應用。
[0014]本領域人員了解，為了保證微小RNA的穩定性，可以在微小RNA的一端或者兩端增 加保護性堿基，如TT，也可對微小RNA堿基進行修飾，但是上述修飾不影響微小RNA的功能。 因此，本領域技術人員熟知，在不影響miR-124功能的條件下，對miR-124進行堿基修飾或者 在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發明的保護范圍之內。
[0015] 本發明的實驗證明了miR-124在高轉移性乳腺癌細胞及腺癌骨轉移組織中的表達 下調，因此，與不發生骨轉移的乳腺癌組織中的miR-124的水平相比，如果受試者乳腺癌組 織中miR-124的水平顯著降低，那么則可以判斷該受試者乳腺癌發生骨轉移的風險高、或者 已經發生轉移，從而采取預防乳腺癌細胞轉移的方案或者為臨床治療方案的制定提供診斷 基礎。
[0016] 進一步，上述預判乳腺癌骨轉移風險，判斷乳腺癌是否發生轉移的工具包括但不 限于芯片、試劑盒。所述工具包括用于待測樣本中miR-124表達水平的試劑。所述試劑可以 是針對miR-124的引物或探針。
[0017] 本發明還提供了一種用于預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發生轉移的 芯片，所述芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸 探針包括特異性地對應于miR-124的部分或全部序列。所述寡核苷酸探針還可包括針對現 有技術中已經報道的可用于判斷乳腺癌是否發生骨轉移或者判斷乳腺癌轉移風險的寡核 苷酸探針。將多種miRNA的檢測探針防治在同一芯片上通過檢測多種miRNA指標聯合判斷乳 腺癌骨轉移的情況也包含在本發明的保護范圍之內。
[0018] 進一步，所述固相載體可采用基因芯片技術領域的各種常用材料，例如但不限于 尼龍膜，經活性基團（如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。
[0019] 所述的mi RNA芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規制造方法，例如，如 果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸 探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序列或陣列， 然后通過放置過夜來固定，就可得到本發明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修飾，則其制 備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.L.erisi， V.R.Iyer?P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997;278:680和馬立人，蔣中華主編·生物芯 片.北京:化學工業出版社，2000,1-130。
[0020]本發明還提供了一種預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發生轉移的試劑 盒，所述試劑盒包括用于檢測受試者乳腺癌組織中miR-124表達水平的試劑，與未發生骨轉 移的乳腺癌組織中的miR-124表達水平進行比較，若乳腺癌組織中miR-124的表達水平顯著 降低，則判斷該受試者的乳腺癌發生骨轉移的風險高、或者已經發生轉移。
[0021 ] 進一步，所述試劑包括針對miR-124的引物和/或探針。所述試劑還可包括針對現 有技術中已經報道的可用于判斷乳腺癌骨轉移是否發生，或者判斷乳腺癌骨轉移風險的引 物和/或探針。將多種miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA 指標聯合判斷乳腺癌骨轉移的情況也在本發明的保護范圍之內。
[0022]本發明的微小RNA可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達微小RNA的 DNA片段的載體轉染細胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。
[0023] 病毒載體可以是任何適當的載體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。
[0024] 真核表達載體可以是任何適當的表達載體，包括但不限于pCMV-Myc表達載體、 pcDNA3.0表達載體、pcDNA3.1表達載體、pEGFP表達載體、pEF-Bos表達載體、pTe t表達載體、 pTRE表達載體、或者在公知表達載體的基礎上經改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0025] 可以表達微小RNA的DNA片段可以通過如下方式獲取:從miRNA數據庫中（http:// microrna. sanger .ac .uk/sequences/)尋找微小RNA在基因組上的位置及具體序列信息，根 據基因組序列確定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp區間內設計特 異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表達微小RNA的DNA片段。
[0026] miR-124為靶點的藥物篩選:在得知了miR-124與乳腺癌骨轉移的密切相關性后， 可以基于該特征來篩選促進miR-124表達的物質。之后，可從所述的物質中找到對于治療乳 腺癌骨轉移真正有用的藥物。
[0027] 因此，本發明提供了一種篩選治療乳腺癌骨轉移的潛在物質的方法，所述的方法 包括:用候選物質處理高轉移性的乳腺癌體系，若所述候選物質可促進miR-124的表達或活 性，則表明該候選物質是治療乳腺癌骨轉移的潛在物質。所述高轉移性的乳腺癌體系可以 是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。優選地，對獲得的潛在物質進行 進一步的細胞實驗和/或動物實驗，以進一步選擇和確定對于治療乳腺癌骨轉移真正有用 的物質。
[0028] 本發明提供了 miR-124在制備抑制乳腺癌骨轉移或者預防乳腺癌骨轉移的藥物中 的應用。本發明的實驗證明miR-124與乳腺癌骨轉移相關，在此基礎上，通過提高miR-124的 表達可用于抑制乳腺癌骨轉移或者降低乳腺癌骨轉移的風險。
[0029] 本發明還提供了 miR-124在制備抑制破骨細胞分化的藥物中的應用。
[0030] 進一步，所述藥物包括有效劑量的miR-124促進劑。所述miR-124促進劑能夠促進 細胞內miR-124的表達、或能夠促進miR-124的活性、或能夠促進miR-124的有效作用時間、 或能夠促進miR-124的穩定性。所述miR-124促進劑的祀標不限于miR-124本身，還包括miR-124 的上下游 ，例如 :編碼 miR-124 的基因組序列， miR-124 靶基因 、調控 miR-124 的蛋白或者 基因。
[0031]進一步，miR-124促進劑包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表達載體。
[0032] 所述用于寡核苷酸表達的載體包括病毒載體、真核載體。
[0033] 病毒載體可以是任何適當的載體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。
[0034] 真核表達載體可以是任何適當的表達載體，包括但不限于pCMV-Myc表達載體、 pcDNA3.0表達載體、pcDNA3.1表達載體、pEGFP表達載體、pEF-Bos表達載體、pTe t表達載體、 pTRE表達載體、或者在公知表達載體的基礎上經改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0035] 優選地，所述miR-124促進劑是miR-124本身或者分別攜帶有miR-124的表達載體。
[0036] 本發明的抑制乳腺癌骨轉移的藥物還包含藥物學上可以接受的載體，所述載體包 括但不限于:稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧 劑、透皮吸收劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。
[0037] 所述藥物可以制成包括但不限于顯微注射劑、適于轉染的劑型、注射液、片劑、粉 劑、粒劑、膠囊劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。
[0038] 所述藥物可以單獨施用;或者與其他能夠抑制肺腺癌轉移的藥物進行組合施用。
[0039] 所述藥物可以離體施用：將miR-124的表達載體在體外導入或轉染人體自身或異 體細胞(或異種細胞），經體外細胞擴增后，輸回人體。
[0040] 所述藥物可以體內施用:將miR-124的表達載體直接導入體內。這種載體可以是病 毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。
[0041] 所述的受試者可以是人類或者其他哺乳動物。更具體地，受試者是器官、組織、細 胞。
[0042] 本發明使用的"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或 動物所接受的量。本發明所述的miR-124的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重 程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例 如通過臨床試驗）。所述的因素包括但不限于:所述miRNA促進劑的藥代動力學參數例如生 物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀 況、給藥的途徑等。
[0043] 分析miRNA表達譜的方法包括但不限于以下幾種：反轉錄聚合酶鏈式反應方法 (RT-PCR)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應方法(Real-time PCR)、Northern印跡雜交方法 (Northern blotting)、核糖核酸酶保護分析方法(RNase protection assay)、Solexa測序 技術（Sol exa sequencingtechno logy)和生物芯片。
[0044] 本發明優點在于：
[0045] 本發明檢測miR-124在不同骨轉移能力乳腺癌細胞及小鼠乳腺癌骨轉移組織中的 表達，初步明確它與乳腺癌骨轉移的關系，并進一步通過外源性上調或抑制腫瘤細胞中 miR-124表達，觀察其對成骨細胞和破骨細胞的作用，進一步明確miR-124通過調控乳腺癌 細胞和骨微環境之間的相互作用而抑制乳腺癌骨轉移。
【附圖說明】
[0046] 附圖1為Real-time PCR檢測小鼠乳腺癌正常組織(Normal)和不同乳腺癌細胞株 中miR-124表達水平。乳腺癌細胞株vs Normal :*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，student t text。
[0047] 附圖2為Real-time PCR檢測母代MDA-MB-231細胞(parental cell)和小鼠乳腺癌 骨轉移組織（bone metastasis tissues，BM tissues)中miR-124表達水。（η = 6，*ρ〈0·05， Mann Whitney test) 〇
[0048]附圖3為原位雜交法檢測乳腺癌患者原發癌組織(primary lesion)、相應的癌旁 組織(normal breast)和骨轉移組織標本(bone metastasis)中miR-124表達水平。
[0049]附圖4為20例乳腺癌骨轉移患者骨轉移灶中miR-124表達和患者的無骨轉移生存 期進行相關性分析，結果顯示二者呈顯著正相關&2 = 0.4769，？ = 0.0007，線性回歸）。
[0050] 附圖5為BMM細胞經不同處理后的腫瘤細胞的condition medium培養后TRAP染色 顯示破骨細胞分化情況。（A)顯微鏡下代表性TRAP陽性細胞圖片；（B)統計分析結果。 0.001,student t test。
[0051 ] 附圖6為MDA-MB-231細胞轉染miR-124inhibitor和inhibitor NC后收集各組上清 培養BMM細胞的TRAP染色結果。（A)顯微鏡下代表性TRAP陽性細胞圖片；（B)統計分析結 果。林*卩〈0.001，81：11(16111：1：七681：〇
[0052] 附圖7為乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞轉染NC和miR-124mimic或NC inhibitor和 miR-124inhibitor后收取上清培養3T3E1細胞后，Real-time PCR法檢測3T3E1細胞中0PG和 RANKL表達（A)以及0PG/RAML比值變化（B)。*卩〈0 · 05，**p〈0 · 01，***p〈0 · 001，student t test 〇
[0053] 附圖 8為3T3E1 細胞分別和轉染 NC(0C+NC)或 miR-124mimic(0C+miR-124mimic)的 MDA-MB-231細胞共培養，收取各組上清培養RAW264.7，Real-time PCR法檢測RAW264.7細胞 中 TRAP、c_Src、NFATcl 和 c-fos 表達。**p〈0 · 01，***p〈0 · 001。
[0054] 附圖9為構建psiCHECKj-ILin'-UTR結合位點突變熒光素酶報告基因質粒流程 圖。
[0055] 附圖10為hsa-miR-124在ILIU'-UTR區的結合位點。
[0056]附圖11顯示多個物種的IL113~UTR上均含有相同的miR-124的結合位點。
[0057] 附圖12顯示體外上調miR-124可下調MDA-MB-231細胞中IL11表達。其中A為Realtime PCR結果， B 為Wes tern blot結果。miR-124抑制 IL1 lmRNA(A) 和蛋白 （B) 表達。 **p〈 0.01ο
[0058] 附圖13顯示體外抑制miR-124作用可促進MDA-MB-231中IL11表達。其中A為Real-time PCR結果，B為Western blot結果。miR_124inhibitor促進ILllmRNA(A)和蛋白（B)表 達。***ρ〈0·001〇
[0059] 附圖14為miR-124mimic對野生型(WT)和結合位點突變型(MUT) IL113' -UTR報告基 因質粒熒光素酶活性的作用。***Ρ〈〇.〇〇1。
[0060] 附圖15為正常乳腺組織和乳腺癌細胞株中miR-124和IL11表達相關性。p = 0.048。
[0061 ] 附圖16為乳腺癌骨轉移模型骨轉移灶組織和母代MDA-MB-231細胞中miR-124和 1111表達相關性<^ = 0.01。
[0062]附圖17為免疫組化法檢測乳腺癌患者原發癌組織(primary lesion)、癌旁正常組 織(normal breast)和骨轉移組織標本(bone metastasis)中IL11的表達。
[0063] 附圖18為人乳腺癌骨轉移標本中miR-124和IL11表達相關性。p = 0.0023。
【具體實施方式】
[0064]下面結合【具體實施方式】，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。
[0065]實施例lmiR-124在乳腺癌骨轉移中的作用 [0066] -、材料
[0067](一）細胞
[0068] 人乳腺癌細胞株 MDA-MB-231、Hs578t、BT549、BT474、MDA-MB-436、MDA-MB-468、 MCF7、T47D細胞均購自武漢博士德生物技術有限公司。小鼠巨噬細胞RAW264.7以及小鼠成 骨細胞前體細胞3T3E1由華東師范大學生物工程學院李珍惜博士后贈與。其中MDA-MB-231、 Hs578t、BT549、BT474、MDA-MB-436、MDA-MB-468、RAW264·7和3T3El細胞培養條件為含有 10 %胎牛血清的DMEM。MCF7和T47D細胞培養條件為含有10 %胎牛血清的1640培養液。
[0069] (二)動物
[0070] 實驗用雌性BALB/c小鼠購自第二軍醫大學實驗動物中心，清潔級。用于分離正常 小鼠乳腺組織和構建小鼠骨轉移模型。
[0071] (三)臨床標本
[0072] 實驗所用5例乳腺癌原發癌組織、癌旁組織和骨轉移組織為在本院進行原發癌切 除術及骨轉移癌切除術患者的乙醛固定石蠟包埋蠟塊。實驗所用的20例人乳腺癌骨轉移標 本取自本科室2014年進行乳腺癌骨轉移切除術的患者。納入標準為：既往已明確診斷乳腺 癌，并非以骨轉移為首發癥狀，手術前尚未接受骨調節藥物(如唑來膦酸)治療的患者。
[0073] 留取骨轉移標本過程:手術切除病灶組織后，立即選取含有少量骨質的典型溶骨 性破壞標本，無菌生理鹽水沖洗后無菌紗布吸干殘留水分，將標本置于液氮中速凍后保存 于-80°C冰箱保存。
[0074] 已向以上涉及的患者本人或委托人告知研究內容并取得知情同意。
[0075] (四）引物設計
[0076] 引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0077]
[0078]
[0079] 二、方法
[0080] (一）小鼠正常乳腺組織分離
[0081] 操作前手術器械進行高壓蒸汽滅菌。操作時將8-10周的雌性BALB/c小鼠進行腹部 皮膚剃毛，然后行頸椎脫白法處死并將小鼠四肢固定于鼠板上，碘伏消毒后沿腹部中線劍 突下切開，腹中線剪開皮膚，向兩側剝離，用大頭釘固定剝離的皮膚，用小剪子和鑷子對第 四乳腺進行剝離。
[0082](二)小鼠乳腺癌骨轉移模型的建立
[0083] 將熒光素酶標記的MDA-MB-231細胞用PBS重懸，使其達到1χ105/μ1的濃度。將重懸 后的腫瘤細胞直接注射入4-5周齡的BALB/c nu/nu小鼠的左心室，每只小鼠100μ1的腫瘤細 胞混懸液。每周用活體成像儀觀察小鼠在體熒光信號，約28周后可從活體成像儀上觀察到 骨轉移灶的形成。屆時處死小鼠，根據活體成像儀顯示的熒光信號位置留取骨轉移組織標 本，液氮速凍后保存于深低溫冰箱。
[0084](三）RNA 抽提
[0085] (1)抽提細胞RNA:吸去培養基，PBS洗滌2遍，每個小盤（35mm培養皿）加入lml Trizol，靜置5分鐘，將Trizol轉移至EP管，吹打混勻。抽提組織RNA:提前用DEPC水處理研 缽，綠豆大小組織在充滿液氮的研缽中研磨成粉，將組織粉末轉移至EP管，直接加入lml Trizol，震蕩混勾。
[0086] (2)在以上含有Trizol處理的細胞或組織中加入200μ1氯仿，渦旋混勻，室溫下放 置5分鐘。
[0087] (3)以 12000g，4°C，離心 15 分鐘。
[0088] (4)取無色上清（約500μ1)(注意不要觸及中間蛋白層和下面的Trizol層）至新的 EP管，加入500μ1異丙醇后上下顛倒混勻，室溫放置5分鐘。
[0089] (5)以12000g，4°C，離心10分鐘，對光觀察管壁可見白色沉淀附著。
[0090] (6)小心吸去上清，留下沉淀，加入DEPC水配置的75%乙醇lml。
[0091] (7)以7500g，4°C，離心5分鐘。棄上清，加入40ylDEPC水溶解RNA沉淀。
[0092] (8)測定RNA濃度后儲存于_80°C。
[0093] (四）Real-time PCR
[0094] 1.逆轉錄細胞及組織cDNA
[0095] 用于檢測mRNA表達的cDNA用TaKaRa逆轉錄試劑盒(DRR036A)進行逆轉錄。反應體 系如下：
[0096]
[0097] 反應條件:37 °C 15min，85°C 5sec，降溫至4°C后-20°C保存備用。
[0098] 用于檢測miRNA表達的cDNA則用莖環法逆轉錄，反應體系如下：
[0099]
[0100]反應條件同上，逆轉錄產物于_20°C保存備用。
[0101] 2.Real-time PCR
[0102] 使用TaKaRa SYBRPremix Ex Taq試劑盒(DRR420A)，反應體系如下：
[0103]
[0104] 反應條件:95°〇30，（951€58,601€208)\40個循環，72°(：101^11，檢測溶解曲線。 [0105](五)原位雜交
[0106] 1、探針制備：m i R - 1 2 4鎖核苷酸探針序列（m i R - 1 2 4 p r 〇 b e ): GCACAAGUGUCGCCUGGAACUA 〇
[0107] 2、試劑盒：microRNAISH Optimi-zation Kit(Exiqon, Vedbaek,Denmark) 〇
[0108] 3、實驗步驟:用二甲苯對乙醇固定石蠟包埋的組織切片進行脫蠟，脫蠟后PBS洗滌 3次，用15mg/mL的蛋白酶K(proteinase K)于37°C孵育8min以增加組織通透性，梯度酒精脫 水后切片加入40nmol/L miR-124pr〇be 50°C孵育120min進行雜交反應，反應結束后依次用 加熱至50 °C的5 X檸檬酸鈉、1 X檸檬酸鈉和0.2 X檸檬酸鈉各洗20min，滴加抗地高辛-抗血 清堿性磷酸酶復合物4°C孵育過夜，PBS洗滌4次后滴加顯色液，4°C避光孵育過夜，將玻片放 在TE溶液中20min以終止反應。依次過梯度酒精、二甲苯，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察 結果。
[0109] (六)miRNC mimic或inhibitor轉染
[0110] 轉染前18小時將MDA-MB-231細胞消化并分到6孔板，每個孔大約40%融合度。取4 個EP管，每管加入120μ1轉染buffer(廣州銳博生物技術有限公司，C10511-05)，再加入 miRNA mimic和inhibitor(mimic NC δμΚηι?R-l245μΚ inhibitor NC 10yl、miR-124inhibitor 10μ1)最后每個EP管各加入12μ1 riboFECT? CP轉染試劑(銳博公司），吹打 混勻，室溫靜置孵育15分鐘后，均勻滴入6孔板中。轉染24小時候更換新鮮的含10%胎牛血 清的DMEM培養液。轉染48小時后收集上清以備下一步實驗。
[0111] (七)BMM細胞分離與培養
[0112] 骨髓來源的巨噬細胞(BMMs)被視為破骨前體細胞，它可在細胞因子刺激下分化為 多核破骨細胞。本部分內容擬從小股骨分離BMM，具體流程如下：
[0113] 1、選取6周齡左右的BALB/c小鼠，處死后放入75%酒精浸泡，10分鐘后將小鼠置于 無菌培養皿，用無菌手術器械剔除下肢所有毛皮及肌肉組織，暴露雙側股骨，盡力刮除股骨 上殘余組織，盡量使游離下來的股骨保持完整；
[0114] 2、將分離好的股骨先后浸泡于75%的酒精和PBS溶液中，各5分鐘；
[0115] 3、配制培養基：α-MEM 9ml、胎牛血清lml、青霉素和鏈霉素混合液100μ1、Μ-CSF5nmol；
[0116] 4、將1個直徑80μηι的濾網置于10mm無菌培養皿，無菌剪去除股骨兩端，一手用無菌 鑷子固定小鼠股骨，另一手持lml注射器吸取已配好的培養基從股骨一端向另一端沖洗，將 骨髓腔中的內容物沖洗至濾網中，反復數次；
[0117] 5、移除濾網，將剛才操作過的培養皿蓋好蓋子，放入37°C，5%二氧化碳的培養箱 培養過夜；
[0118] 6、取過夜后的上清放入15ml離心管中，900rpm，室溫離心5分鐘，棄上清；
[0119] 7、再次準備培養基:含10%胎牛血清的α-ΜΕΜ培養基加入20nmol/ml的M-CSF，將離 心后的細胞均勻混懸于準備好的培養基中，接種于24孔板中，每孔500μ1，培養48h后可以繼 續實驗。
[0120] (八)TRAP染色
[0121 ]抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色在本 部分用于檢測BMM向破骨細胞分化的程度。TRAP染色試劑盒購自美國西格瑪奧德里奇 (Sigma-Aldrich)公司，具體操作步驟如下：
[0122] 1、取出含有BMM細胞的24孔板，吸去每孔的培養基，PBS洗滌3次；
[0123] 2、取出凍存的固定液，融化至室溫，每孔加入固定液0.5ml，靜置30s;
[0124] 3、棄去固定液，去離子水洗滌3次；
[0125] 4、配置染色液:0.1ml快速石榴紅GBC底液+0.5ml亞硝酸鈉溶液，溫和混勻，避光靜 置2min，再加入去離子水9ml+萘酸AS-BI phosphqte 0· lml+醋酸鹽溶液0.4ml+酒石酸鹽溶 液0.21111，混勻后加熱至37°(：;
[0126] 5、棄去去離子水，每孔加入0.5ml染色液，37 °C避光孵育lh;
[0127] 6、棄去染色液，去離子水洗滌3次，蘇木紫復染2min;
[0128] 7、自來水沖洗數次，瞭干，顯微鏡下觀察。
[0129] 三、統計學處理
[0130]所有實驗至少重復3次。數據以X土SD，即均數土標準差表示，用SPSS17.0統計軟件 進行統計分析。t檢驗用于方差齊性的兩組比較，非參數檢驗用于方差非齊性的兩組比較。 相關性分析采用Pearson相關性分析。分別計算P值，P〈0.05為具有顯著性差異。
[0131] 四、結果
[0132] l.miR-124在乳腺癌細胞中表達下降
[0133] 分離正常大鼠乳腺組織和培養不同惡性程度的乳腺癌細胞，抽提組織和細胞RNA， Real-time PCR結果顯示乳腺癌細胞中miR-124表達較正常小鼠乳腺組織顯著下調(乳腺癌 細胞株與正常乳腺組織相比P均小于0.05)，且骨轉移性較高的三陰乳腺癌細胞株BT549、 MDA436、MDA468、MDA-MB-231和Hs578t細胞中表達較轉移性較低的細胞株MCF7、T47D和 BT474 顯著減少(Ρ = 0·007)(圖）。
[0134] 2.小鼠乳腺癌骨轉移組織中miR-124表達下調
[0135] 小鼠左心室注射MDA-MB-231細胞制備乳腺癌骨轉移模型。Real-time PCR結果顯 示與母代細胞相比，小鼠乳腺癌骨轉移組織中miR-124的表達顯著下調（圖2)。
[0136] 3.人乳腺癌骨轉移組織中miR-124表達下調，且表達低的患者無骨轉移生存期短
[0137] 收集乳腺癌患者原發癌組織、相應的癌旁組織和骨轉移組織標本，原位雜交法檢 測miR-124表達，結果顯示與癌旁組織相比，患者乳腺癌組織中miR-124表達明顯減少，而骨 轉移組織中miR-124表達較乳腺癌組織進一步減少（圖3) deal-time PCR法檢測20例人乳 腺癌骨轉移標本中miR-124表達，分析其表達與患者無骨轉移生存期(Bone-metastasis- free survival，BM_free survival)的相關性，結果顯示miR-124表達與患者無骨轉移生存 期呈顯著正相關(r2 = 0 ·4769，ρ = 0.0007)，即miR-124表達高者BM-free survival較長，而 miR-124表達低者BM-free survival較短（圖4)。以上結果提示miR-124表達下調是乳腺癌 患者發生骨轉移過程中的重要事件，并有可能預測乳腺癌患者發生骨轉移時間。
[0138] 4.體外調控乳腺癌細胞中miR-124表達可促進破骨細胞分化
[0139] 4.1乳腺癌細胞中的miR-124可抑制BMM細胞向破骨細胞分化
[0140] MDA-MB-231 細胞轉染miR-124mimic和NC或miR-124inhibitor和inhibitor NC后 收集各組上清培養BMM細胞，TRAP染色結果顯示miR-124mimic組破骨細胞分化較NC組顯著 減少，而miR_124inhibitor組破骨細胞分化較inhibitor NC組顯著增加（圖5、圖6)。
[0141] 4.2上調乳腺癌細胞中11^1?-124表達可增加成骨細胞0?6/1^疆1^比值，而抑制1^1?-124作用降低0PG/RANKL比值
[0142] 0PG是成骨細胞成熟過程中分泌并抑制破骨細胞分化的蛋白，而RANKL是成骨細胞 分泌并促進破骨細胞分化的蛋白，故0PG/RANKL比值增加表示成骨細胞抑制破骨細胞分化 的能力較強，而該比值減少表明成骨細胞促進破骨細胞分化的能力較強。我們將miR-124mimic和NC轉染至MDA-MB-231細胞后收集condition medium培養成骨細胞前體細胞 3T3E1細胞，Real-time PCR結果顯示miR-124mimic上清組3T3E1細胞中0PG與RANKL比值增 加。反之，MDA-MB-231細胞轉染miR-124inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養3T3E1細 胞，Real-time PCR結果顯示miR-124inhibitor上清組3T3E1細胞中0PG與RANKL比值降低 (圖 7)。
[0143] 4.3上調乳腺癌細胞miR-124表達抑制成骨細胞及促進破骨細胞分化的能力
[0144] MDA-MB-231細胞轉染miR-124mimic或NC后分別和3T3E1細胞共培養，收上清培養 RAW264.7細胞，Real-time PCR結果顯示miR-124mimic組上清培養的RAW264.7細胞中與破 骨細胞分化相關的指標TRAP、c-Src、NFATcl和c-fos表達顯著下調。
[0145] 五、討論
[0146] 本發明通過原位雜交法檢測miR-124在人乳腺癌和癌旁組織中表達，結果提示 miR-124在乳腺癌標本中表達下調。同時，本發明首次檢測miR-124在乳腺癌骨轉移組織中 的表達，并發現miR-124在乳腺癌骨轉移組織中較乳腺癌組織表達進一步下調，且其表達與 患者無骨轉移生存期相關，即miR-124表達高者，從原發乳腺癌到發生骨轉移的時間較長， 反之，miR-124表達低者，從原發癌到骨轉移時間較短，提示miR-124可以作為判斷乳腺癌患 者發生骨轉移時間的重要指標。同時也進一步提示miR-124表達下調是乳腺癌骨轉移過程 中的重要事件。
[0147] 本發明首次關注乳腺癌細胞中的miR-124對骨微環境的作用，并通過gain-of-f unction和loss-of-f unction實驗證實體外調控miR-124表達可直接抑制破骨細胞分化或 抑制成骨細胞誘導的破骨細胞分化。乳腺癌細胞要到達骨骼并形成轉移灶需經過增殖、迀 移、侵襲、粘附等環節到達骨微環境，并和骨微環境中的成骨細胞、破骨細胞等細胞發生相 互作用。因此本部分研究內容為miR-124在乳腺癌疾病發展過程中的作用填補了重要一環， 即乳腺癌患者癌組織中miR-124因甲基化等原因表達下調后，腫瘤細胞大量增殖，發生上皮 間質轉型，迀移和侵襲能力增強，到達骨微環境后又促進了破骨細胞分化導致溶骨性骨轉 移灶的形成。綜上所述，miR-124不僅可能成為判斷乳腺癌患者預后的重要指標，還可能成 為乳腺癌治療的新靶點。
[0148] 實施例2miR_124抑制乳腺癌骨轉移的分子機制
[0149] 一、材料
[0150] ( - )細胞株
[0151] 人胚胎腎臟(HEK) 293細胞株，由華東師范大學生物工程學院提供。
[0152] (二）引物設計
[0153] 所有引物均是針對人基因設計，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0154]
[0155] 二、實驗方法
[0156] (一）Real_time PCR
[0157] 參照實施例部分相關實驗。
[0158] (二）Western blot
[0159] 主要用于檢測乳腺癌細胞中IL11蛋白表達。
[0160] 1、電泳:取適量RIPA裂解液裂解細胞，測定蛋白濃度后，配置10 %的PAGE膠，各組 分分別取50yg總蛋白上樣電泳。根據marker電泳情況判斷目的蛋白已充分分離后停止電 泳。
[0161] 2、轉膜(濕轉法）：取出凝膠，根據marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，準備好與 PAGE膠大小相同的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數秒后和濾紙一同浸泡于電緩沖液 中。按照黑色版-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色版依次放好，將黑色板夾緊 后放入轉膜儀內，黑色板的一面對照黑色負極。轉膜條件:200mA，70min。
[0162] 3、封閉：用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h。
[0163] 4、一抗：用封閉液稀釋IL11一抗（Santa cruz Biotechnology，USA)(1:500稀釋）， 將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4°C孵育過夜。
[0164] 5、二抗:TBST充分洗滌PVDF膜5次，5min/次。用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗 1:50000稀釋，將膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2h。
[0165] 6、顯色曝光:TBST充分洗滌PVDF膜5次，5min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵 育5min。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入 顯影液顯影、定影液定影。
[0166] (三)構建psiCHECKULllS' -UTR熒光素酶報告基因質粒
[0167] (l)PCR 獲取 IL1131TR 片段
[0168]
[0169]反應條件：（98°(：1〇8+68°(：1.5111丨11)\30個循環 [0170 ] PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定其為156 2bp的單一條帶。
[0171] (2)酶切
[0172] 對上一步的PCR產物進行酶切：
[0173]
[0174] 反應條件:37°C孵育2h。
[0175] 對psicheck2質粒進行酶切：
[0176]
[0177] 反應條件:37°C孵育2h后加入去磷酸化酶ΙμL孵育lh。
[0178] (3)DNA片段鈍化:購買Takara公司DNA片段純化試劑盒，按其說明書進行操作。純 化后取適量DNA進行電泳鑒定明確p Sicheck2質粒是否酶切完全。
[0179] (4)連接：將酶切后的片段質粒和骨架質粒進行連接（pMDs19-T Vector kit， Takara)
[0180]
[0181] 反應條件:16°C孵育過夜。
[0182] (5)轉化:按DH5a感受態細胞說明書進行。
[0183] (6)酶切鑒定
[0184] 轉化14小時后含氨芐霉素的瓊脂糖平板長出多個克隆，隨機挑取6個克隆，放入LB 培養基中震蕩過夜。14小時后用質粒抽提試劑盒抽提質粒。質粒定量后用Notl酶和Xhol酶 再次進行雙酶切，酶切產物進行電泳，選取陽性克隆送上海生工公司測序。保存好測序正確 的質粒備細胞學實驗用。
[0185] (四）構建psiCHECKULlU^UTR結合位點突變型熒光素酶報告基因質粒
[0186] 采用重疊延伸PCR法對IL113~UTR上miR-124結合位點進行突變，具體如下：
[0187] (1)進行2次PCR擴增出兩種DNA片段。第一次PCR使用的引物a為構建IL1W-UTR全 長報告基因質粒時使用的Forward引物，而引物b為將IL113~UTR上miR-124結合位點突變 設計的反向引物；第二次PCR使用的引物d為構建ILIH^UTR全長報告基因質粒時使用的 Reverse引物，而引物c為將IL113~UTRi:miR-l24結合位點突變設計的正向引物。
[0188]
[0189] 反應條件：（98。(：1〇8+68。(：1.5111丨11)\30個循環
[0190] PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定為大小正確的單一目的條帶。
[0191] 第三次PCR以前兩次PCR擴增出的DNA片段為模板進行再次PCR。
[0192]
[0193] 反應條件：（98°(：1〇8+68°(：1.5111丨11)\30個循環
[0194] PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定獲得單一目的條帶。
[0195] 第三次PCR的產物經Notl和Xhol雙酶切，并與雙酶切后的psicheck2質粒連接、轉 化、酶切鑒定及測序，具體方法與實施例1相同。實驗流程見圖9。
[0196] (五)檢測IL113~UTR報告基因質粒活性
[0197] (1)將HEK-293細胞分到24孔板（1 · 5 X 105/孔）。
[0198] (2)用lipofectamine 2000將NC和miR-124mimic與IL113Z-UTR報告基因質粒（野 生型和突變型）轉染至HEK-293細胞。分組如下：NC+IL113Y-UTR wild type、miR-124mimic+ IL113' -UTRwild typeJC+ILl]^ -UTR mutani^miR-l^dmimic+ILl]^ -UTRmutant。
[0199] (3)雙報告基因試劑盒(E2920，Promega，USA)檢測報告基因活性
[0200] 用胰酶消化細胞后將細胞收集至EP管。吹打混勻后吸取細胞懸液加入384孔板（15 μL/孔）。每孔加入15μ1 Dual-GLO I，吹打混勻。室溫避光孵育lOmin，酶標儀讀數后計算并 比較各組的熒光素酶數值。
[0201] (六)免疫組織化學
[0202] 利用免疫組織化學法檢測IL11。
[0203] 1、組織切片常規脫蠟至水。
[0204] 2、3 %過氧化氫室溫孵育1 Omin。蒸餾水洗3次。
[0205] 3、抗原修復:將蛋白酶K儲存液用稀釋液1::20稀釋配制工作也，滴于玻片上，濕盒 內37 °C孵育30min，PBS洗滌3次。
[0206] 4、用10%山羊血清室溫封閉30min，棄去多余液體。
[0207] 5、按1:100稀釋IL11抗體，滴于切片上，4°C孵育過夜。
[0208] 6、吸掉一抗，PBS洗滌3次，每次2min。
[0209] 7、滴加二抗，室溫孵育SOmiruPBS洗滌4次，每次5分鐘。
[0210] 8、顯色：滴加 DAB顯色液，室溫下顯微鏡下觀察組織切片，達到合適顯色程度時終 止反應。
[0211 ] 9、蘇木素復染。脫水，透明，封片，拍照觀察。
[0212] 三、統計學處理
[0213]數據以X土SD表示，用SPSS17.0進行統計分析。方差齊性的兩組比較采用t檢驗，方 差非齊性的兩組比較采用非參數檢驗，分析miR-124和IL11表達相關性采用Pearson相關性 分析。P〈0.05為具有顯著性差異。
[0214]四、結果
[0215] 1.IL11為miR-124的潛在靶基因
[0216]為明確miR-124抑制乳腺癌骨轉移的分子機制，我們利用TargetScan軟件預測其 靶基因，并從中挑選可能與腫瘤和骨微環境相關的miRNA，結果顯示白介素11 (Interleukin 11，IL11)的3' -UTR區含有miR-124的結合位點（圖10)，且該位點在多個物種中高度保守（圖 11)〇
[0217] 2.miR-124可負調控IL11的表達
[0218] 2.1體外上調miR-124可下調MDA-MB-231細胞中IL11表達
[0219] 我們將NC和miR-124mimic轉染至MDA-MB-231 細胞，Real-time PCR結果顯示miR-124mimic可顯著下調IL11 的mRNA水平（p〈0 · 01); Western blot結果顯不miR-124mimic使 IL11蛋白表達明顯減少（圖12)
[0220] 2.2體外抑制miR-124作用可促進MDA-MB-231中IL11表達
[0221] 為進一步明確miR-124對IL11的調控作用，我們將miR-124inhibitor和NC inhibitor轉染至MDA-MB-231，Real-time PCR結果顯不miR_124inhibitor可顯著上調IL11 的mRNA水平(p〈0.05);Western blot結果顯示miR_124inhibitor使IL11蛋白表達明顯增加 (圖 13)。
[0222] 3.雙報告基因實驗證實IL11是miR-124直接靶基因
[0223] 為進一步明確miR-124是否通過結合IL11的31UT而抑制其表達，我們構建了含有 miR-124結合位點的IL113~UT熒光素酶報告基因質粒psiCHECK2-ILll-3〇JTR(WT)。將野生 型報告基因質粒(WT)與miR-124mimic共轉染至HEK-293細胞。雙熒光素酶報告基因檢測結 果顯示miR-124mimic組熒光素酶活性較NC組下降54%(?〈0.001)。我們又構建了11^-124結 合位點突變的熒光素酶報告基因質粒psiCHECK2-ILll-3'UTR-mutant(MUT)報告基因質粒。 將其與miR_124mimic共轉染入細胞后，報告基因檢測結果顯示NC組合miR-124mimic組報告 基因活性無顯著差別（圖14)，證實miR-124可結合于IL11的3'-UTR區。
[0224] 4.乳腺癌細胞核骨轉移組織中miR-124和IL11表達呈負相關
[0225] (1)正常乳腺組織和乳腺癌細胞中IL11與miR-124的水平呈負相關
[0226] Real-time PCR法檢測正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細胞株BT549、MDA-MB_231、 Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474 中 IL11 的表達，相關性分析結果顯示 IL11與miR-124表達呈顯著負相關，￥ = 0.4497斤=0.048，線性回歸）（圖15)。
[0227] (2)小鼠乳腺癌骨轉移組織中IL11和miR-124表達呈負相關
[0228] Real-time PCR法檢測乳腺癌骨轉移模型骨轉移灶組織和母代MDA-MB-231細胞中 IL11表達，相關性分析結果顯示IL11與miR-124表達呈顯著負相關，r2 = 0.5011(P = 0.01， 線性回歸）（圖16)。
[0229] (3)人乳腺癌骨轉移組織中IL11和miR-124表達相關性
[0230] 免疫組化法檢測乳腺癌患者原發癌組織、癌旁組織和骨轉移組織標本中IL11的表 達，結果顯示與癌旁組織相比，人乳腺癌組織中IL11表達明顯增加，在骨轉移標本中表達進 一步增加(圖17)，提示IL11在乳腺癌發生發展過程中表達趨勢與miR-124相反。
[0231] (4)采用Real-time PCR法檢測20例人乳腺癌骨轉移標本（與實施例1相同）中 ILllmRNA表達，相關性分析結果顯示IL11的表達與miR-124表達呈顯著負相關，r2 = 0.4111 (卩=0.0023，線性回歸）（圖18)
[0232] 五、討論
[0233] 本實施例實驗通過軟件預測和報告基因實驗首次證實IL11是miR-124的靶基因。 miR-124可通過直接抑制破骨細胞分化或通過成骨細胞調控破骨細胞分化，以上作用與 IL11在骨代謝中的作用相吻合，表明IL11可能部分介導了乳腺癌細胞中的miR-124在骨轉 移溶骨性病變產生中的作用。我們進一步分析了 miR-124與IL11在乳腺癌細胞、小鼠乳腺癌 骨轉移組織以及人乳腺癌骨轉移組織中表達的相關性，結果顯示二者呈顯著負相關，進一 步提示了 miR-124在乳腺癌進展過程中通過調控IL11的表達參與了骨轉移的發生。綜上， miR-124這一重要的抑癌基因和IL11這一重要的促骨轉移細胞因子之間形成的新的相互作 用將為乳腺癌骨轉移的診斷和治療提供新的思路。
[0234] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 微小RNA在制備預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發生轉移的工具中的應 用，其特征在于，所述微小RNA為miR-124。2. -種預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發生轉移的芯片，其特征在于，所述 芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括 特異性地對應于權利要求1所述的微小RNA的部分或全部序列。3. -種預判乳腺癌骨轉移的風險、診斷乳腺癌是否發生轉移的試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒包括用于檢測受試者乳腺癌組織中權利要求1所述的微小RNA的表達水平的試劑， 與未發生骨轉移的乳腺癌組織中的權利要求1所述的微小RNA的表達水平進行比較，若乳腺 癌組織中權利要求1所述的微小RNA的表達水平顯著降低，則判斷該受試者的乳腺癌發生骨 轉移的風險高、或者已經發生轉移。4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包括針對權利要求1所述的微 小RNA的引物和/或探針。5. 權利要求1所述的微小RNA在制備預防和/或治療乳腺癌骨轉移的藥物中的應用。6. 權利要求1所述的微小RNA在制備抑制破骨細胞分化的藥物中的應用。7. 根據權利要求5-6所述的應用，其特征在于，所述藥物包含權利要求1所述微小RNA的 促進劑、藥學上可接受的載體。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述促進劑能夠促進權利要求1所述的微 小RNA的表達、或者能夠促進權利要求1所述的微小RNA的穩定性、或者能夠促進權利要求1 所述的微小RNA的活性、或者能夠促進權利要求1所述的微小RNA的有效作用時間。9. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述促進劑選自以下組：蛋白、寡核苷酸、 小分子化合物、寡核苷酸表達載體。10. 根據權利要求5-6所述的應用，其特征在于，所述miR-124靶向調控乳腺癌細胞中 ILll表達。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907886SQ201610529180
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】蔡維濼
【申請人】蔡維濼, 黃權