基于coⅰ基因鵪鶉肉源成分pcr擴增鑒定方法和專用引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測食品中鵪鶉源性成分的方法及專用引物。專用引物見序列表SEQ ID NO 1?2。針對以鵪鶉肉源DNA為陽性模板，牛、羊、豬、兔、鴿、雞、鴨和鵝8個物種的DNA為干擾模板的混合模板，進行PCR和qPCR反應。其中PCR方法的結果以瓊脂糖凝膠電泳圖譜中電泳條帶為陽性結果，而qPCR方法中以擴增曲線的Ct值小于34的擴增作為陽性結果，檢測靈敏度達皮克級DNA。該方法首次利用COⅠ基因為目標基因對深加工鵪鶉肉進行檢測，所設計引物同時適用于PCR和qPCR方法中，不僅具有良好的特異性，且高度的靈敏性為食品中動物源性成分的鑒定探索了新的途徑，具有操作便捷，穩定準確等有益結果。
【專利說明】
基于COI基因鵪鶉肉源成分PCR擴増鑒定方法和專用引物
技術領域
[0001]本發明屬于食品質量安全檢測技術領域，尤其涉及鵪鶉特異性PCR擴增鑒定畜禽 肉中鵪鶉肉源性成分。
【背景技術】
[0002 ]近年來，動物源性食品摻雜摻假、以次充好、以廉價劣質的畜禽肉替代高價優質畜 禽肉等各種食品安全事件頻發，嚴重擾亂了市場秩序，侵害了生產者和消費者的合法利益， 同時帶來了嚴重的食品安全隱患。在西方，一項對近千種肉制品的檢測分析表明，有近20% 的廣品存在標識與品種不完全相符的現象。
[0003] 鵪鶉屬于雞形目最大的特點就是耐粗飼，抗病能力強，出欄快，產蛋率高，易管理 等等很多優點，很多人都飼養鵪鶉，因此市場上常會利用家養鵪鶉冒充野生麻雀、鴿子或其 他野生鳥類的不法行為。研究動物源性食品安全檢測技術，對食品動物源性成分進行鑒定， 顯得尤為重要。PCR技術由于其操作簡便、快速高效等特點，已在國外肉類摻假研究中得到 廣泛應用，并取得一些創新性成果。動物線粒體基因組DNA作為核外遺傳物質，無論是在種 間還是種內都具有廣泛的多態性，是設計肉類成分定性檢測的首選靶點，包括細胞色素 b (Cyt b)基因、細胞色素 c氧化酶第I亞基(C0X1)基因、16S rRNA、D-Loop基因等，在這些基因 中C0X1在線粒體基因組中屬于進化速率較慢的，更有利于肉類成分的定性檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種PCR檢測肉類中鵪鶉 源成分鑒定的方法及專用引物，操作簡便、快速，檢測結果準確的分析肉質中鵪鶉源成分， 該方法首次利用C0I基因為目標基因對深加工鵪鶉肉進行檢測，所設計引物同時適用于PCR 和實時熒光定量PCR(qPCR)方法中，不僅具有良好的特異性，且高度的靈敏性為食品中動物 源性成分的鑒定探索了新的途徑，具有操作便捷，穩定準確等有益結果。
[0005] 本發明的第一個目的是通過以下技術方案實現的，基于C0I基因鵪鶉肉源成分PCR 擴增鑒定專用引物對，其特征是，所述引物對的核苷酸序列為：
[0006] 所述引物對的上游引物序列為:5'-CCTCATCACCGCTATCT-3'，
[0007] 所述引物對的下游引物序列為:5'-六六了六六6了611^^了六0六66六了6-3'。
[0008] 本發明的第二個目的是通過以下技術方案實現的，一種PCR檢測肉類中鵪鶉源成 分鑒定的方法:分別提取鵪鶉肉樣本DNA作為陽性對照樣本和待測肉樣DNA并稀釋到同一濃 度；利用所述PCR擴增鑒定專用引物對鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA同時進行同一 PCR擴 增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，以鵪鶉肉樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜中 141bp電泳條帶為陽性結果;將待測肉樣DNA其PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜與陽性結 果進行比對，如果待測肉樣DNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現電泳條帶141bp并 與陽性對照樣本條帶亮度相同，認定待測鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉。
[0009] 優選的，所述PCR擴增反應體系為：2XPCR Mix 10μ1，10πιο1/μ1上游引物0.2μ1， lOmol/μΙ下游引物0· 2μ1，20ng/yl模板cDNA ΙμL，滅菌雙蒸水18·6μ1。
[0010] 優選的，所述PCR擴增的反應程序為95°C 5min;95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s此 過程經過32個循環，最后72°C延伸5min。
[0011] 優選的，所述PCR擴增產物為：
[0012] CCTCATCACC GCLfflCTmC TCCmCTCTC CCTCCCAGTC CTAGCTGCTG GCAI'TACTAT SO ACTTCTAACT GATC、GAAA(/C TCAACACTAC ATTCTTTCMC CCT(.iCAW.'"\G 1:2.0 CATCTTGTAT (、ΛΛ〔、Λ(ΤΤΛΤ T 141 〇
[0013] 本發明的第二個目的還可以通過以下技術方案實現，一種QPCR檢測肉類中鵪鶉源 成分鑒定的方法:提取鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA并稀釋到同一濃度;利用所述PCR擴增 鑒定專用引物對鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA實時熒光定量PCR擴增(qPCR)，實時熒光定 量PCR擴增反應在ABI 7500序列擴增儀中進行，應用實時熒光定量PCR儀軟件對PCR擴增產 物進行高分辨率熔解曲線分析，確定擴增產物的Tm值熔解曲線圖譜。以鵪鶉肉樣本DNA擴增 曲線的Ct值小于34的擴增曲線作為陽性結果，將待測肉樣DNA的擴增曲線圖譜與陽性結果 對照，如果待測鵪鶉肉DNA的擴增產物的Ct值與陽性對照結果相似，即相差±0.5以內，認定 待測鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉。
[0014] 優選的，所述實時熒光定量PCR擴增反應體系為20ngAil CDNA模板1 ·0μ1，lOpmol/ μL上游引物0·2μ1，10ρπιο1/μ1 下游引物0.2yl，SYBR RealMaster Mix 7·5μ1，雙蒸水6·1μ1〇
[0015] 優選的，所述實時熒光定量PCR擴增反應程序如下圖所示：50°C預熱2min，95°C預 變性lOmin，然后95°C變性15s、60°C退火延伸lmin，共40個循環，最后95°C變性15s，60°C退 火延伸30s，95°C變性15s收集熔解曲線。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有以下有益結果：
[0017]第一，根據鵪鶉線粒體基因組中⑶XI基因設計引物對;提取鵪鶉肉樣本DNA后，利 用設計的引物對進行非標記熒光PCR擴增;應用熒光PCR儀軟件對PCR擴增產物進行高分辨 率熔解曲線分析，確定擴增產物的Tm值熔解曲線圖譜;操作簡便、快速，檢測結果準確。
[0018] 第二，本發明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優點，能夠有效檢測出肉 類樣品中鵪鶉源成分，為市場上的摻假肉類提供便捷的鑒定方法。
[0019] 第三，本發明的檢測引物無論是針對普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳方法檢測還是 熒光定量PCR方法直接觀察，都能取得較好結果。
[0020] 第四，本發明的方法不局限于樣品的狀態，無論是生鮮樣本還是對于DNA破壞較嚴 重、提取效率較低的深加工產品，這樣便于對市場上產品進行便捷、有效的監管，具有更高 的實用價值。
【附圖說明】
[0021 ]圖1是普通PCR方法的特異性檢測結果圖；
[0022] 圖2是普通PCR方法的靈敏性檢測結果圖；
[0023] 圖3是熒光定量PCR(qPCR)方法的特異性檢測結果圖；
[0024] 圖4是熒光定量PCR(qPCR)方法的靈敏性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0025] DNA的提取一酚仿法
[0026] (1)取生/熟鵪鶉肉樣本25mg，剪碎，加入500μ1細胞裂解液（含0.5%SDS的STE)作 用30min，10%蛋白酶Κ 10μ1，55Γ水浴過夜。
[0027] (2)將消化后的肉樣加入等量體積的Tris飽和酚(ρΗ8.0)，緩慢顛倒離心管lOmin， 12000rpm離心10min，用大口徑的槍頭小心吸取上清液至干凈的離心管中。
[0028] (3)重復一次上一步工作。如果上清液清亮透明，此步可以省略。
[0029] (4)加入等量的酸:氯仿（1:1)，緩慢顛倒離心管10min，12000rpm離心10min，用大 口徑的槍頭小心吸取上清液至干凈的離心管中。
[0030] (5)加入等體積的氯仿，緩慢顛倒離心管lOmin，12000rpm離心10min，用大口徑的 槍頭小心吸取上清液至干凈的離心管中。
[0031] (6)加入兩倍體積的無水乙醇，輕搖離心管，待有白色霧狀沉淀出現停止搖動。
[0032] (7)用槍頭小心將DNA沉淀挑出，置于盛有75%乙醇的離心管中。
[0033] (8)將乙醇吸凈，室溫下讓乙醇揮發干凈（在通風櫥中約3小時，或者室溫過夜6-8 小時），加入200μ1 0. lmol/L的NaOH溶液溶解，最后適量雙蒸水或TE緩沖液稀釋DNA。
[0034] (9)待DNA完全溶解后用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果或在分光光度儀上檢測濃 度。
[0035] (10)將溶解好的DNA置于-20 Γ保存。
[0036] PCR 反應
[0037] 引物設計
[0038] 根據NCBI數據庫上的鵪鶉的線粒體全基因組序列，找出C01的DNA序列，利用 Primer Express 3.0程序設計引物，最后優化出1對引物進行PCR及qPCR擴增測序。
[0039]
[0040] 建立最佳PCR反應體系
[0041 ] 普通20ylPCR擴增反應體系，各成分配比如表2-3。
[0042] 反應程序：95°C 5min;95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s此過程經過32個循環，最后 72°C 延伸 5min。
[0043] 表2-3 20μ1 PCR擴增體系
[0044]
[0045] PCR產物檢驗
[0046] 1 · 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測：
[0047] (1)取5yLPCR產物，加 lyL上樣緩沖液，上樣。
[0048] (2)120V，電泳 20min。
[0049] (3)照膠并保存膠圖。
[0050] 特異性檢測：
[0051]利用同一PCR擴增體系，同一對引物對9個不同物種DNA模板進行擴增以檢測引物 的特異性。其擴增結果如圖1所示。
[0052]由試驗結果可知，這對引物具有較好的特異性，對鵪鶉以外的其他8個物種均沒有 擴增，具有較好的針對性，能夠作為一種特征引物對鵪鶉肉樣進行特異性檢測，。
[0053] 靈敏性檢測：
[0054]先測取所有物種DNA的濃度，并稀釋成統一濃度，除鵪鶉DNA外，將其他物種DNA等 比例混勻成干擾DNA Mix，將目標模板DNA用混勻的DNA Mix分別稀釋成10-\10-2、10-3、一直 到1〇_8倍。分別使用該引物對其進行檢測以考察方法的靈敏性。其PCR檢測膠圖如圖2所示。 [0055]由試驗得知，25mg深加工肉樣一般提取的DNA在微克級，經稀釋后，我們的檢測體 系可以達到皮克級，滿足了市場檢測的需要，相比于國外文獻中報導較多的多重PCR鑒定， 本研究的方法雖通量較小，但反應體系簡單，檢測結果更可靠。
[0056]定量 PCR [0057]反應體系與程序
[0058] 實時熒光定量PCR(qPCR)對樣品的DNA和陰性對照進行擴增。整個反應在ABI 7500 序列擴增儀中進行，反應條件如下圖所示，試驗用的體系見下表。每個樣品設3個重復。 [0059] 表qPCR擴增體系
[0060]
[0061 ] 實時熒光定量反應條件為：50°C預熱2min，95°C預變性lOmin，然后95°C變性15s、 60°C退火延伸lmin，共40個循環，最后95°C變性158,60°(：退火延伸3〇8,95°(：變性158收集熔 解曲線。。
[0062]特異性檢測結果見圖3。
[0063]靈敏性檢測結果見圖4。
[0064] 由圖中結果顯示，這對引物在熒光定量PCR擴增體系中仍能取得較好的特性結果， 鵪鶉以外的其他物種的DNA擴增曲線的Ct值均在34以上，可以有效地辨別模板DNA的來源。 在靈敏性檢測中，利用普通PCR同樣的稀釋方法，擴增結果顯示，在稀釋倍數為HTVeT 7)時， 仍能有較好的擴增曲線。
[0065] C01 基因全序列-根據Coturnix japonica mitochondrial DNA中C0X1 基因 1551bp 序列設計引物
[0066] GTGACCTTCATCAACCGATGACTATTTTCAACTAACCACAAAGACATTGGCACTCTTTATCTTATTTTTGGTACATG AGCAGGCATAGCCGGTACAGCACTTAGCTTGTTAATCCGCGCAGAACTAGGACAACCAGGCACCCTCCTAGGAGATG ACCAAATTTACAATGTAATTGTCACAGCACATGCCTTCGTCATAATCTTCTTTATAGTCATACCAATTATAATTGGA GGCTTCGGAAATTGACTCGTCCCACTTATAATCGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCACGTATGAATAACATAAGCTT CTGACTCCTCCCACCCTCCTTCCTGCTGCTACTAGCTTCTTCCACCGTTGAAGCTGGTGCCGGTACAGGATGAACTG TCTACCCGCCCCTAGCCGGCAACCTCGCCCACGCCGGAGCATCAGTAGATCTAGCCATCTTCTCCCTACATTTAGCA GGTGTATCATCAATCCTAGGAGCCATCAACTTTATCACCACTATTATCAATATAAAACCCCCTGCACTGTCACAATA CCAAACACCCCTATTTGTTTGATCAGTCCTCATCACCGCTATCTTACTCCTACTCTCCCTCCCAGTCCTAGCTGCTG GCATTACTATACTTCTAACTGATCGAAACCTCAACACTACATTCTTTGACCCTGCAGGAGGAGGAGACCCCATCCTG TATCAACACTTATTTTGATTCTTTGGACACCCAGAAGTCTACATCCTCATCCTCCCAGGCTTCGGAATCATCTCCCA CGTAGTAGCCTACTACGCAGGGAAAAAAGAACCATTCGGCTATATAGGAATAGTGTGAGCAATATTATCAATCGGAT TCCTAGGATTCATCGTATGAGCCCACCATATATTCACAGTAGGAATAGACGTAGATACACGAGCCTACTTTACATCA GCTACAATAATCATTGCCATCCCAACCGGTATCAAAGTTTTCAGCTGACTAGCAACCCTACACGGAGGAACAATCAA ATGAGATCCGCCCATACTATGAGCCCTCGGATTCATCTTCCTATTCACCATCGGAGGACTAACAGGGATCGTTCTTG CCAATTCATCACTTGACATCGCCCTCCATGACACCTATTACGTAGTCGCCCACTTCCACTACGTCCTATCCATAGGA GCAGTCTTTGCTATTTTAGCAGGATTCACCCACTGATTCCCACTATTCACAGGCTTCACCCTTCATCCTACATGAAC TAAGGCACACTTTGGAGTAATGTTCACAGGAGTCAACCTAACCTTCTTCCCACAGCACTTCCTAGGCCTAGCTGGTA TACCCCGACGATACTCAGACTACCCAGATGCCTACACACTTTGAAACACACTATCCTCAATCGGCTCCTTAATCTCA ATAACAGCCGTAATCATACTAATGTTTATTGTATGAGAAGCCTTCTCAGCAAAACGTAAAGTTCTTCAGCCAGAATT AACTGCTACCAACATCGAATGAATCCACGGCTGCCCACCCCCATACCACACCTTCGAAGAACCTGCCTTCGTCCAAG TACAAGAAAGGo
【主權項】
1. 基于COI基因鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定專用引物對，其特征是，所述引物對的核苷 酸序列為： 所述引物對的上游引物序列為:5'-CCTCATCACCGCTATCT -3'， 所述引物對的下游引物序列為:5'-AATAAGTGTTGATACAGGATG -3'。2. -種利用權利要求1所述的引物進行鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法，其特征是，所 述鑒定方法為:分別提取鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA并稀釋到同一濃度，鵪鶉肉樣本DNA 作為陽性對照樣本;利用所述PCR擴增鑒定專用引物對鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA同時 進行PCR擴增，兩者PCR擴增的體系和反應程序相同，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴 增產物，以鵪鶉肉樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜中Hlbp電泳條帶為陽性結果;將待測肉樣 DNA其PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜與陽性結果進行比對，如果待測肉樣DNA PCR擴 增產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現電泳條帶Hlbp并與陽性對照樣本條帶亮度相同，認定 待測鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉。3. 根據權利要求2所述的所述PCR擴增鑒定方法，其特征是，所述PCR擴增反應體系為:2 XPCR Mix 10 μ1，10πιο1/μ1 上游引物 0·2μ1，10πιο1/μ1 下游引物 0.2yl，20ngAU 模板 cDNA ΙμL，滅菌雙蒸水18·6μ1。4. 根據權利要求2所述的基于COI基因鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法，其特征是，所述 PCR擴增的反應程序為95°C 5 min; 95°C 30 s，60°C 30 s，72°C 30 s此過程經過32個循 環，最后72°C延伸5 min。5. 根據權利要求2所述的基于COI基因鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法，其特征是，所述 PCR擴增產物為： CCTCATCACC GCTATCTTAC TCCTACTCTC CCTCCCAGTC CTAGCTGCTG GCATTACTAT 60 ACTTCTAACT GATCGAAACC TCAACACTAC ATTCTTTGAC CCTGCAGGAG GAGGAGACCC 120 CATCCTGTAT CAACACTTAT T 141。6. -種利用權利要求1所述的引物進行鵪鶉肉源成分PCR擴增鑒定方法，其特征是，所 述鑒定方法為:提取鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA并稀釋到同一濃度;利用所述PCR擴增鑒 定專用引物對鵪鶉肉樣本DNA和待測肉樣DNA實時熒光定量PCR擴增-qPCR，實時熒光定量 PCR擴增反應在ABI 7500序列擴增儀中進行，應用實時熒光定量PCR儀軟件對PCR擴增產物 進行高分辨率熔解曲線分析，確定擴增產物的Tm值熔解曲線圖譜；以鵪鶉肉樣本DNA擴增曲 線的Ct值小于34的擴增曲線作為陽性結果，將待測肉樣DNA的擴增曲線圖譜與陽性結果對 照，如果待測鵪鶉肉DNA的擴增產物的Ct值與陽性對照結果在±0.5以內，認定待測鵪鶉肉 為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉。7. 根據權利要求6所述的PCR擴增鑒定方法，其特征是，所述實時熒光定量PCR擴增反應 體系為20 ng /μL cDNA模板 1·0μ1，10 pmol/μL上游引物 0·2μ1，10 pmol/μL下游引物 0 · 2μ1，SYBR RealMaster Mix 7· 5μ1，雙蒸水6· 1μ1〇8. 根據權利要求7所述的PCR擴增鑒定方法，其特征是，所述實時熒光定量PCR擴增反應 程序為:50°C預熱2min，95°C預變性lOmin，然后95°C變性158、60°(：退火延伸111^11，共40個循 環，最后95°C變性15s，60°C退火延伸30s，95°C變性15s收集熔解曲線。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907856SQ201610287110
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月30日
【發明人】高玉時, 唐修君, 樊艷鳳, 陸俊賢, 賈曉旭, 張小燕, 唐夢君, 陳大偉, 葛慶聯, 劉茵茵, 顧榮, 張靜, 馬麗娜
【申請人】江蘇省家禽科學研究所