用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的pcr引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的PCR引物、試劑盒及方法，屬于生物技術領域。所述PCR引物的上下游核苷酸序列分別如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示；所述PCR引物擴增的轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小為229bp，序列如Seq ID No.4所示。本發明還提供一種用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的試劑盒，其包括上述PCR引物。采用本發明所述的PCR引物和試劑盒對轉基因棉花非功能性插入片段進行檢測，具有快速、靈敏度高、特異性好、所需實驗條件不高等優點，因此有非常高的實用價值。
【專利說明】
用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的PCR引物、試劑盒 及方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種用于檢測轉基因棉花中非功能性插入 片段的PCR引物、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 轉基因棉花是全球種植的主要轉基因作物之一，也是我國種植面積最大的轉基因 作物。2014年，我國710萬農戶種植了轉基因棉花390萬公頃，占棉花總種植面積93%，高于 2013年90 %的比例。目前我國批準商業化種植的轉基因棉花主要有國內研發的轉cry lAb/ Ac融合基因的抗蟲棉和孟山都公司的轉crylAc基因的保鈴棉531(http:// www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。
[0003] 在孟山都公司向我國農業部提交的保鈴棉531的轉基因生物安全評價申報書 (http://www.moa·gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/201307/P020140701514080143663·pdf)中 第10頁、23-25頁描述了其育種親本還含有一個非功能性插入片段，該非功能性插入片段大 小為242bp，含有來自于質粒PV-GHBK04的176bp 7S 3 '序列和66bp的多聚接頭。在美國專利 W00240677中提供了該非功能插入片段及旁側的棉花基因組序列（Genbank登錄號 AX600188)，提供的序列全長1121bp，其中1-499位為棉花基因組序列，500-741位為非功能 插入片段，742-1121位為棉花基因組序列。孟山都公司提交的申報書中（第41頁）中提到通 過Southern雜交在保鈴棉育種世代R5和R6中檢測到了這個非功能性插入片段的存在，但在 其兩個商品品種中未檢測到。在商業化轉基因棉花品種中特別是在我國轉基因棉花中是否 存在這個非功能插入片段，未見公開報道。
[0004] 保鈴棉531申報書中描述的非功能插入片段盡管不具有殺蟲基因的功能，但仍屬 于轉基因外源成分，其存在可能會對棉花基因組產生非預期的影響，因此檢測該非功能插 入片段在我國轉基因棉花中的存在情況是非常有必要的。目前國內外均沒有關于該非功能 插入片段特異性PCR檢測方法的報道。
【發明內容】
[0005] 針對上述領域中的空白，本發明在非功能插入片段的旁側棉花組設計正向引物， 在其內部設計反向引物，用常規PCR方法可以快速準確鑒定出非功能插入片段。
[0006] 本發明的技術方案如下：
[0007] 用于檢測轉基因棉花非功能性插入片段的PCR引物，其特征在于，其上下游引物具 有如下核苷酸序列
[0008] 7S-421F:5 '-AGAACCCACAAAGGGTGTTG-3 '
[0009] 7S-649R:5 '-CTTTCAGACTGACAAGATCG-3 '
[0010] 所述PCR引物擴增的轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小為229bp，序列如 Seq IDNo.4所示。
[0011] 用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的試劑盒，其特征在于，包括所述的PCR 引物。
[0012] 所述的試劑盒，還包括用于進行PCR和/或電泳所需的試劑。
[0013] 用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的方法，其特征在于，包括采用所述的 PCR引物和/或所述的試劑盒進行如下步驟：
[0014] (1)采用所述PCR引物對待測棉花材料的基因組DNA進行PCR;
[0015] ⑵凝膠電泳檢測所述PCR產物；
[0016] (3)從所述電泳檢測結果中篩選出與所述轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶 大小一致的材料；
[0017] 所述PCR引物擴增的轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小為229bp，序列如 SeqIDNo.4^/f*。
[0018] 所述PCR的反應體系為:G〇Taq_?GreenMaster Mix 0.5yL/yL，所述上下游引物7S-421F和 7S-649R各0.5ymol/L，DNA 模板O.lyL/yL，其余為雙蒸水。
[0019] 所述PCR的反應條件為：95°C預變性4min;95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸 3〇8,35個循環；72°(：延伸1〇1^11;4°(：保存。
[0020] 所述凝膠電泳指，采用0.8%的瓊脂糖凝膠，于120V恒功率電泳分離15分鐘后，EB 染色紫外燈下顯影。
[0021] 所述試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中包括所述的PCR引 物，和/或
[0022] 在標有檢測轉基因棉花非功能性插入片段用途的包裝盒內裝有所述的PCR引物。
[0023] 組裝所述試劑盒的試劑中還包括用于進行PCR和/或電泳所需的試劑，和/或
[0024] 所述標有檢測轉基因棉花非功能性插入片段用途的包裝盒內還裝有用于進行PCR 和/或電泳所需的試劑。
[0025]由于轉基因抗蟲棉保鈴棉531在美國和我國等已經批準種植近20年，在原始育種 材料中存在著一個242bp的非功能插入片段，由于該片段與其功能插入片段并不在同一染 色體上，沒有緊密連鎖，因此該片段在育種過程可能隨機遺傳到子代材料中。因此對這個非 功能插入位點進行檢測，監測其可能引起的非預期效應顯得十分必要。
[0026]本發明在非功能插入片段的旁側棉花基因組序列設計正向引物，在其內部設計反 向引物，用常規PCR方法可以快速準確鑒定出非功能插入片段。
[0027]實驗數據證明，含有非功能插入片段的棉花樣品能擴增得到一條229bp的片段，這 與預期結果完全一致。因此，建立的非功能插入片段定性PCR方法能有效地鑒別出非功能插 入片段。可以用于轉基因棉花材料中非功能插入片段的檢測。
[0028] 根據獲得的兩條引物及實驗結果，本發明提供了用于非功能插入片段的試劑盒和 檢測方法。
[0029] 綜上，因此本發明為特異性鑒定非功能插入片段提供了便利，這些方法的優點在 于快速、靈敏度高、特異性好、所需實驗條件不高，因此有非常高的實用價值。
【附圖說明】
[0030] 圖1.20個湖南省棉花種子中非功能插入片段PCR檢測
[0031] 1-20:20個棉花種子樣品；21:空白對照;M:DL2000
[0032] 圖2.雅雜棉一號F1的60粒種子中非功能插入片段PCR檢測 [0033] 1-60:60個單粒;61:空白對照;62:陽性對照;M:DL2000 [0034]圖3.湘雜棉13號F1的60粒種子中非功能插入片段PCR檢測
[0035] 1-60:60個單粒;61:空白對照;62:陽性對照;M: DL2000
【具體實施方式】
[0036] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用 于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook等的分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。
[0037] 生物材料
[0038]實施例2中所用到的20個轉基因棉花種子來源為:2015年購置湖南棉花種子市場， 其中，雅雜棉一號F1(生廠商：湖南興亞種業科技有限公司，生產批號：201410,審定編號：贛 審棉2006005)，2015年購自湖南省棉花種子市場。
[0039] 湘雜棉13號F1 (生廠商：湖南泰邦棉花種子有限公司，生產批號：201411，審定編 號:湘審棉2007008)，2015年購自湖南省棉花種子市場。
[0040]麵
[0041 ] 分子生物學試劑，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker等購自大連寶生物工程 有限公司。
[0042]其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由北京三博生物技術有限責任公 司合成。
[0043] 實驗儀器
[0044] PCR 擴增儀:型號 S1000(Bi〇-Rad 公司）
[0045] 核酸電泳儀:DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠）
[0046] 凝膠成像系統:BiospectrumAC(UVP 公司）
[0047] 其它儀器包括:離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養箱等。
[0048]實施例1.本發明所述的PCR引物及試劑盒
[0049] 本實施例提供一種用于檢測轉基因棉花非功能性插入片段的PCR引物，其設計過 程如下：
[0050] 在美國專利W00240677中提供了該非功能插入片段及旁側的棉花基因組序列 (Genbank登錄號AX600188)，提供的序列全長1121bp，如Seq ID No. 3，其中1-499位為棉花 基因組序列，500-741位為非功能插入片段，742-1121位為棉花基因組序列。本發明在序列 的5'端棉花基因組上設計正向引物，在插入片段內設計反向引物，擴增兩者的連接區，從而 建立特異性的檢測方法。
[0051] 所設計的本發明的引物如下：
[0052] 7S-421F：5(-AGAACCCACAAAGGGTGTTG-3'(Seq ID No.1),
[0053] 7S-649R:5'-CTTTCAGACTGACAAGATCG-3'（Seq ID No.2)，
[0054] 采用上述引物擴增的轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小為229bp，序列 如Seq IDNo.4所示。
[0055] 基于上述PCR引物，本實施例還提供一種用于檢測轉基因棉花非功能性插入片段 的試劑盒，其包括上述PCR引物；
[0056] 優選地，所述試劑盒還包括用于進行PCR和/或電泳所需的試劑。
[0057] 本實施例進一步提供所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟:組裝所述試劑盒的 試劑中包括所述的PCR引物，和/或，在標有檢測轉基因棉花非功能性插入片段用途的包裝 盒內裝有所述的PCR引物。
[0058] 優選地，所述步驟還包括:組裝所述試劑盒的試劑中還包括用于進行PCR和/或電 泳所需的試劑，和/或，所述標有檢測轉基因棉花非功能性插入片段用途的包裝盒內還裝有 用于進行PCR和/或電泳所需的試劑。
[0059] 實施例2.轉基因棉花中非功能插入片段的PCR檢測方法
[0060] 采用實施例1所述的兩條引物7S-421F和7S-649R或所述試劑盒，進行本發明所述 的非功能插入位點定性PCR檢測方法，對2015年購置湖南棉花種子市場的20個轉基因棉花 種子進行檢測，包括如下步驟：
[0061 ] 1樣品前處理
[0062] 雅雜棉一號F1、湘雜棉13號F1等20個轉基因棉花種子2015年購置湖南棉花種子市 場，每個樣品隨機取600粒種子，研磨混勻。
[0063]另外，雅雜棉一號F1和湘雜棉13號F1樣品再隨機選取60粒種子，單粒研磨。
[0064] 2棉花基因組DNA提取
[0065]依照植物DNA提取試劑盒(TIANGEN生物技術有限公司）的操作手冊，進行棉花材料 總DNA的提取。取5μ1提取的DNA溶液，以0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳，根據其亮度和帶型來初步 判斷提取DNA的質量。采用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。
[0066] 3湖南省20個棉花種子的非功能插入片段的PCR檢測
[0067] PCR反應體系：G〇Taq?GreenMaster Mix 10yL，引物7S-421F和7S-649R(10ymol/ L)各lyL，DNA模板2yL，補超純水至總體積20yL。反應程序:95°C預變性4min，95°C變性30s， 56°C退火30s，72°C延伸30s，擴增反應進行35個循環，72°C保溫lOmin。
[0068] 檢測結果表明，如圖1所示，20個湖南省棉花種子樣品中有雅雜棉一號F1、湘雜棉 13號F1等3個獲得了一條229bp的片段，表明在湖南省的棉花種子樣品中檢測到了非功能插 入片段。
[0069] 4雅雜棉一號F1、湘雜棉13號F1棉花種子中的非功能插入片段的單粒PCR檢測
[0070]選擇湖南省棉花種子非功能插入片段檢測陽性的兩個樣品：雅雜棉一號F1和湘雜 棉13號F1，分別隨機抽取60個單粒，單粒研磨，單粒提取DNA，采用建立的非功能插入片段定 性PCR方法進行鑒定，結果表明雅雜棉一號F1樣品中含有非功能插入片段的單粒為28粒(圖 2)，湘雜棉13號F1中樣品中含有非功能插入片段的單粒為34粒（圖3)，參照國家標準(農業 部1485號公告-19-2010)中轉基因純度的計算方法計算非功能插入片段的純度：
[0071 ]純度=陽性個體數/總個體數。
[0072]計算結果表明，雅雜棉一號F1和湘雜棉13號F1的非功能插入片段的純度分別為 46.67%和 56.67%。
[0073]從圖1至圖3可以看出，采用本發明所述引物或試劑盒對含有非功能插入片段的棉 花材料檢測時，擴增特征條帶單一清晰，無其它雜帶產生，說明本發明所提供的引物特異性 很1?。
【主權項】
1. 用于檢測轉基因棉花非功能性插入片段的PCR引物，其特征在于，其上下游引物具有 如下核巧酸序列 7S-42IF:5 '-AGAACCCACAAAGGGTGTTG-3 ' 7S-649R:5 '-CTTTCAGACTGACAAGATCG-3 ' 所述PCR引物擴增的轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小為229bp，序列如Seq ID No.4所示。2. 用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所 述的PCR引物。3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括用于進行PCR和/或電泳所需的試 劑。4. 用于檢測轉基因棉花中非功能性插入片段的方法，其特征在于，包括采用權利要求1 所述的PCR引物和/或權利要求2或3所述的試劑盒進行如下步驟： (1) 采用所述PCR引物對待測棉花材料的基因組DNA進行PCR; (2) 凝膠電泳檢測所述PCR產物； (3) 從所述電泳檢測結果中篩選出與所述轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小 一致的材料； 所述PCR引物擴增的轉基因棉花非功能性插入片段特征條帶大小為229bp，序列如Seq ID No.4所示。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應體系為：G〇Taq? GreenMaster Mix 0.5化/化，所述上下游引物7S-421F和7S-649R各0.5皿01/L，DNA模板0.1 化/化，其余為雙蒸水。6. 根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應條件為：95°C預變性 4min;95°C 變性 30s，56°C 退火 30s，72°C 延伸 3〇3,35個循環;72°(：延伸1〇111111;4°(：保存。7. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述凝膠電泳指，采用0.8%的瓊脂糖凝 膠，于120V恒功率電泳分離15分鐘后，邸染色紫外燈下顯影。8. 權利要求2或3所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中包 括權利要求1所述的PCR引物，和/或 在標有檢測轉基因棉花非功能性插入片段用途的包裝盒內裝有權利要求1所述的PCR 引物。9. 權利要求2或3所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝所述試劑盒的試劑中還 包括用于進行PCR和/或電泳所需的試劑，和/或 所述標有檢測轉基因棉花非功能性插入片段用途的包裝盒內還裝有用于進行PCR和/ 或電泳所需的試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907855SQ201610282177
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】謝家建, 彭于發, 王葉
【申請人】中國農業科學院植物保護研究所