基于高分辨熔解曲線技術的結核分枝桿菌耐藥性基因突變檢測的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基于高分辨熔解曲線技術的結核分枝桿菌（TB）耐藥性基因突變檢測。具體而言，本發明涉及用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌（TB）耐藥性基因突變的PCR引物組。本發明還涉及包含PCR引物組的用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌（TB）耐藥性基因突變的試劑盒和微陣列。本發明還涉及PCR引物組在制備用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌（TB）耐藥性基因突變的試劑盒和微陣列中的用途。本發明還涉及使用PCR引物組檢測樣品中的結核分枝桿菌（TB）耐藥性基因突變的方法。
【專利說明】
基于高分辨熔解曲線技術的結核分枝桿菌耐藥性基因突變 檢測
技術領域
[0001 ]本發明涉及基于高分辨恪解曲線技術的結核分枝桿菌（oc i er i iMerCdasis，TB)耐藥性基因突變檢測。具體而言，本發明涉及用于基于高分辨熔解曲線 技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的PCR引物組。本發明還涉及包含PCR引物組的 用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的試劑盒和微陣列。 本發明還涉及PCR引物組在制備用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥 性基因突變的試劑盒和微陣列中的用途。本發明還涉及使用PCR引物組檢測樣品中的結核 分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的方法。
【背景技術】
[0002] 高分辨熔解曲線(high-resolution melt，HRM)分析技術是一種高效穩健的PCR技 術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔 解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態性-SNP分析。其主要原理是根據DNA序列的長度，GC 含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，其極高的溫度均一 性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個堿基差異的區分。HRM是利用了特定的染料可 以插入DNA雙鏈中的特性，通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結 合情況記錄高分辨率熔解曲線，從而對樣品進行檢測。如在SNP的檢測中，SNP位點由于不匹 配雙鏈DNA在升溫過程中會先解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強度與 時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與否等都會影響熔解曲線 的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。
[0003] 臨床上對結核分枝桿菌引起的肺結核常用的一線藥物包括異煙肼（INH)、利福平 (RFP)、鏈霉素（SM)等。異煙肼其作用機制是被結核分枝桿菌內過氧化氫酶-過氧化物酶激 活，作用于烯酰基載體蛋白還原酶，抑制分枝桿菌細胞壁生物合成而殺菌。katG基因是編碼 觸酶-過氧化物酶的編碼基因，其基因突變可導致過氧化氫酶-過氧化物酶活性下降甚至喪 失。katG基因突變約占異煙肼耐藥的50~70%<JnhA基因編碼還原型煙酰胺二核苷酸(NADH) 依賴的烯酰基還原酶，其基因突變約占異煙肼耐藥10~35%。
[0004] 利福平是一種廣譜抗菌藥，可與DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位結合，抑制RNA聚 合酶活性，進而抑制mRNA轉錄及蛋白合成起到抗菌作用。約95%的利福平耐藥菌都是由于編 碼RNA聚合酶β亞基(rpoB)基因發生突變，從而不再與利福平結合而產生耐藥性。rpoB基因 突變主要發生在507-533位編碼27個氨基酸密碼子的81bp的區域內。
[0005] 現已有多種生物學檢測技術應用于結核分枝桿菌耐藥檢測，如噬菌體生物擴增 法、常規藥敏試驗、DNA測序、基因芯片、PCR-限制性片斷長度多態性分析、快速培養儀檢測 系統等。
[0006] 噬菌體生物擴增法和常規藥敏試驗操作繁瑣耗時長不易標準化。基因芯片樣本的 制備和標記較繁瑣，儀器昂貴，檢測成本高。PCR-限制性片斷長度多態性分析只能分析已知 序列特異位點的基因突變。快速培養儀檢測系統儀器和試劑依賴進口費用高昂。同時一些 非測序方式需要依賴酶切或聚類的方式判讀患者的基因突變情況，存在較大的分型錯誤的 幾率。直接測序雖然準確度高，但測序反應產生的DNA片段需要經過毛細管電泳分離，其后 由檢測系統檢測熒光信號，耗時較長且檢測成本較高。
[0007] HRM技術操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現了真正的閉管操作。因此，HRM 技術在結核分枝桿菌耐藥基因（：[111^、1?^6、印08)檢測的應用與推廣將具有極大價值與潛 力。
【發明內容】
[0008] 本發明一方面涉及用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性 基因突變的PCR引物組，所述PCR引物組包括至少一種選自以下的引物組： (1) 引物組1，其包含具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID N0: 2所示的核苷酸序列的引物； (2) 引物組2,其包含具有SEQ ID N0: 3所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID N0: 4所示的核苷酸序列的引物;和 (3) 引物組3,其包含具有SEQ ID N0: 5所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID N0: 6所示的核苷酸序列的引物。
[0009] 在一個實施方案中，所述PCR引物組包括引物組1，并任選包含至少一種選自引物 組2和引物組3的引物組。在另一個實施方案中，所述PCR引物組包括引物組2,并任選包含至 少一種選自引物組1和引物組3的引物組。在又一個實施方案中，所述PCR引物組包括引物組 3,并任選包含至少一種選自引物組1和引物組2的引物組。在又另一實施方案中，所述PCR引 物組包括引物組1、引物組2和引物組3。
[0010] 本發明另一方面涉及用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基 因突變的試劑盒或微陣列，其包含本發明的PCR引物組。本發明又一方面涉及本發明的PCR 引物組在制備用于基于高分辨熔解曲線技術檢測樣品中的結核分枝桿菌耐藥性基因突變 的試劑盒或微陣列中的用途。
[0011] 在一個實施方案中，所述樣品為生物樣品，優選所述樣品為體液樣品或組織樣品， 和更優選所述樣品選自活組織檢查樣品、細胞培養物、經固化處理的樣品（如石蠟包埋樣 品）、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁和腹膜 液。
[0012] 本發明又一方面涉及基于高分辨熔解曲線技術檢測樣品中結核分枝桿菌耐藥性 基因突變的方法，所述方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的核酸， (2) 使用本發明的引物組進行PCR擴增，和 (3) 對步驟(2)的PCR產物進行高分辨熔解曲線分析； 其中所述方法不用于診斷目的，例如可用于檢測體外培養中的結核分枝桿菌是否變 異，可用于檢測環境來源的結核分枝桿菌樣品是否具有耐藥性。。
[0013] 在一個實施方案中，所述樣品為生物樣品，優選所述樣品為體液樣品或組織樣品， 和更優選所述樣品選自活組織檢查樣品、細胞培養物、經固化處理的樣品（如石蠟包埋樣 品）、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁和腹膜 液。在另一個實施方案中，高分辨熔解曲線分析的條件為:95°C 2分鐘，以0.1°C/步從83°C 掃描至96 °C或從82 °C掃描至93 °C或從80 °C掃描至94 °C。在一個實施方案中，在一個實施方 案中，PCR擴增可為定性或定量PCR擴增。在另一個實施方案中，PCR擴增為定量PCR擴增。在 又一個實施方案中，PCR擴增為實時熒光定量PCR擴增。
【附圖說明】
[0014] 圖1為使用本發明PCR引物組（引物組3，SEQ ID N0: 5和6)對rpoB基因進行擴增后 應用高分辨熔解曲線分析對該基因的突變進行檢測的結果截圖。
[0015] 圖2為使用本發明PCR引物組（引物組2，SEQ ID N0: 3和4)對katG基因進行擴增后 應用高分辨熔解曲線分析對該基因的突變進行檢測的結果截圖。
[0016] 圖3為使用本發明PCR引物組（引物組1，SEQ ID NO: 1和2)對inhA基因進行擴增后 應用高分辨熔解曲線分析對該基因的突變進行檢測的結果截圖。
[0017]圖4為使用不同PCR引物組對rpoB基因進行擴增的截圖。A:與本發明PCR引物組3具 有相同的反向引物但在正向引物上具有小部分不同堿基的PCR引物組(SEQ ID N0: 8和6)， 結果顯示NTC有嚴重非特異性擴增（圖4A灰色曲線）;B:本發明PCR引物組（引物組3，SEQ ID NO: 5和6)，結果顯示不存在非特異性擴增。
【具體實施方式】
[0018] 參考用于說明的示例應用在下文中描述本發明的數個方面。應當理解的是，陳述 許多具體細節、關系和方法來提供對本發明的充分理解。然而，在相關領域的普通技術人員 將容易地認識到，可在不含一個或多個具體細節的情況下實施本發明或者可用其他方法來 實施本發明。
[0019] 本發明目的在于解決現有技術中對結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的檢測的 缺點，例如較大的分型錯誤、耗時較長或檢測成本較高。本發明通過使用本發明的PCR引物 組的高分辨熔解曲線技術而解決了上述問題。
[0020] 使用本發明的PCR引物組的高分辨熔解曲線技術具有以下優點： 1) 儀器及試劑通過系統優化，可達到最優的檢測效果，且易標準化； 2) 檢測結果自動由軟件給出，避免結果判斷主觀性； 3) 操作過程簡便且省時，檢測全程120分鐘，其中儀器自動運行時間100分鐘，手工操作 時間20分鐘;和 4) 不存在非特異性擴增且檢測準確性高。
[0021] 除非另有說明，否則本文所用的所有科技術語具有本發明所屬領域普通技術人員 通常理解的含義。在細胞和分子生物學中的普通術語的定義可以參見：余龍等譯的基因 VIII，標準書號：ISBN: 978-7-03-014597-0,科學出版社出版(2005);張瑾峰等譯的細胞與 分子生物學，中信出版社出版（2004)，ISBN: 978-7-50-860075-8;和王鏡巖等編的生物化 學，高等教育出版社出版（2002)，ISBN:978-7-04-011088-3; Kendrew，J.等人（編）， The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版(1994), ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A.(編），Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版（1995)，ISBN 1-56081-5698。雖然在實施本發明時可采用類似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和 材料，但是本文描述了具體的材料和方法。
[0022] 樣品 本文所用術語"樣品"包括含有核酸分子的任何樣品。樣品可來源于生物來源（"生物樣 品"），例如組織(例如活組織檢查樣品）、提取物或包括結核分枝桿菌的培養物和生物或生 理流體，例如經固化處理的樣品（如石蠟包埋樣品）、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、 痰、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁、腹膜液等。獲自來源的樣品或在預處理以改進樣 品特征(例如從血液制備血漿、稀釋痰液等)后的樣品可直接使用。在本發明的某些方面，樣 品是痰或肺泡灌洗液。
[0023] 可按照本發明進行分析和/或使用的樣品包括臨床來源的多核苷酸，例如DNA或 RNA〇
[0024] 從樣品中提取核酸的方法是本領域眾所周知的，可用例如苯酚和氯仿進行DNA提 取，或者使用市售DNA提取試劑進行提取。例如，可使用柱試劑盒(例如GENERATION (注冊商 標）Capture Column Kit Gentra)進行提取。
[0025] 應該理解的是，核酸可通過本領域眾常規的純化方法來純化，例如使用PrepSEQ TM 試劑盒(來自Applied Biosystems)和美國專利號5,234,809中的方法等等。
[0026] 耐藥性又稱抗藥性，系指微生物、寄生蟲以及腫瘤細胞對于化療藥物作用的耐受 性。在本發明中，耐藥性是指結核分枝桿菌的耐藥性，特別是指結核分枝桿菌對臨床上對結 核分枝桿菌引起的肺結核常用的一線藥物(包括異煙肼（INH)、利福平(RFP)、鏈霉素（SM) 等)的耐藥性。耐藥性基因突變在本發明的一些實施方案中是指結核分枝桿菌的基因 inhA、 katG和/或rpoB的突變。
[0027] 引物 本文所用的"引物"通常指與靶序列互補和退火的線性寡核苷酸。引物長度的下限按雜 交能力而定，因為非常短的引物(例如小于5個核苷酸)在大多數雜交條件下不形成熱力學 穩定的雙鏈體。引物長度通常在8-50個核苷酸內變化。在某些實施方案中，引物介于大約 15-25個核苷酸之間。本文使用的術語"正向引物"是指與靶DNA的一條特定鏈退火的寡核苷 酸。本文使用的術語"反向引物"是指與靶DNA的相反鏈退火的寡核苷酸。總之，正向引物和 反向引物通常以類似于PCR引物的方式定向在靶DNA序列上，使得其3'末端比其5'末端更接 近靶序列。天然存在的核苷酸(尤其是鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文稱為"G"、 "A"、"C"和"T"）以及核苷酸類似物，都可用于本發明的引物。本文使用的術語"PCR引物"是 指用于起始對核酸進行的PCR反應的寡核苷酸引物。
[0028]本文使用的"PCR產物"是指自核酸模板，通過核酸PCR擴增而產生的擴增的核酸。
[0029] 本文使用的術語"核苷酸類似物"指與天然存在的核苷酸在結構上相似的化合物。 核苷酸類似物可以具有改變的磷酸骨架、糖部分、核堿基或其組合。通常具有改變的核堿基 的核苷酸類似物尤其賦予不同的堿基配對和堿基堆積特性。具有改變的磷酸-糖骨架的核 苷酸類似物(例如肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA))通常尤其改變鏈特性，例如二級結構形成。
[0030] 用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的PCR引物 組及靶基因的實例如表1。
[0031] 表1本發明所用的引物組及相應的靶基因
本發明的PCR引物的核苷酸序列還包括其修飾形式，只要所述引物的擴增或HRM分析效 果不受到明顯的影響即可。所述修飾可以為例如在核苷酸序列中或兩端添加一個或多個核 苷酸殘基、在核苷酸序列中缺失一個或多個核苷酸殘基、或者將序列中的一個或多個核苷 酸殘基替換成另外的核苷酸殘基，例如將A替換成T，將C替換成G等。本領域技術人員清楚， 所述修飾形式的引物也涵蓋在本發明之內、特別是權利要求的保護范圍之內。在一個實施 方案中，PCR引物的核苷酸序列的修飾形式為如CN103270174A中所公開的化學增強型引物。
[0032] 可以使用例如通用DNA合成儀(例如由Applied Biosystems制造的394型），經化學 方法合成本發明引物中的各個核苷酸。還可采用本領域眾所周知的任何其它方法來合成寡 核苷酸，例如PCR引物。
[0033]使用從樣品中提取的基因組DNA作為模板，并使用PCR引物對結核分枝桿菌(TB)耐 藥性基因突變進行擴增反應，以獲得擴增產物。擴增反應包括但不限于聚合酶鏈式反應 (PCR)、連接酶鏈式反應(LCP)、自動維持序列復制（3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈 置換擴增(SDA)、多重置換擴增(MDA)和滾環擴增(RCA)，其公開于以下參考文獻(在此引作 參考）中：Mullis等，美國專利第4,683，195號 ；第4,965，188號；第4,683,202號；第4,800， 159(?0〇號山61€&11(1等，美國專利第5,210,015號（用1 &9111&11"或"1&9"[注冊商標]探針 進行的實時PCR);Wittwer等，美國專利第6，174，670號;Kacian等，美國專利第5，399，491號 ("NASBA"）； Lizardi，美國專利第5，854，033號;Aono等，日本專利公開第JP 4-262799號（滾 環擴增）；等等。
[0034]優選使用PCR法對靶核苷酸進行擴增。PCR法本身是本領域眾所周知的。術語"PCR" 包括該反應的衍生形式，其包括但不限于反轉錄PCR、實時PCR、嵌套式PCR、多重PCR和熒光 定量PCR等。優選使用熒光定量PCR法對靶核苷酸進行定量擴增。在一個實施方案中，在一個 實施方案中，PCR法可為定性或定量PCR法。在另一個實施方案中，PCR法為定量PCR法。在又 一個實施方案中，PCR法為實時熒光定量PCR法。
[0035]在引物、模板DNA和耐熱DNA聚合酶存在下，使用與有義鏈雜交的引物(反向引物） 和與反義鏈雜交的引物(正向引物），通過使變性、退火和延伸步驟的循環重復大約30次~ 50次(例如45次)來進行PCR。在一個實施方案中，PCR為實時熒光定量PCR。在一個實施方案 中，使用飽和熒光染料(例如LC Green、LC Green Plus、Eva Green和SYT0-9)進行PCR。在一 個實施方案中PCR使用了引物組1、2和/或3以及它們的任意組合（例如引物組1與2的組合 (當靶基因是inhA和katG時），引物組1與2和3的組合（當靶基因是inhA、katG和rpoB時)等）。 本發明的PCR引物組可以任意組合，以針對樣品中的不同靶基因進行檢測，例如引物組1可 與引物組2和/或3組合，引物組2可與引物組1和/或3組合，引物組3可與引物組1和/或2組 合。因此，在一個實施方案中，本發明的PCR引物組可包含引物組1，并任選包含至少一種選 自引物組2和引物組3的引物組。在另一個實施方案中，本發明的PCR引物組包括引物組2,并 任選包含至少一種選自引物組1和引物組3的引物組。在又一個實施方案中，本發明的PCR引 物組包括引物組3,并任選包含至少一種選自引物組1和引物組2的引物組。
[0036] 在本發明的PCR中，可使用各種常規的耐熱DNA聚合酶進行擴增，包括但不限于 FastStart Taq DNA聚合酶（Roche)、Ex Taq (注冊商標，Takara)、Z_Taq、AccuPrime Taq DNA聚合酶和HS Taq DNA聚合酶。
[0037] 基于引物Tm值選擇合適PCR反應條件的方法是本領域眾所周知的，本領域普通技 術人員可以根據引物長度、GC含量、目標特異性和靈敏度、所使用的聚合酶性質等，選出最 佳條件。例如，可使用以下條件進行PCR反應:95°C 5分鐘，95°C 15秒，65°C 10秒，72°C 10秒，循環45次。
[0038] 在獲得PCR產物后，根據高分辨率溶解曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進 行檢測。在一個實施方案中，高分辨熔解曲線分析的條件為:95°C 2分鐘，以0.1°C/步從83 。(:掃描至96°C (對于rpoB基因）或從82°C掃描至93°C (對于katG基因）或從80°C掃描至94°C (對于inhA基因）。在一個實施方案中，使用Rotor-gene Q PCR儀進行高分辨恪解曲線分析。
[0039] 試劑盒 本發明還涉及一種用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因 突變的試劑盒，其含有本發明的PCR引物組。本發明還涉及本發明PCR引物組在制備用于基 于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的試劑盒中的用途。在一個 實施方案中，所述PCR引物組為選自引物組1、引物組2和引物組3的至少一種（例如至少2或 全部3種）引物組。在一個實施方案中，本發明的PCR引物組可包含引物組1，并任選包含至少 一種選自引物組2和引物組3的引物組。在另一個實施方案中，本發明的PCR引物組包括引物 組2,并任選包含至少一種選自引物組1和引物組3的引物組。在又一個實施方案中，本發明 的PCR引物組包括引物組3,并任選包含至少一種選自引物組1和引物組2的引物組。
[0040] 試劑盒可包含實施本發明方法所用的材料或試劑(包括PCR引物組）。試劑盒可以 包括儲存反應試劑(例如在合適容器中的引物、dNTP、酶等)和/或支持材料(例如緩沖液、實 施檢測的說明書等）。例如，試劑盒可以包括一個或多個含有相應反應試劑和/或支持材料 的容器(例如盒子）。這樣的內容物可一起或分開遞送給既定的接受者。例如，第一個容器可 含有用于測定的酶，第二個容器含有飽和熒光染料（例如LC Green、LC Green Plus、Eva Green和SYT0-9)、而第三個容器含有PCR引物組。所述試劑盒還可含有適合容納所述試劑或 容器的隔室。作為一個實例，試劑盒可含有PCR引物組、飽和熒光染料（例如LC Green、LC Green Plus、Eva Green和SYT0-9)、PCR反應緩沖液、使用說明書。試劑盒還可含有聚合酶和 dTNP等。試劑盒還可含有UNG、用于質控的內標、陽性和陰性對照等。試劑盒還可包含用于從 樣品制備核酸例如DNA的試劑。本發明試劑盒還可包含除了本發明的PCR引物組之外的其它 任何PCR引物組，例如能夠有效檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的PCR引物組。以上 實例不能理解為限制適用于本發明的試劑盒及其內容物。
[0041 ] 微陣列 本發明還涉及一種用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因 突變的微陣列，其含有本發明的PCR引物組。本發明還涉及本發明的PCR引物組在制備用于 基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌(TB)耐藥性基因突變的微陣列中的用途。在一 個實施方案中，所述PCR引物組為選自引物組1、引物組2和引物組3的至少一種(例如至少2 或全部3種）引物組。在一個實施方案中，本發明的PCR引物組可包含引物組1，并任選包含至 少一種選自引物組2和引物組3的引物組。在另一個實施方案中，本發明的PCR引物組包括引 物組2,并任選包含至少一種選自引物組1和引物組3的引物組。在又一個實施方案中，本發 明的PCR引物組包括引物組3,并任選包含至少一種選自引物組1和引物組2的引物組。
[0042]微陣列是指具有平坦表面的固相支持體，其具有核酸陣列，陣列中的各個成員包 含固定在空間上確定的區域或位點上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷貝，所述區域或位 點不與陣列中的其它成員的區域或位點重疊;也就是說，所述區域或位點在空間上是離散 的。此外，空間上確定的雜交位點可為"可尋址的"，因為其位置及其固定化的寡核苷酸的身 份是已知或預先確定的（例如在其使用前是已知或預先確定的）。通常寡核苷酸或多核苷酸 為單鏈，并通常由5'-端或3'-端與固相支持體共價連接。微陣列中含有非重疊區的核酸的 密度通常大于l〇〇/cm 2,更優選大于1000/cm2。微陣列技術公開于例如以下參考文獻中： Schena編輯的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Current Opin. Chem. Biol·, 2:404_410，1998,其全部內容通過引用結合到 本文中。
[0043]雖然上文已描述了本發明的各種實施方案，但是應理解的是，其僅以實例的方式 提供，而并非限制。對公開的實施方案的許多改變可依照本文的公開內容來進行，而不會背 離本發明的精神或范圍。因此，本發明的廣度和范圍不應受到任何上述的實施方案所限制。
[0044] 本文提及的所有文獻都通過引用結合到本文中。本申請引用的所有出版物和專利 文件都為所有目的而通過引用結合，引用程度如同單獨地指出各個出版物或專利文件一 樣。 實施例
[0045] 除非另外說明，否則本文實施例所用的材料均市購獲得，用于進行實驗的各種具 體實驗方法均為本領域常規的實驗方法(參見例如F.奧斯伯等主編的《精編分子生物學實 驗指南》（1999)，科學出版社，ISBN 7-03-006408-9和J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實 驗指南(第三版)》（2002)，科學出版社，ISBN 7-03-010338-6)或者按照制造商所建議的步 驟和條件，并能由本領域技術人員根據需要常規地確定。以下對某些材料和方法進行了詳 述。
[0046] 實施例1:使用本發明PCR引物組進行的高分辨熔解曲線分析 1.材料和方法 1.1.材料 PCR反應液1 (包括PCR引物組1)、PCR反應液2 (包括PCR引物組2 )、PCR反應液3 (包括PCR 引物組3)和HS Taq酶。
[0047] PCR反應液各組分濃度見表2。
[0048]表 2
1.2.樣品 野生型對照質粒wt(inhA-katG_rpoB基因野生型質粒（SEQ ID NO: 7)，由Invitrogen 公司合成)和醫院臨床痰液樣本核酸。
[0049] 1.3.設備 QIAGEN公司Rotor-gene Q PCR儀。
[0050] 1.4.方法 首先采用PCR反應液和HS Taq對純化的結核分枝桿菌基因組DNA在Rotor-Gene Q平臺 上進行擴增，PCR反應液中包含熒光染料，在擴增過程中能夠嵌入不斷增加的PCR雙鏈產物 中。因此整個產物富集的過程能夠通過Rotor-Gene Q的軟件進行實時監測，從而確保質量 可靠的PCR產物用于后續HRM分析。運行后的結果由軟件進行自動分析，減少了人工分析的 負擔和誤差。
[0051] 按所需要的PCR反應管數η (η彡36)，反應體系配制如下表3: 表3
rpoB檢測程序： ? 95 °C: 5 分鐘； ? 95°C:15秒，65°C:10秒，72°C:10秒，熒光信號收集設在65°C，信號收集通道為 "Green"，45個循環； ? !1冊:95°(：:2分鐘 83°C 至96°C (Ο.ΙΓ/步） katG檢測程序： ? 95 °C: 5 分鐘； ? 95°C:15秒，65°C:10秒，72°C:10秒，熒光信號收集設在65°C，信號收集通道為 "Green"，45個循環； ? !1冊:95°(：:2分鐘 82°C 至93°C (Ο.ΙΓ/步） inhA檢測程序： ? 95 °C: 5 分鐘； ? 95°C:15秒，65°C:10秒，72°C:10秒，熒光信號收集設在65°C，信號收集通道為 "Green"，45個循環； ? !1冊:95°(：:2分鐘 80°C 至94°C (Ο.ΙΓ/步）。
[0052] 2.結果及分析 通過兩種分析模式的分析，能夠明顯與野生型對照進行區分的樣本則判斷該份樣本在 基因檢測區域存在突變，否則判斷為野生型。結果詳見圖1-3。圖1給出了使用本發明PCR引 物組(SEQ ID NO: 5和6)對rpoB基因進行擴增后應用高分辨熔解曲線分析對突變進行檢測 的一個結果截圖。圖2給出了使用本發明PCR引物組(SEQ ID NO: 3和4)對katG基因進行擴 增后應用高分辨熔解曲線分析對突變進行檢測的一個結果截圖。圖3給出了使用本發明PCR 引物組(SEQ ID NO: 1和2)對inhA基因進行擴增后應用高分辨熔解曲線分析對突變進行檢 測的一個結果截圖。
[0053]從圖1-3可知，應用本發明PCR引物組能夠快速準確地檢測出結核分枝桿菌耐藥性 基因突變（inhA、katG和rpoB)中的突變，能夠良好地區分野生型對照、雜合突變和純合突 變，且與臨床上常規藥敏試驗對痰液樣本的檢測結果或DNA測序結果(結果未顯示)一致。 [0054] 實施例2:不同PCR引物組間的比較 本實施例中所用的材料、儀器與方法及條件均同實施例1，但在PCR過程中使用了下表4 所示的兩種PCR引物組對野生型質粒rpoB基因進行了擴增。
[0055]表 4
PCR引物組3(本發明引物組)和PCR引物組4之間在反向引物上完全相同，正向引物僅小 部分堿基不同。相同的野生型質粒樣本使用不同PCR引物組(3和4)的檢測結果質量完全不 同，見圖LPCR引物組4結果顯示NTC有嚴重非特異性擴增（圖4A灰色曲線），而PCR引物組3不 存在非特異性擴增。
【主權項】
1. 用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的PCR引物組，所 述PCR引物組包括至少一種選自以下的引物組： (1) 引物組1，其包含具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物； (2) 引物組2,其包含具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的引物;和 (3) 引物組3,其包含具有SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列的引物。2. 權利要求1的PCR引物組，其中所述PCR引物組包括引物組1，并任選包含至少一種選 自引物組2和引物組3的引物組。3. 權利要求1的PCR引物組，其中所述PCR引物組包括引物組2,并任選包含至少一種選 自引物組1和引物組3的引物組。4. 權利要求1的PCR引物組，其中所述PCR引物組包括引物組3,并任選包含至少一種選 自引物組1和引物組2的引物組。5. -種用于基于高分辨熔解曲線技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的試劑盒或 微陣列，其包含權利要求1 -4中任一項的PCR引物組。6. 權利要求1-4中任一項的PCR引物組在制備用于基于高分辨熔解曲線技術檢測樣品 中的結核分枝桿菌耐藥性基因突變的試劑盒或微陣列中的用途。7. 權利要求6的用途，其中所述樣品為生物樣品，優選所述樣品為體液樣品或組織樣 品，和更優選所述樣品選自活組織檢查樣品、細胞培養物、經固化處理的樣品（如石蠟包埋 樣品）、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁和腹 膜液。8. -種基于高分辨熔解曲線技術檢測樣品中結核分枝桿菌耐藥性基因突變的方法，所 述方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的核酸， (2) 使用權利要求1-4中任一項的引物組進行PCR擴增，和 (3) 對步驟(2)的PCR產物進行高分辨熔解曲線分析； 其中所述方法不用于診斷目的。9. 權利要求8的方法，其中所述樣品為生物樣品，優選所述樣品為體液樣品或組織樣 品，和更優選所述樣品選自活組織檢查樣品、細胞培養物、經固化處理的樣品（如石蠟包埋 樣品）、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁和腹 膜液。10. 權利要求8或9的方法，其中高分辨熔解曲線分析的條件為:95°C 2分鐘，以0.TC/ 步從83 °C掃描至96 °C或從82 °C掃描至93 °C或從80 °C掃描至94°C。
【文檔編號】C12N15/11GK105907878SQ201610474803
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】陳華, 楊蓉, 劉小青
【申請人】凱杰生物工程（深圳）有限公司