一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法及其試劑盒的制作方法

一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法，其中包括如下特征：構建成干擾素γ信號肽和腫瘤細胞結合多肽并鏈接可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞，高表達新的多肽?可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性，同時細胞因子誘導殺傷細胞增殖倍數達到1000倍以上，表達CD3+/CD56+為40％以上，CD16+為30％以上，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性；本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的自體細胞因子誘導殺傷細胞增殖培養的試劑盒，具有高效的抗腫瘤功能。
【專利說明】
一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法及其試劑盒
技術領域
[0001]本發明涉及一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法，其中包括如下特征:構建成干擾素γ信號肽(Interferon γ signal peptide，IFN γ-SP)和腫瘤細胞結合多肽(Tumor cells binding peptide，TCBP)并鏈接可結晶片段域(Fragment crystal I izable domain，Fe)重鏈的第2和3恒定區(second and thirdconstant domain，Ch2and Ch3)基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞(Cytokine-1nduced killer cells，CIK)，高表達新的多肽-可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性;本發明還提供了一種含通過上述方法而得到的自體細胞因子誘導殺傷細胞增殖培養的試劑盒，具有高效的抗腫瘤功能。
【背景技術】
[0002]細胞因子誘導殺傷細胞(Cytokines-1nduced Killer cells，CIK)是目前在國內進行臨床治療常見的免疫細胞技術。目前CIK細胞主要通過干擾素γ、抗CD3單抗和白介素2等共同誘導作用獲得的，表達CD3+/CD56+雙陽性細胞。其抗腫瘤主要機制為釋放顆粒酶和穿孔素直接殺死腫瘤細胞，以及通過凋亡配體作用引起腫瘤細胞的凋亡作用。
[0003]然而，CIK細胞在臨床上治療惡性腫瘤方面療效還非常有限，根據臨床治療數據統計包括腫瘤完全消失的完全緩解、腫瘤部分縮減的部分緩解和腫瘤未增大的疾病穩定在內的有效率在10-20%之間，還遠遠不能滿足臨床治療惡性腫瘤的需要。影響CIK細胞治療癌癥的效果的關鍵問題是CIK細胞數量、表型高低和殺傷功能。提高CIK細胞數量和CD3+/CD56+表型，均能有效提高其治療癌癥的有效率，已有一些臨床單位通過提高CIK細胞數量和CD3+/⑶56+表型來增強癌癥治療效果。
[0004]本發明提供了以干擾素γ信號肽和腫瘤細胞結合多肽并鏈接可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞，高表達新的多肽-可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，其CD3+/CD56+表型顯著提高并表達CD 16分子，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性，增殖倍數達1000倍以上，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性，將顯著提高臨床療效和延長患者生存期。

【發明內容】

[0005]本發明針對現有增殖培養CIK細胞技術的不足，特別是因CIK細胞培養獲得臨床治療需要的細胞表型較低，以及單純依賴釋放顆粒酶和穿孔素殺傷腫瘤的作用特異性低與殺傷效果力度有限，因而造成殺瘤活性低和大多數惡性腫瘤治療不佳。本發明通過前期研究實驗發現通過干擾素γ信號肽引導，將含腫瘤細胞結合多肽和可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段融合蛋白導入腫瘤細胞，有助于腫瘤細胞結合多肽結合腫瘤細胞，并錨定可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段在腫瘤細胞胞膜外，與細胞因子誘導殺傷細胞表達CD16分子結合激活抗體依賴性的細胞毒性活性，增強了對腫瘤細胞殺傷活性與臨床治療療效。
[0006]抗體依賴性的細胞毒性活性(Antibody-dependentcellular cytotoxicity,ADCC)是單克隆抗體臨床療效中關鍵的效應子功能，通過固有免疫細胞表達的Fcy受體與抗體Fe域結合而引發的抗腫瘤作用，例如自然殺傷細胞和巨噬細胞。CIK是一種自然殺傷細胞樣的免疫細胞，在臨床上大量應用于治療惡性腫瘤，通過其表達腫瘤細胞多肽和人免疫球蛋白Gl的Fe域，利用發現的腫瘤細胞結合多肽可以錨定在腫瘤細胞膜上，其鏈接的Fe域Ch2和Ch3暴露在細胞膜外，可以與CIK表達的⑶16分子結合，從而產生特異性的ADCC作用，可產生對腫瘤細胞最佳的殺傷活性。
[0007]本發明涉及一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法，其特征在于，構建成干擾素γ信號肽和腫瘤細胞結合多肽并鏈接可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞，高表達新的多肽-可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性;激活細胞因子誘導殺傷細胞增殖倍數達到1000倍以上，其表達⑶3+/CD56+為40%以上，以及CD16+為30%以上，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性;培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒載體的CIKs其表達SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未轉染的CIKs為100倍以上;蛋白印跡技術檢測其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表達水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒轉染的CIKs培養上清中其灰度高于2000以上。
[0008]本發明所述新的多肽-可結晶片段域重組基因由干擾素γ信號肽、腫瘤細胞結合多肽和可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段構成，干擾素γ信號肽引導融合蛋白導入腫瘤細胞，有助于腫瘤細胞結合多肽結合腫瘤細胞，并錨定可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段在腫瘤細胞胞膜外，與細胞因子誘導殺傷細胞表達CD16分子結合激活抗體依賴性的細胞毒性活性。
[0009]為了提高腫瘤細胞結合多肽對腫瘤細胞受體的識別和結合，本發明所述腫瘤細胞結合多肽，優選地，鏈接兩個或兩個以上腫瘤細胞結合多肽，可以是同樣的或者不同的腫瘤細胞結合多肽。針對不同的腫瘤，腫瘤細胞結合多肽也不同，例如前列腺癌為與前列腺特異抗原特異結合的多肽，乳腺癌的為與乳腺癌人表皮生長因子受體-2特異結合的多肽，肝癌的為與甲胎蛋白特異結合的多肽、肺癌和腸癌等為與癌胚抗原特異結合的多肽等。
[0010]本發明所述可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段，優選地，該片段中第24個絲氨酸突變為天冬氨酸和第117個異亮氨酸突變為谷氨酸，突變的可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段與CD16分子具有更強親和性。
[0011]本發明所述方法中細胞因子誘導殺傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核細胞。優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新鮮外周血或骨髓。
[0012]本發明所述將人IFNy-SP、多個TCBP和Fc-D/E基因序列通過化學合成獲得，在兩個TCBP之間以及TCBP和Fc-D/E之間均引入連接多肽，其基因序列為GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFN γ -SP、(TCBP)2和Fc-D/E的cDNA，SPSP-(TCBP)n-L-Fc。
[0013]培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒載體的CIKs其表達SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未轉染的CIKs為100倍以上。蛋白印跡技術檢測其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表達水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒轉染的CIKs培養上清中其灰度高于2000以上。
[0014]本發明所述方法中來源30ml外周血單個核細胞誘導培養獲得細胞因子誘導殺傷細胞，增殖倍數達1000倍以上，培養到21天細胞因子誘導殺傷細胞數達3 X 19以上。
[0015]本發明所述方法中培養獲得細胞因子誘導殺傷細胞，高表達其特異標志物⑶3+/⑶56+，陽性率高于40%以上，CD16+陽性率超過30%以上，所述的細胞因子誘導殺傷細胞引發抗體依賴性的細胞毒性活性，體內體外試驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。
[0016]本發明使用的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基或RPMI1640培養基加入5-500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和 10_2000IU/mlIL-2和10 % (體積比)自體血清或胎牛血清，優選地，細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基，如CellGro SCGM、AIM_V、X_VIVO和GT-T551 等，含有5_500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18,
l-500ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2。
[0017]本發明還提供了一種制備介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:
[0018](I)獲得上述的穩定表達SP-(TCBP)n-L-Fc的病毒載體；
[0019](2)CIK細胞因子，包括IFN-γ、IL-15、IL-18、鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和IL-2;
[0020](3)淋巴細胞培養基，包括RPMI 1640和無血清培養基；
[0021](4)淋巴細胞分離液；
[0022](5)生理鹽水；
[0023](6)使用說明書；
[0024]其中，所述使用說明書包括上述的方法。
[0025]本發明還提供了上述方法及其試劑盒制備CIK細胞，可用于各類癌癥包括實體瘤和血液腫瘤在內的多個療程的免疫治療。
【附圖說明】
[0026]圖1表示為構建的多肽-可結晶片段域融合蛋白示意圖；
[0027]圖2表示為實施例二制備的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞后培養到21天后的表達水平；
[0028]圖3表示為蛋白印跡技術檢測實施例二制備的SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白在SP-(TCBP) 2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞中培養上清表達水平；
[0029]圖4表示為實施例二制備的前列腺癌患者SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞流式細胞檢測；
[0030]圖5表示為實施例二制備的晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞對PC-3的殺傷活性；
[0031]圖6表示為實施例二制備的晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞對MCF-7的殺傷活性；
[0032]圖7表示為荷人前列腺癌PC-3SCID鼠模型CIK細胞治療完之后腫瘤大小變化曲線。
【具體實施方式】
[0033]本發明發現干擾素γ信號肽和腫瘤細胞結合多肽并鏈接可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區的基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞，高表達新的多肽-可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性;激活細胞因子誘導殺傷細胞增殖倍數達到1000倍以上，其表達⑶3+/CD56+為40%以上，以及CDl6+為30 %以上，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性。
[0034]對本發明涉及的一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法進行具體說明。
[0035]本發明涉及一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法，其特征在于，構建成干擾素γ信號肽和腫瘤細胞結合多肽并鏈接可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞，高表達新的多肽-可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性;激活細胞因子誘導殺傷細胞增殖倍數達到1000倍以上，其表達⑶3+/CD56+為40%以上，以及CDl6+為30 %以上，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性。
[0036]本發明所述新的多肽-可結晶片段域重組基因由干擾素γ信號肽、腫瘤細胞結合多肽和可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段構成，干擾素γ信號肽引導融合蛋白導入腫瘤細胞，有助于腫瘤細胞結合多肽結合腫瘤細胞，并錨定可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段在腫瘤細胞胞膜外，與細胞因子誘導殺傷細胞表達CD16分子結合激活抗體依賴性的細胞毒性活性。
[0037]本發明所述腫瘤細胞結合多肽，優選地，鏈接兩個或兩個以上腫瘤細胞結合多肽，可以是同樣的或者不同的腫瘤細胞結合多肽。針對不同的腫瘤，腫瘤細胞結合多肽也不同，例如前列腺癌為與前列腺特異抗原特異結合的多肽，乳腺癌為與乳腺癌人表皮生長因子受體-2的多肽，肝癌的為與甲胎蛋白特異結合的多肽、肺癌和腸癌等為與癌胚抗原特異結合的多肽。
[0038]本發明所述可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段，優選地，該片段中第24個絲氨酸突變為天冬氨酸和第117個異亮氨酸突變為谷氨酸，突變的可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段與CD16分子具有更強親和性。
[0039]將人IFNy-SP、多個TCBP和Fc-D/E基因序列通過化學合成獲得，在兩個TCBP之間以及TCBP和Fc-D/E之間均引入連接多肽，其基因序列為GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFN γ -SP、(TCBP) 2和Fc-D/E的cDNA，即 SP-(TCBP)n-L-Fc ；
[0040]將SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pUC229載體HindIII/BamHI雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合SP-(TCBP)n-L-Fc大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置-80°C超低溫冰箱中長期保存；
[0041]將SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體HindIII/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；
[0042]取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6 X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-ΜΕΜ培養液；取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5mlOpt1-ΜΕΜ中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine200(^pAl.5ml Opt1-ΜΕΜ中，輕輕混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和I ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min ；混合液緩慢滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37°C、5 %CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入1ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄；緩慢加入含10%血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5%⑶2培養箱內繼續培養48-72h；
[0043]根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心lOmin，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱。
[0044]本發明所述方法中細胞因子誘導殺傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核細胞。優選地，來源于癌癥患者手術一個月后、放化療一個月后采集的新鮮外周血或骨髓。
[0045]采集來源于患者自體外周血，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核細胞后，用RPMI 1640培養基重懸并稀釋到2-5 X 16細胞/ml，并補充1000活性單位(IU)/ml IFN-γ和10 %自體血清，每20ml加入到75cm2培養瓶中，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養24h ； 24小時后加入5-500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2，于37°C、含5%⑶2培養箱內培養2天。第3天補充含5-500ng/ml IL_15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和 10_2000IU/ml IL-2和 10% 自體血清的RPMI 1640培養基，繼續培養到第5天。第5天離心收獲CIK細胞，并通過苔盼蘭計數。
[0046]第5天以3 X 16細胞/ml CIK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養過夜。第6天將20μ1 lE+7TU/ml重組bng慢病毒加入到人CIK的六孔培養板中，體系為2 m I，混勻，3 7 °C、5 %⑶2的培養箱中孵育8 -12個小時后，更換完全培養液R P MI16404ml，所述完全培養液含10-2000IU/ml IL-2和10%自體血清；當CIK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，轉入75cm2培養瓶中生長，6孔對應I個培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到50ml培養體系;于37°C、含5%C02培養箱內培養到第15-21天，期間根據CIK細胞密度和培養基顏色變化補充含10-2000IU/ml IL-2和10%自體血清新鮮完全培養液RPMI 1640，并擴瓶到175cm2培養瓶中或轉移到1.5L培養袋中生長。
[0047]培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了SP-(TCBP)n-L-Fc病毒載體的CIKs其表達SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未轉染的CIKs為100倍以上。蛋白印跡技術檢測其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表達水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒轉染的CIKs培養上清中其灰度高于2000以上。
[0048]本發明所述方法中來源30ml外周血單個核細胞誘導培養獲得細胞因子誘導殺傷細胞，增殖倍數達1000倍以上，培養到21天細胞因子誘導殺傷細胞數達3 X 19以上。
[0049]本發明所述方法中培養獲得細胞因子誘導殺傷細胞，高表達其特異標志物CD3+/⑶56+，陽性率高于40%以上，CD16+陽性率超過30%以上，所述的細胞因子誘導殺傷細胞引發抗體依賴性的細胞毒性活性，體內體外試驗具有很強抗腫瘤殺傷毒性。
[0050]本發明還提供了一種制備介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括；
[0051](I)獲得上述的穩定表達SP-(TCBP)n-L-Fc的病毒載體；
[0052](2)CIK細胞因子，包括IFN-γ、IL-15、IL-18、鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和IL-2;
[0053](3)淋巴細胞培養基，包括RPMI 1640和無血清培養基；
[0054](4)淋巴細胞分離液；
[0055](5)生理鹽水；
[0056](6)使用說明書；
[0057]其中，所述使用說明書包括上述的方法。
[0058]作為本發明CIK細胞擴增培養中使用的細胞培養板、細胞培養皿、培養瓶、細胞培養袋，可例舉，為75cm2細胞培養瓶、175cm2細胞培養瓶、250mL細胞培養袋等細胞培養用器材(容器)，均可用于本發明，優選細胞培養袋。
[0059]本發明的制造方法中對CIK細胞進行凍存，對凍存液無特殊限制，但優選例如為50 %小牛血清、40 %細胞培養液和10 % 二甲基亞砜，其中細胞培養液更優選為CIK細胞培養液。
[0060]在培養基中可以添加血清或血漿進行培養。它們在培養基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根據不同的培養階段而改變血清或血漿的用量，優選為5% (體積比)。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的來源，可以是自己(意味著與所培養的細胞來源相同)或非自己(意味著與所培養的細胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點出發，優選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經分離純化的血清成分。
[0061]本發明的自體CIK細胞增殖的制備使用上述各種成分及培養基來實施。本發明中使用的培養培養條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細胞培養中使用的條件。例如，可在37°C、5%C02等條件下培養。還可以實施如下等操作:間隔適當的時間添加新鮮培養基來稀釋細胞培養液，或更換培養基，或更換細胞培養用器材等。
[0062]本發明還提供CIK細胞在臨床應用中多次的抗腫瘤治療，更好地在生物體內發揮抗腫瘤免疫應答，達到很好的治療效果。此外，上述CIK細胞還具有如下優點，多次CIK細胞治療將更好地引發CIK細胞殺瘤活性，抑制調節性T淋巴細胞免疫抑制活性，產生高效、長效地抗腫瘤免疫效應，因此非常利于患者療效的提高和生存期的延長。
[0063]以下，結合實施例對本發明做更具體的描述，但本發明不限于此。
[0064]實施例一
[0065]重組SP-(TCBP)2-L-Fc基因構建及其慢病毒的制備
[0066]該新的多肽-可結晶片段域重組基因由干擾素γ信號肽、兩個腫瘤細胞結合多肽和可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段構成，可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段，第24個絲氨酸突變為天冬氨酸和第117個異亮氨酸突變為谷氨酸，S卩Fc-D/E，見圖1，即多肽-可結晶片段域融合蛋白示意圖。
[0067]將人IFNy -SP、2個TCBP和Fc-D/E基因序列通過化學合成獲得，在兩個TCBP之間以及TCBP和Fc-D/E之間均引入連接多肽，其基因序列為GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFN γ -SP、( TCBP) 2和Fc-D/E的 cDNA，即 SP- (TCBP) 2-L-Fc ；
[0068]將SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pUC229載體HindIII/BamHI雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定;PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合SP-(TCBP)2-L-Fc大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C培養過夜，用北京天根生物無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置-80 0C超低溫冰箱中長期保存;所述SP-( TCBP) 2-L-Fc大小為858bp;
[0069]將SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體HindIII/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；
[0070]取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6 X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-ΜΕΜ培養液；取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5mlOpt1-ΜΕΜ中，輕輕混勻，取36μ1 lipofectamine200(^pAl.5ml Opt1-ΜΕΜ中，輕輕混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和I ipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min ；混合液緩慢滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37°C、5 %CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入1ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄;緩慢加入含10 %血清的細胞培養基20ml，于37°C、含5 % CO2培養箱內繼續培養72h。
[0071]根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心lOmin，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，輕輕反復吹打重懸;經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80°C超低溫冰箱，即制備成了 SP-(TCBP) 2-L-Fc 慢病毒。
[0072]實施例二
[0073]介導抗體依賴性細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備
[0074]采集晚期前列腺癌和乳腺癌患者30ml自體外周血(與其簽署知情同意書)，加入等量I X PBS稀釋，沿離心管管壁輕輕疊加于淋巴細胞分離液上，形成明顯界面，室溫下2000rpm離心20min，吸取界面層的PBMC，用I X PBS(pH值為7.4)洗滌兩次。苔盤蘭計數后，用RPMI 1640培養基重懸并稀釋到3 X 16細胞/ml，并補充1000活性單位(IU)/ml IFN-γ和10 %自體血清，每20ml加入到75cm2培養瓶中，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養24h ； 24小時后加入50ng/ml IL_15、50ng/ml IL_18，20ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和500IU/ml IL-2,于37°C、含5%⑶2培養箱內培養2天。第3天補充含50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-18,20ng/ml0KT3和500IU/ml IL_2和10%自體血清的RPMI1640培養基，繼續培養到第5天。第5天離心收獲CIK細胞，并通過苔盼蘭計數。
[0075]第5天以3 X 16細胞/ml CIK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養過夜。第6天將20μ1 lE+7TU/ml重組SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培養板中，體系為2ml，混勻，37°C、5 %⑶2的培養箱中孵育8-12個小時后，更換完全培養液RPMI 1640 4ml，所述完全培養液含500IU/ml IL-2和10%自體血清；當CIK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，轉入75cm2培養瓶中生長，6孔對應I個培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到50ml培養體系;于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養到第21天，期間根據CIK細胞密度和培養基顏色變化補充含500IU/ml IL-2和10%自體血清新鮮完全培養液RPMI 1640，并擴瓶到175cm2培養瓶中或轉移到1.5L培養袋中生長。轉染晚期前列腺癌患者CIK的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒中TCBP為與前列腺特異抗原特異結合的多肽基因序列，轉染晚期乳腺癌患者CIK的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒中的為與乳腺癌人表皮生長因子受體-2特異結合的多妝基因序列。
[0076]圖2為SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞后培養到21天后其的表達水平。在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書(美國Invitrogen公司)檢測，培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了SP-(TCBP)2-L-Fc病毒轉染晚期前列腺癌和乳腺癌患者的CIKs其表達SP-(TCBP)2-L-Fc基因分別高于未轉染的CIKs為125.1和112.34倍。ADPC-CIK為SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染的前列腺癌患者來源CIK細胞，ADBC-CIK為SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染的乳腺癌患者來源CIK細胞，BPC-CIK為空白慢病毒轉染的前列腺癌患者來源CIK細胞，BBC-CIK為空白慢病毒轉染的乳腺癌患者來源CIK細胞，PC-CIK為前列腺癌患者來源CIK細胞，BC-CIK為乳腺癌患者來源CIK細胞。
[0077]實施例三
[0078]介導抗體依賴性細胞毒性的CIK細胞蛋白印跡和流式細胞檢測
[0079]取實施例二制備的晚期前列腺癌、乳腺癌患者和正常健康人來源第15天培養獲得的CIK細胞上清各20yL，進行蛋白凝膠電泳。根據目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。待檢測蛋白樣品上樣量:20yg/孔。電泳條件:濃縮膠恒壓90V，約20分鐘;分離膠恒壓120V，通過標準分子量預染蛋白來確定電泳停止時間。濕轉法，轉膜條件:300mA恒流;0.45μπι孔徑PVDF膜，轉膜時間80分鐘。轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。封閉:將膜完全浸沒于5% (mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的轉膜緩沖液(含體積比3 %吐溫-20，TBST)中，室溫下水平搖床孵育I小時。一抗孵育:5 % (mg/mL)BSA-TBST稀釋生物素標記的兔抗人Fe多抗1:20000，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；4°C水平搖床孵育過夜。次日，洗膜:TBST洗3次，每次1分鐘。二抗孵育:5 % (mg/mL) BSA-TBST稀釋鏈霉親和素標記的辣根過氧化酶(HRP) 1:1000，室溫孵育40分鐘。洗膜:TBST洗膜3次，每次1分鐘。化學發光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反應3-5分鐘;膠片曝光:10秒-5分鐘(曝光時間隨不同光強度而調整)，顯影2分鐘，定影。
[0080]膠片用掃描儀掃描為大于300DPI的TIF格式圖片，使用QuantityOne分析軟件(B1-Rad公司)進行灰度分析，圖3為蛋白印跡技術檢測SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白在SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源CIK細胞中培養上清，以及SP-(1'0^)2-1^^融合蛋白大腸桿菌中表達水平(陽性對照)，即western blotting結果圖，灰度分析結果顯示SP-(TCBP)2-L-Fc灰度值的分別為2226、2036、2731、0和282。第I條帶為SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染晚期前列腺癌CIK培養上清，第2條帶為SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染晚期乳腺癌CIK培養上清，第3條帶為SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白大腸桿菌中表達，第4條帶為晚期前列腺癌CIK培養上清，第5條帶為晚期乳腺癌CIK培養上清。
[0081]取實施例二制備的晚期前列腺癌、乳腺癌患者和正常健康人來源第15天培養獲得的I X 16CIK細胞，進行流式抗體染色檢測分析。CIK細胞一組分別為20yL鼠抗人CD16-FITC、20yL鼠抗人CD56-PE和20yL鼠抗人CD3-PerCP;另一組分別為20yL鼠抗人CD3-FITC、20yL鼠抗人CD8-PE和20yL鼠抗人CD4-PerCP;同型對照組為20yL mIgGl_FITC、20yL mlgGl-PE和20yL mlgGl-PerCP;放置4°C冰箱染色30分鐘后用PBS洗滌3次，然后在FACS Calibur儀器(美國BD公司)上機檢測和分析。
[0082]圖4為實施例二制備的前列腺癌患者SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞流式細胞檢測，該CIK細胞⑶3和⑶56雙陽性率為43.79 %，CD16陽性率為37.39 % ;其中⑶3陽性率為95.98%;實施例二制備的乳腺癌患者和正常人SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞⑶3和⑶56雙陽性率均超過40%以上，CD16陽性率超過30%以上。而未轉染的CIK細胞⑶3和⑶56雙陽性率均在20 %左右，⑶16陽性率低于1 %以下。
[0083]實施例四
[0084]介導抗體依賴性細胞毒性的CIK細胞體外殺瘤試驗
[0085]分別以前列腺癌細胞系PC-3和乳腺癌細胞系MCF-7為靶細胞，以實施例二中制備的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞作為效應細胞，按效靶比40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1分別加入96孔培養板中，然后置于37 °C、5 %C02條件下培養4h，均設3個復孔。采用LDH細胞毒實驗法測定CIK活性:吸取上清液50yL，置于96孔板中，加入LDH基液50yL，室溫避光30min，加入50yL終止液終止反應，490nm波長處測吸光度(OD)值。按下列公式分別計算PC-3和MCF-7細胞的殺傷率:殺傷率=(實驗組OD值-效應細胞自然釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)X 100%。
[0086]圖5為晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞對PC-3的殺傷活性，隨著效靶比提高，細胞毒性活性也不斷提高，SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞殺傷PC-3殺傷毒性顯著高于SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染乳腺癌患者CIK細胞和未轉染的CIK細胞，P值分別為0.03和0.004。圖6為晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞對MCF-7的殺傷活性，隨著效靶比提高，細胞毒性活性也不斷提高，SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染乳腺癌患者CIK細胞殺傷MCF-7殺傷毒性顯著高于SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞和未轉染的CIK細胞，P值分別為
0.035 和0.002。
[0087]實施例五
[0088]介導抗體依賴性細胞毒性的CIK細胞體內殺瘤實驗中的作用
[0089]24只8周SCID裸鼠腹部側翼皮下注射5 X 16前列腺癌細胞系PC-3，飼養7天后，隨機分為A、B、C和D 4組，每組6只:A組為實施例二制備的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞治療組;B組為實施例二制備的空白慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞治療組;C組為實施例二制備的未轉染的前列癌患者CIK細胞治療組;D組為生理鹽水安慰劑組。A組在SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2 X 14細胞/克，B組在空白慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2X14細胞/克，C組在未轉染前列癌患者CIK細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2 X 14細胞/克，D組與A、B和C治療組同時間，尾靜脈注射同體積的生理鹽水，各lmL。治療后分別于7d、14d、21d、28d和35d拉頸處死，取荷前列腺癌PC-3SCID鼠模型腫瘤組織，計算鼠模型荷瘤大小。
[0090]圖7荷前列腺癌PC-3SCID鼠模型CIK細胞治療完之后腫瘤大小變化曲線，生理鹽水組C和ADPC-CIK治療組A、BPC-CIK治療組B與PC-CIK治療組C相比，治療組A、治療組B與治療組C中前列癌腫瘤大小縮少，但治療組A與治療組B與治療組C相比前列癌腫瘤大小縮少更為明顯，P值分別為0.013和0.011，表明SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染前列癌患者CIK細胞引發了強大的體內殺瘤活性。
【主權項】
1.一種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法，其特征在于，構建成干擾素γ信號肽(IFNy-SP)和腫瘤細胞結合多肽(TCBP)并鏈接可結晶片段域(Fe)重鏈的第2和3恒定區(Ch2 and Ch3)的基因片段，重組到病毒載體上并轉染人細胞因子誘導殺傷細胞(CIK); 其高表達新的多肽-可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區融合蛋白，可引發抗體依賴性的細胞毒性活性;激活細胞因子誘導殺傷細胞增殖倍數達到1000倍以上，其表達CD3+/CD56+為40 %以上，以及⑶16+為30 %以上，體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性； 培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了 SP-(TCBP)n-L-Fc病毒載體的CIKs其表達SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未轉染的CIKs為100倍以上;蛋白印跡技術檢測其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表達水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒轉染的CIKs培養上清中其灰度高于2000以上。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述新的多肽-可結晶片段域重組基因由干擾素γ信號肽、腫瘤細胞結合多肽和可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段構成，干擾素γ信號肽引導融合蛋白導入腫瘤細胞，有助于腫瘤細胞結合多肽結合腫瘤細胞，并錨定可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段在腫瘤細胞胞膜外，與細胞因子誘導殺傷細胞表達CD16分子結合激活抗體依賴性的細胞毒性活性;所述腫瘤細胞結合多肽，優選地，鏈接兩個或兩個以上腫瘤細胞結合多肽，可以是同樣的或者不同的腫瘤細胞結合多肽； 優選，針對前列腺癌腫瘤細胞，所述多肽為與前列腺特異抗原特異結合的多肽； 優選，針對乳腺癌腫瘤細胞，所述多肽為與乳腺癌人表皮生長因子受體-2特異結合的多肽； 優選，針對肝癌腫瘤細胞，所述多肽為與甲胎蛋白特異結合的多肽； 優選，針對肺癌或腸癌腫瘤細胞，所述多肽為與癌胚抗原特異結合的多肽。3.根據權利要求1至2中任一項所述的方法，其特征在于，所述可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段，優選地，該片段中第24個絲氨酸突變為天冬氨酸和第117個異亮氨酸突變為谷氨酸，即Fc-D/E，突變的可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段與CD16分子具有更強親和性;所述細胞因子誘導殺傷細胞來源于自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血或胎盤血的單個核細胞。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于， 將人IFNy-SP、多個TCBP和Fc-D/E基因序列通過化學合成獲得，在兩個TCBP之間以及TCBP和Fc-D/E之間均引入連接多肽，其基因序列為GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFNγ -SP、(TCBP) 2和Fc-D/E的 cDNA，即 SP-(TCBP)n-L-Fc ； 將SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pUC229載體Hind 111/^1111!11雙酶切后，在了40嫩連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆的PCR鑒定和測序鑒定；PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合SP-(TCBP)n-L-Fc大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37 °C培養過夜，用無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置-80 V超低溫冰箱中長期保存； 將SP-(TCBP)n-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體Hind III/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定； 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-MEM培養液;取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opt1-MEM中，混勻，取36μ1 Iipof ectamine2000加入1.5ml Opt1-ΜΕΜ中，混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和Iipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min;混合液緩慢滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37 °C、5 % CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入1ml的PBS液清洗一次，晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄;加入含10%血清的細胞培養基20ml，于37 °C、含5%?)2培養箱內繼續培養48-7211; 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心1min，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，反復吹打重懸；經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80 °C超低溫冰箱，即制備成了SP-(TCBP)n-L-Fc慢病毒。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于， 采集來源于患者自體外周血，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核細胞后，用RPMI1640培養基重懸并稀釋到2-5 X 16細胞/ml，并補充1000活性單位(IU)/ml IFN-γ和10%自體血清，每20ml加入到75cm2培養瓶中，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養24h; 24小時后加入5-500ng/ml IL-15、5_500ng/ml IL-18，l_500ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2，于37°C、含5%C02培養箱內培養2天;第3天補充含5-500ng/ml IL-15、5_500ng/mlIL-18，l-500ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和 10-2000IU/ml IL-2和 10% 自體血清的RPMI1640培養基，繼續培養到第5天;第5天離心收獲CIK細胞，并通過苔盼蘭計數； 第5天以3 X 16細胞/ml CIK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養過夜;第6天將20μ1 1Ε+7 TU/ml重組SP-(TCBP)n-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培養板中，體系為2ml，混勻，37 °C、5 %CO2的培養箱中孵育8_12個小時后，更換完全培養液RPMI 16404ml，所述完全培養液含10-2000IU/ml IL-2和10%自體血清；當CIK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，轉入75cm2培養瓶中生長，6孔對應I個培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到50ml培養體系；于37°C、含5%⑶2培養箱內培養到第15-21天，期間根據CIK細胞密度和培養基顏色變化補充含10-2000IU/ml IL-2和10%自體血清新鮮完全培養液RPMI1640，并擴瓶到175cm2培養瓶中或轉移到1.5L培養袋中生長； 培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了 SP-(TCBP)n-L-Fc病毒載體的CIKs其表達SP-(TCBP)n-L-Fc基因高于未轉染的CIKs為100倍以上;蛋白印跡技術檢測其SP-(TCBP)n-L-Fc融合蛋白表達水平，灰度分析SP-(TCBP)n-L-Fc病毒轉染的CIKs培養上清中其灰度高于2000以上。6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法中來源30ml外周血單個核細胞誘導培養獲得細胞因子誘導殺傷細胞，增殖倍數達1000倍以上，培養到21天細胞因子誘導殺傷細胞數達3 X 19以上。7.—種介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 一，重組SP-(TCBP)2-L-Fc基因構建及其慢病毒的制備 新的多肽-可結晶片段域重組基因由干擾素γ信號肽、兩個腫瘤細胞結合多肽和可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區基因片段構成，可結晶片段域重鏈的第2和3恒定區片段，第24個絲氨酸突變為天冬氨酸和第117個異亮氨酸突變為谷氨酸，S卩Fc-D/E; 將人IFNy-SP、2個TCBP和Fc-D/E基因序列通過化學合成獲得，在兩個TCBP之間以及TCBP和Fc-D/E之間均引入連接多肽，其基因序列為GGCGGCGGCGGCAGT，形成完整的含人IFNγ -SP、( TCBP) 2和Fc-D/E的 cDNA，即 SP- (TCBP) 2-L-Fc ； 將SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pUC229載體Hind 111/^1111!11雙酶切后，在了40嫩連接酶作用下，將兩者于4°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定；PCR產物凝膠電泳檢測和測序鑒定符合SP-(TCBP)2-L-Fc大小和序列后，將測序正確的菌液轉接于1ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37 °C培養過夜，用無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒放置-80 °C超低溫冰箱中長期保存;所述SP-(TCBP) 2-L-Fc大小為858bp; 將SP-(TCBP)2-L-Fc的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2載體Hind III/BamH I雙酶切后，在T4DNA連接酶作用下，將兩者于37°C、12小時連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a后進行陽性克隆PCR鑒定和測序鑒定； 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293FT細胞，細胞計數后，按照每個1cm的培養皿6X 16個細胞數接種于培養皿中，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜;第二天轉染前移去培養液，換5ml Opt1-MEM培養液;取9yg包裝混合液和3yg慢病毒表達質粒加入1.5ml Opt1-MEM中，混勻，取36μ1 I ipof ectamine2000加入1.5ml Opt1-ΜΕΜ中，混勻，室溫放置5min ；混合質粒溶液和Iipofectamine 2000稀釋液，置室溫20min ；混合液滴加至293FT細胞的培養液中，混勻，于37 °C、5 %CO2細胞培養箱中培養;培養6h后棄去含有轉染混和物的培養基，加入1ml的PBS液清洗一次，晃動培養皿以洗滌殘余的轉染混和物后倒棄;加入含10%血清的細胞培養基20ml，于37 °C、含5% CO2培養箱內繼續培養72h; 根據細胞狀態，收集轉染后48h的293FT細胞上清液;于4°C，4000g離心1min，除去細胞碎片；以0.45μπι濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機內，設置離心參數為25000rpm，離心時間為2h，離心溫度控制在4°C;離心結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液，反復吹打重懸；經充分溶解后，高速離心lOOOOrpm，離心5min后，取上清熒光法測定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分裝，保存于-80 °C超低溫冰箱，即制備成了SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒； 二，介導抗體依賴性細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的制備 分別采集晚期前列腺癌和乳腺癌患者30ml自體外周血，加入等量I XPBS稀釋，沿離心管管壁疊加于淋巴細胞分離液上，形成明顯界面，室溫下2000rpm離心20min，吸取界面層的PBMC，用I X PBS洗滌兩次；苔盤蘭計數后，用RPMI 1640培養基重懸并稀釋到3 X 16細胞/ml，并補充1000活性單位(IU)/ml IFN-γ和10%自體血清，每20ml加入到75cm2培養瓶中，于37°C、含5%CO2培養箱內培養24h； 24小時后加入50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-18,20ng/ml鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和500IU/ml IL-2，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養2天;第3天補充含50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-18，20ng/ml 0KT3和500IU/ml IL-2和 10% 自體血清的RPMI 1640培養基，繼續培養到第5天;第5天離心收獲CIK細胞，并通過苔盼蘭計數； 第5天以3 X 16細胞/ml CIK細胞加入到六孔培養板，每孔為2ml，于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養過夜;第6天將20μ1 lE+7TU/ml重組SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒加入到人CIK的六孔培養板中，體系為2ml，混勻，37 °C、5 %CO2的培養箱中孵育8_12個小時后，更換完全培養液RPMI 16404ml;所述完全培養液優選含500IU/ml IL-2和10%自體血清；當CIK細胞生長密度達到6 X 16細胞/ml時，轉入75cm2培養瓶中生長，6孔對應I個培養瓶，補充完全培養液RPMI 1640到50ml培養體系;于37 °C、含5 % CO2培養箱內培養到第21天，期間根據CIK細胞密度和培養基顏色變化補充含500IU/ml IL-2和10%自體血清新鮮完全培養液RPMI 1640，并擴瓶到17 5 c m2培養瓶中或轉移到1.5 L培養袋中生長；轉染晚期前列腺癌患者CIK的S P -(TCBP)2-L-Fc慢病毒中TCBP為與前列腺特異抗原特異結合的多肽基因序列，轉染晚期乳腺癌患者CIK的SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒中的為與乳腺癌人表皮生長因子受體-2特異結合的多妝基因序列； 測試SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞后培養到21天后其的表達水平;在通過熒光定量PCR試劑盒按照使用說明書檢測，培養到第21天的CIK細胞通過熒光定量PCR技術檢測，轉染了SP-(TCBP)2-L-Fc病毒轉染晚期前列腺癌和乳腺癌患者的CIKs其表達SP-(TCBP)2-L-Fc基因分別高于未轉染的CIKs為125.1和112.34倍； 三，介導抗體依賴性細胞毒性的CIK細胞蛋白印跡和流式細胞檢測 取步驟二制備的晚期前列腺癌、乳腺癌患者和正常健康人來源第15天培養獲得的CIK細胞進行測試;蛋白印跡技術檢測SP- (TCBP) 2-L-Fc融合蛋白在SP- (TCBP) 2_L_Fc慢病毒轉染晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源CIK細胞中培養上清，SP-(TCBP)2-L-Fc融合蛋白大腸桿菌中表達水平以及未轉染的晚期前列腺癌和乳腺癌患者來源CIK，灰度分析結果顯示SP-(TCBP)2-L-Fc灰度值的分別為 2226、2036、2731、0和 282; 步驟二制備的前列腺癌患者SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞流式細胞檢測，該CIK細胞⑶3和⑶56雙陽性率為43.79%，⑶16陽性率為37.39% ;其中⑶3陽性率為95.98%； 步驟二制備的乳腺癌患者和正常人SP-(TCBP)2-L-Fc慢病毒轉染CIK細胞CD3和⑶56雙陽性率均超過40%以上，CD16陽性率超過30%以上；而未轉染的CIK細胞⑶3和⑶56雙陽性率均在20%左右，⑶16陽性率低于10%以下。8.—種制備介導抗體依賴性的細胞毒性的細胞因子誘導殺傷細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: (1)獲得權利要求1-7任一項所述的穩定表達SP-(TCBP)n-L-Fc的病毒載體； (2)CIK細胞因子，包括IFN-γ、IL-15、IL-18、鼠抗人抗CD3單抗(0KT3)和IL-2; (3)淋巴細胞培養基，包括RPMI1640和無血清培養基； (4)淋巴細胞分離液； (5)生理鹽水； (6)使用說明書； 其中，所述使用說明書包括權利要求1-8中任一項所述的方法。9.根據權利要求1-8中任一項所述的細胞因子誘導殺傷細胞的應用。
【文檔編號】C12N15/62GK105907789SQ201610141302
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月14日
【發明人】陳建勛, 黃啟明
【申請人】紫程瑞生會(北京)生物技術發展有限公司