一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢式熒光pcr檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用
【專利摘要】本發明提供一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢式熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用，涉及分子生物學技術領域，利用本發明的引物、探針組合物以及多重巢式熒光PCR檢測試劑盒可以快速鑒定出阿膠中驢、馬、牛和豬源成分。本發明針對阿膠中微量DNA或降解DNA，通過巢式PCR及小片段擴增技術，大大提高了引物及探針有效識別靶點的幾率，因此大大提高檢測準確性和靈敏度；兩步PCR擴增在同一體系進行，具有閉管操作、污染率低、檢測靈敏度高、特異性好、準確度高、通量大等有益效果。
【專利說明】
一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢式熒光PCR檢測引物、探針、 試劑盒、檢測方法及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種膠類中藥動物源性檢測技術領域，具體涉及一種阿膠中驢、馬、牛 和豬源性巢式熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用，屬于分子生物學技術領 域。
【背景技術】
[0002] 阿膠為馬科動物驢的皮，經煎煮、濃縮制成的固體膠，原產自山東省泛東阿區，始 載于《神農本草經》，與人參、鹿茸并稱為"滋補三寶"，至今已有近三千年歷史。阿膠補血圣 藥，味甘平，入肺、肝、腎經，具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，長期服用可補血養 血、美白養顏、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力，適用人群廣泛。李時珍著《本草綱目》載："阿膠 《本經》上品。
[0003] 2015版《中國藥典》明確規定阿膠為馬科動物驢(Equus animusL.)的皮熬制而成 的阿膠為正品阿膠。然而隨著膠類市場的不斷發展，隨著熬膠原料供應緊張和價格上漲，由 于阿膠功效獨特，市場供不應求，摻假偽劣產品層出不窮，并不斷被媒體曝光。這些劣質阿 膠多采用牛、馬、騾子、豬、羊等動物皮、骨、結締組織熬制，用肉眼難以鑒別，《中國藥典》通 過驢的特征態測驢源成分，已不能滿足鑒別雜皮源的需求。偽劣阿膠在臨床使用后不僅達 不到治療效果，給消費者健康安全帶來巨大隱患。為了取締和預防假冒偽劣阿膠產品，需要 質量監管部門加大執法力度，而首要前提是具備科學可靠的檢測方法。
[0004] 傳統的巢式PCR反應由于有2次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶點的可能性，增加 了檢測的敏感性和可靠性，主要應用于分子生物學領域和醫學檢測研究中。而檢測結果需 要電泳及凝膠成像系統才能看到結果，從PCR到檢測結果出來大約需要5h，而且存在交叉污 染的可能性。由于阿膠經過多個工序的高溫煎煮，導致線性基因組DNA斷裂成小片段，甚至 降解掉，雖然環狀線粒體DNA對高溫的耐受力相對線性基因組DNA較強，但阿膠經過深度加 工后都會對DNA不同程度的破壞，如何解決降解DNA成為基于DNA檢測技術來檢測阿膠真偽 的一大瓶頸。中國專利（CN 104988231. A)利用半巢式PCR技術鑒別阿膠真偽，擴增片段 700bp左右，對于深度加工的膠類中藥來講，DNA已高度破壞，大片段擴增很難成功，加上需 要兩輪PCR擴增，不但耗時、開管操作極易造成交叉污染導致假陽性及結果的不準確性所以 不能滿足阿膠真偽檢測的要求。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢 式熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用，該試劑盒檢測靈敏度高、特異性好，可 以實現阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分快速定性檢測;該檢測方法快速簡便、準確度高。
[0006] 為實現上述目的，本發明通過以下技術方案來實現：
[0007] -種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引物、探針 組合物，包括：
[0008] (1)多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用外側引物，該引物擴增片段為 202bp，其核苷酸序列如下：
[0009] 正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA 3'，如SEQ N0.1 所示；
[0010]反向引物序列：5，TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3，，如SEQN0·2所示 ；
[0011] (2)多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用內側引物，該內側引物擴增片段 為143bp，其核苷酸序列如下：
[0012] 正向引物序列：5 'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC 3 '，如SEQ N0· 3所示；
[0013] 反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQN0·4所示 ；
[0014] (3)驢特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0015] 5，CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT 3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0016] (4)馬特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0017] 5 ' CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG 3 '，如SEQ N0 · 6所示；
[0018] (5)牛特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0019] 5，TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC 3，，如SEQ N0 · 7所示；
[0020] (6)豬特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0021 ] 5，CCTCGCACACGCTTACATCAGTA 3，，如SEQ N0 · 8所示；
[0022]其中，所述驢、馬、牛和豬特異性探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基 團，所述報告基團為?41、冊乂、了411^、1?(^工￥5中的任一種，所述淬滅基團為0&1^71、8即1、 BHQ2中的任一種。
[0023]本發明還可以具有以下附加技術特征：
[0024]優選的，各探針修飾的報告基團和猝滅基團為：
[0025]驢特異探針序列為：
[0026] 5，J0E-CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT-BHQ2 3，JnSEQN0.5K*;
[0027] 馬特異探針序列為：
[0028] 5，R0X-CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG-BHQ2 3，JnSEQN0.6K*;
[0029] 牛特異探針序列為：
[0030] 5 'FAM-TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC-BHQ13，，如SEQ N0 · 7所示；
[0031]豬特異探針序列為：
[0032] 5，CY3-CCTCGCACACGCTTACATCAGTA-BHQ2 3，JnSEQN0.8K*。
[0033] 優選的，還包括內標質控體系，構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，所述內標 質控體系包括質控體系引物、質控體系探針和質控體系序列，各核苷酸序列如下：
[0034] (1)質控體系引物：
[0035]與驢、馬、牛和豬源性成分共用一對外側引物，上游引物序列如SEQ NO. 1所示，下 游引物如SEQ N0.2所示；
[0036] (2)質控體系探針：
[0037] CntP: 5，TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3，，如SEQ N0 · 9所示；
[0038] (3)質控體系序列：
[0039] CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT GGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如 SEQ NO · 10所示；
[0040] 其中，質控體系探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述報告基團 為卩厶1、冊乂、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8即1、8即2中的任一種。 [0041 ]進一步的，質控體系探針修飾為：5 ' CY5-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-BHQ23'JnSEQN0.9K*。
[0042] 本發明還提供一種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢 測試劑盒，包括上述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引 物、探針組合物，以及阿膠DNA提取液和多重巢式熒光PCR反應所需試劑。
[0043] 優選的，還包括驢、馬、牛和豬陽性標準品、陰性對照品和空白對照品。
[0044] 優選的，所述多重巢式熒光PCR反應所需試劑包括:多重巢式熒光PCR反應緩沖液2 X qPCRMaster Mix，Taq熱啟動酶，鎂離子濃度2. OmM，4種dNTP的終濃度各為200μΜ，Tris-H2S04pH 9.0終濃度各為300mM，終濃度為600mM的KC1，終濃度為5M/L的甜菜堿和超純水;所 述試劑盒優先選用20μ1的PCR擴增體系，2XqPCRMaster Mix 10μ1，外側引物對ΙΟμΜ取ΙμL， 內側引物對1〇μΜ取ΙμL，探針用量Ρ1 (驢）、Ρ3(牛)和Ρ4(馬）終濃度0.25uM，P2豬探針終濃度 為0.5-luM，DNA用量l-50ngAU取2μ1，用雙蒸水補足20μ1。
[0045] 優選的，所述試劑盒的PCR擴增步驟為兩步:第一步反應優先擴增外側引物，反應 條件為95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒光信號，10個循環;第二步反應優先擴增 內側引物，反應條件為95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環。
[0046] 本發明另提供一種鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量PCR 檢測方法，包括以下步驟：
[0047] (1)提取待測樣品DNA;
[0048] (2)使用上述引物、探針組合物或試劑盒進行兩步PCR擴增:第一步反應驢、馬、牛 和豬源性通用外側引物優先擴增，反應條件為95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒 光信號，10個循環;第二步反應驢、馬、牛和豬源性通用內側引物優先擴增，反應條件為95 °C 10s，60°C，35s，在此收集熒光信號，40個循環；
[0049 ] (3)設立陽性對照、陰性對照及空白對照；
[0050] (4)根據不同探針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、牛和豬 源性成分。
[0051] 優選的，所述多重巢式實時熒光定量PCR檢測是將多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛 和豬源性通用內、外側引物以及驢、馬、牛和豬特異性探針放入同一反應體系中共同擴增， 無需開管。
[0052]優選的，所述PCR擴增為擴增階段反應需在至少5通道型號的熒光定量PCR儀上進 行，根據不同型號的定量PCR儀的不同要求可以對標記熒光素進行相應的調整。
[0053]本發明再提供上述引物、探針組合物或試劑盒在鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成 分中的應用。
[0054]本發明多重巢式實時熒光定量PCR檢測方法，具體包括以下步驟：
[0055] (1)阿膠中核酸提取利用專利CN. 201410317118阿膠DNA提取技術提取核酸DNA，在 此不再贅述。
[0056] (2)靶基因的選擇與引物設計：相比基因組而言，線粒體在組織中拷貝數高，而且 阿膠經過深度加工后破壞程度相對小，所以優先選用線粒體16SrDNA基因。設計驢和豬通用 外側引物及內側引物。見表1.
[0057] (3)設計構建含有陽性擴增內標DNA的重組質粒，并設計相應的TaqMan探針(如SEQ ID N0.9所示），其方法為:使用DNA隨機生成軟件產生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后 沒有出現與之同源的DNA片段，在這段隨機DNA序列上游5 '端連接上驢、馬、牛和豬源性通用 外側上游引物（如SEQ ID NO. 1所示），下游3'端驢、馬、牛和豬源性通用外側下游引物序列 (如SEQIDN0.2所示），從而形成lllbp的陽性擴增內標DNA序列（如SEQIDN0.10所示），將 這段擴增內標序列委托人工基因合成，合成片段連接載體PMD18-T，轉化感受態DH5a，質粒 提取，并測序驗證，得到能與驢、馬、牛和豬源性共用一對特異性引物(如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示），從而構建陽性內標DNA的重組質粒。
[0058] 表1.引物探針序列
[0059]
[0060] (3)使用上述試劑盒進行巢式實時熒光PCR檢測，是將內外側引物及探針放入同一 反應體系中共同擴增，無需開管，避免污染。PCR反應體系見表2。
[0061] 表2多重巢式熒光PCR反應體系
[0062]
[0063] (4)PCR擴增條件為兩步法:95°C lOmin;95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒光信號，10 個循環;95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環。
[0064] (5)結果分析:每次試驗設立陽性對照、陰性對照及空白對照，試驗結束后打開分 析軟件，分析實驗結果，給出A Rn(第η個循環時的熒光增加值)與擴增曲線Ct值，根據不同 探針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、牛和豬源性成分。
[0065] 本發明與現有的檢測技術相比其有益效果在于：
[0066] 迷你巢式實時熒光多重PCR(Mini-NEST_Multiple qPCR)檢測技術原理:是一種改 良后的巢式PCR技術結合TaqMan探針法的多重實時熒光PCR檢測技術，是在一段200_250bp 左右的待擴增靶序列上設計外側、內側兩對引物，在內側靶序列上設計TaqMan探針，然后內 外側引物及探針同時放入熒光定量PCR反應液中，在熒光定量PCR儀上進行熱循環反應，使 內外側引物同時引導新鏈合成，獲得由外-外，內-內，內-外，外-內組合的聚合酶鏈式反應 產物，大大提高擴增效率，結合物種特異性TaqMan熒光探針，實現了熒光信號的放大積累與 PCR產物形成完全同步檢測。該技術整合了巢式PCR與熒光定量PCR的優勢特點，不僅大大提 高了檢測靈敏度，閉管操作降低污染，提高了準確性和結果的真實可靠性。特別適用于深度 加工制品導致DNA降解及痕量DNA檢材領域研究。本發明提供了一種巢式多重熒光PCR (Multiple nested fluorescence PCR)檢測技術同時鑒別阿膠中是否含有驢源、豬源性動 物源性成分，該方法有以下優點：
[0067] (1)鑒于阿膠為深度加工制品，DNA破壞性程度大、本發明在靶基因選擇上優先選 用線粒體基因其原因在于拷貝數相對基因組高，環狀結構相對線性基因組更穩定的特點， 因此大大提尚檢測靈敏度；
[0068] (2)本發明針對阿膠中微量DNA或降解DNA，采用mini -NEST-qPCR技術，通過巢式 PCR及小片段擴增技術，大大提高了引物及探針有效識別靶點的幾率，因此大大提高檢測準 確性和靈敏度。
[0069] (3)本發明采用mini-NEST-qPCR，閉管操作、污染率低、檢測靈敏度高、特異性好、 準確度高、通量大等有益效果。
【附圖說明】
[0070] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0071] 圖l，J〇E熒光修飾驢源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出驢源性成分； [0072]圖2，FAM熒光修飾牛源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出牛源性成分； [0073]圖3，CY3熒光修飾豬特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出豬源性成分；圖4， R0X熒光修飾馬特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出馬源性成分；
[0074]圖5, J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異探針和CY3熒光修飾豬特異探 針同時有擴增曲線時，說明樣本同時檢出驢、牛和豬源性成分；
[0075]圖6，J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異探針同時有擴增曲線時，說明 為樣本同時檢出驢和馬源性成分；
[0076]圖7，FAM熒光修飾牛源性特異探針和CY3熒光修飾豬特異探針同時有擴增曲線時， 說明為樣本同時檢出牛和豬源性成分；
[0077]圖8,為試劑盒驢源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為O.lpg;
[0078] 圖9,為試劑盒豬源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為O.lpg;
[0079] 圖10,為試劑盒馬源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為o.lpg;
[0080] 圖11，為試劑盒牛源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為o.lpg。
【具體實施方式】
[0081] 以下結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應該理解為對本發明的限 制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換， 均屬于本發明的范圍。除非特別說明，本發明采用的除引物、探針之外的試劑、方法和設備 為本領域常規試劑、方法和設備。除非特別說明，本發明使用的試劑和試劑盒均為市購。
[0082] 1.下列實施例中，所用實驗材料、試劑與儀器如下：
[0083] 實驗材料：
[0084] 牛、豬、馬、驢、駱駝、牦牛、山羊、綿羊、兔、魚、雞、鴨、狗、水貂及狐貍等動物皮張或 新鮮組織，阿膠不同廠家不同生產批次20份，均為濟南市購。
[0085]所用試劑：
[0086] 動物組織提取試劑盒為OMEGA品牌。DNA分子量MakerDLlOOO、電泳上樣緩沖液等 PCR反應試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。引物與探針由生工生物工程(上海)有限公 司負責合成。2 XTaqMan Master Mix為DBI Bioscience品牌。DNA測序由山東省農業科學院 生物技術中心測序中心完成。
[0087] 所用儀器:ABI 7500熒光定量PCR儀為ABI公司產品，Takara PCR儀為寶生物工程 (大連)有限公司產品。5424D型高速離心機為Eppendorf公司產品。
[0088] 實施例1
[0089] 基于阿膠樣品DNA提取:采用專利201410317118.7(-種從阿膠中快速提取DNA的 試劑盒及其提取方法）中公開的方法進行提取，步驟不再贅述，提取的基因組DNA經紫外分 光光度計測定其純度和濃度。測定0D260/0D280值均為1.8-1.9左右，濃度在lOng/μΙ以上， 說明DNA純度較高，濃度適中，符合PCR擴增要求。
[0090] 1、靶基因的選擇與引物設計:相比基因組而言，線粒體在組織中拷貝數高，而且阿 膠經過深度加工后破壞程度相對小，所以優先選用線粒體16SrDNA基因。設計驢和豬通用外 側引物及內側引物，擴增片段小，使引物與靶點更容易結合。引物探針序列見表1.
[0091] 2、多重巢式熒光檢測試劑盒的設計:該試劑盒包括上述驢和豬通用外側引物及內 側引物組合物，驢和豬特異探針混合物，2 X qPCRMaster Mix(由Taq熱啟動酶、鎂離子濃度 2.5禮、4種(1犯13的終濃度各為25(^1、1^8-!12304?!19.0、甜菜堿3%和超純水組成），此外還 包括驢和豬陽性標準品、陰性對照品（其他源性DNA)和空白對照(雙蒸水）。
[0092] 使用上述試劑盒進行多重巢式實時熒光PCR檢測，是將內外側引物及探針放入同 一反應體系中共同擴增，無需開管，避免污染。PCR反應體系20yL見表2。
[0093] 3、PCR擴增條件為兩步法:95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒光信號，10 個循環;95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環。
[0094] 4、結果分析:每次試驗設立陽性對照、陰性對照及空白對照，試驗結束后打開分析 軟件，分析實驗結果，給出A Rn(第η個循環時的熒光增加值)與擴增曲線Ct值，根據不同探 針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、豬和牛源性成分。結果見附圖1， JOE熒光修飾驢源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出驢源性成分，圖2，FAM熒光 修飾牛源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出牛源性成分，圖3，CY3熒光修飾豬特 異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出豬源性成分;圖4，R0X熒光修飾馬特異探針有擴增 曲線時，說明待檢樣本檢出馬源性成分;圖5，J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異 探針和CY3熒光修飾豬特異探針同時有擴增曲線時，說明樣本同時檢出驢、牛和豬源性成 分；圖6，J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異探針同時有擴增曲線時，說明為樣本 同時檢出驢和馬源性成分；圖7，FAM熒光修飾牛源性特異探針和CY3熒光修飾豬特異探針同 時有擴增曲線時，說明為樣本同時檢出牛和豬源性成分。
[0095]實施例2試劑盒特異性驗證
[0096]利用本發明提供的檢測試劑盒，分別以牛、豬、馬、驢、駱駝、牦牛、山羊、綿羊、兔、 魚、雞、鴨、水貂及狐貍等動物皮張或新鮮組織提取基因組DNA為模板，按照上述方法進行多 重巢式實時熒光PCR檢測，驗證本試劑盒的特異性。檢測結果見表5,只有驢、豬、馬和牛的基 因組DNA被檢出，其余動物源性均未檢出，說明本試劑盒檢測方法具有很好的特異性。
[0097] 表3特異性驗證
[0098]
[0099]
[0100] 實施例3靈敏度實驗
[0101] 將驢、豬、馬和牛基因組DNA分別定量到5X10-2ng/yl，5pgAU和0.5pgAU，(h05pg/ μL，0.005pgAU每個PCR反應分別加入驢、馬、牛和豬不同濃度的DNA為模板，加量為2μ1，即 DNA含量分別為0 · lng，0 · Olng，lpg，0 · lpg，0 · Olpg，按照上述PCR體系及檢測方法進行擴增， 結果見圖8至圖11，從圖中可以看出，本發明檢測限為O.lpg，檢測靈敏度到皮克級，相對普 通巢式PCR擴增檢測靈敏度提高了 1000倍。
[0102] 實施例4實際樣品檢測應用
[0103] 市售樣本40份，不同品牌廠家及不同生產批次樣本，按照本發明提供的檢測方法， 提取DNA，進行多重巢式實時熒光PCR檢測，見表6，其中18份樣本檢出驢源性成分，11份樣本 同時檢出驢和馬源性成分，6份樣本同時檢出驢和豬源性成分，5份樣本未檢出驢、馬、牛和 豬源性成分，說明本發明提供的檢測方法具有很好的應用價值。
[0104] 表4實際樣品檢測
[0105]
[0106] 上述雖然結合實施例對本發明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發明保護 范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員 不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。
【主權項】
1. 一種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引物、探針組 合物，其特征在于，包括： (1) 多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用外側引物，其核苷酸序列如下： 正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA 3'，如SEQ N0.1 所示； 反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQN0·2所示； (2) 多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用內側引物，其核苷酸序列如下： 正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQN0.3所示 ； 反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQN0·4所示； (3) 驢特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'JnSEQN0.5K* ; (4) 馬特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG3'JnSEQN0.6K* ; (5) 牛特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC3'JnSEQN0.7K* ; (6) 豬特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'CCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'JnSEQN0.8K*; 其中，所述驢、馬、牛和豬特異性探針的5 '端修飾有報告基團，3 '端修飾有淬滅基團，所 述報告基團為?41、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8闕1、8即2中 的任一種。2. 根據權利要求1所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR 檢測引物、探針組合物，其特征在于，還包括內標質控體系，所述內標質控體系包括質控體 系引物、質控體系探針和質控體系序列，各核苷酸序列如下： (1) 質控體系引物： 上游引物序列如SEQ NO. 1所示，下游引物如SEQ NO.2所示； (2) 質控體系探針： CntP: 5 ' TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3 '，如SEQ NO · 9所示； (3) 質控體系序列： CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTC CATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如 SEQ NO · 10所示； 其中，質控體系探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述報告基團為 卩八1、冊乂、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8即1、8即2中的任一種。3. -種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測試劑盒，其特 征在于，包括權利要求1或2所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光 PCR檢測引物、探針組合物，以及阿膠DNA提取液和多重巢式熒光PCR反應所需試劑。4. 根據權利要求3所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR 檢測試劑盒，其特征在于，還包括驢、馬、牛和豬陽性標準品、陰性對照品和空白對照品。5. 根據權利要求3或4所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光 PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述多重巢式熒光PCR反應所需試劑包括:多重巢式熒光PCR 反應緩沖液2 X qPCRMaster Mix，Taq熱啟動酶，鎂離子濃度2. OmM，4種dNTP的終濃度各為 200μΜ，Tris-H2S04pH 9.0，終濃度為600mM的KCl，終濃度為5M/L的甜菜堿和超純水;所述試 劑盒為20ylPCR反應擴增體系：2XqPCRMaster Mix ΙΟμΙ，外側引物對ΙΟμΜ取ΙμL，內側引物 對ΙΟμΜ取ΙμL，探針用量驢、牛和馬終濃度各0.25uM，P2豬探針終濃度為0.5-luM，DNA用量1-50ngAU取2μ1，用雙蒸水補足20μ1。6. 根據權利要求5所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR 檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的PCR擴增步驟為兩步:第一步反應優先擴增外側引 物，反應條件為95°C IOmin; 95°C IOs，70°C，35s，在此收集熒光信號，10個循環;第二步反應 優先擴增內側引物，反應條件為95 °C IOs，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環。7. -種鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量PCR檢測方法，其特 征在于，包括以下步驟： (1) 提取待測樣品DNA; (2) 使用權利要求1或2所述引物、探針組合物或權利要求3-6任一項所述試劑盒進行兩 步PCR擴增:第一步反應驢、馬、牛和豬源性通用外側引物優先擴增，反應條件為95 °C IOmin; 95°C IOs，70°C，35s，在此收集熒光信號，10個循環;第二步反應驢、馬、牛和豬源性通用內側 引物優先擴增，反應條件為95 °C IOs，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環； (3) 設立陽性對照、陰性對照及空白對照； (4) 根據不同探針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、牛和豬源性 成分。8. 根據權利要求7所述鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量PCR 檢測方法，其特征在于，所述多重巢式實時熒光定量PCR檢測是將多重巢式熒光PCR檢測驢、 馬、牛和豬源性通用內、外側引物以及驢、馬、牛和豬特異性探針放入同一反應體系中共同 擴增，無需開管。9. 根據權利要求7或8所述鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量 PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增為擴增階段反應需在至少5通道型號的熒光定量 PCR儀上進行。10. 權利要求1或2所述引物、探針組合物或權利要求3-6任一項所述試劑盒在鑒別阿膠 中驢、馬、牛和豬源性成分中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105907852SQ201610272771
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】張全芳, 劉艷艷, 范陽陽, 步迅
【申請人】山東省農業科學院生物技術研究中心