腫瘤靶向腺病毒復合載體及其制備方法和用圖

腫瘤靶向腺病毒復合載體及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發明涉及腫瘤靶向腺病毒復合載體及其制備方法和用途，屬于基因治療技術領域。本發明所解決的技術問題是提供了一種安全性、靶向性和轉染效率均較高的腫瘤靶向腺病毒復合載體。本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體的組成為由三嵌段聚合物PEI?PEG?PEI和PEI?PEG?FA和Ad形成的復合物；其中，PEI為聚乙烯亞胺，PEG為聚乙二醇，FA為葉酸，Ad為腺病毒。
【專利說明】
腫瘤靶向腺病毒復合載體及其制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明涉及腫瘤靶向腺病毒復合載體及其制備方法和用途，屬于基因治療技術領 域。
【背景技術】
[0002] 傳統的基因治療載體一般分為非病毒載體與病毒載體兩類，其中應用比較廣泛的 是病毒載體。病毒載體能夠感染分裂細胞和非分裂細胞，提供長期的基因表達，轉染效率較 高，但卻具有致病性，靶向性不強等缺點。相比而言，非病毒載體僅轉染分裂細胞，轉染效率 較低，且受限于體內短暫表達。然而非病毒載體具有較低的毒性和致病性及免疫原性，比較 容易制備和生產。
[0003] 陽離子聚合物為非病毒載體之一，其在運載治療基因方面具有很大的優勢，如安 全無毒、合成方便等，因此是一種比較理想的非病毒載體。通過對它修飾，還可以獲得可降 解、細胞靶向等其它優良特性。陽離子聚合物種類繁多，常用的主要有聚乙烯亞胺(PEI)、聚 賴氨酸(PLL)、明膠、殼聚糖(chitosan)等。其中聚乙烯亞胺在現有的陽離子聚合物中被公 認為最有效的基因載體。
[0004]聚乙稀亞胺(polyethylenimine，PEI)作為有機大分子，很早便為人所知，目前研 究也最為廣泛。與其它陽離子聚合物相比，PEI能夠更有效的保護其復合的核酸，這可能因 為它們有較高的電荷密度。在PEI結構單體(-CH2-CH2-NH2-)中每3個原子含1個氮原子，這 些氮原子在生理條件下可以發生質子化而帶上正電荷，能夠與DNA分子中帶負電的磷酸基 團相互作用，所形成的復合物在較寬的pH范圍內都能充當有效的質子海綿（proton sponge)體，具有質子緩沖能力。被PEI負載的DNA通過這種質子海綿效應在傳遞過程中可以 免受DNA酶或巨噬細胞的降解，從而提高轉染效率。
[0005] PEI主要有支狀和線狀兩種結構，其分子量從lOOODa到1600KDa不等。由于在生理 環境下線性PEI中90%的胺基能被質子化，所以無論在體外或者體內環境下線性PEI的轉染 效率都要高于枝化PEI。另外PEI具有一定的細胞毒性，這與它較高的電荷密度有關。不同分 子量或異構體的PEI，在體內的毒性及轉染效果會有所不同。一般來講，高分子量的PEI比低 分子量的PEI轉染效率更高，然而毒性也更大。而線性PEI在轉染時，效果優于枝化PEI，同時 毒性更小。分子量在5KDa-25KDa之間的PEI通常比較適合基因轉染，分子量如果繼續增加， 則毒性就會變大。
[0006] 理想的非病毒載體基因傳遞系統一般需要有效到達靶細胞且安全高效的表達，同 時在體循環系統中保持穩定。然而大多數非病毒基因載體的轉染效率較低，且容易在生理 環境中聚集，很快從體循環中被清除，因此限制了其應用范圍。
[0007] 通過對非病毒載體進行優化，可以提高靶向性及體循環的穩定性、延長作用時間， 從而提高基因傳遞體系的轉染率。例如大多數聚陽離子與DNA的復合物在生理環境下溶解 度小，很容易沉析出來。通過在聚陽離子中引入親水性鏈段合成兩親嵌段的共聚物，就可以 很好地解決溶解性和細胞毒性的問題。除此之外，通過對聚合物表面進行靶向化修飾，引入 配體基團，如葉酸、小分子短肽、抗體等，使其與靶向細胞表面富含的受體能夠相互選擇并 且特異性結合，將藥物更準確地送到病灶器官，在保證治療效果的前提下就可以減少給藥 劑量，從而避免人體內的許多不良反應。
[0008] 在非病毒載體的優化中，目前人們對PEI改性研究比較多。由于PEI毒性較大，本身 又不具有生物降解性，因此科學家們積極探索在降低PEI毒性的同時又盡可能提高它的轉 染效率。目前報道的主要有以下兩種改性策略。第一種改性方法是在PEI上共價連接一種親 水的、具有生物相容性的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，也就是將PEI聚乙二醇化(PEGylated)。 PEG具有高度的親水性和良好的生物相容性，在PEG鏈端還可以引入其它功能基團，結果表 明，通過聚乙二醇的修飾，一方面降低了細胞毒性，防止PEI與基因所形成的復合物在生理 條件下聚集，提高了在血液中的穩定性，同時還延長了血液循環時間，使PEG成為廣泛應用 的親水改性成分。另一種改性策略是對PEI直接進行化學修飾，在PEI材料上連接配體基團， 讓配體與相對應的受體細胞有特異性的靶向結合，提高其基因轉染效率。
[0009] 腺病毒(Ad)是目前最常用的病毒載體，它是無包膜DNA病毒，基因組為36kb長的線 狀雙鏈DNA。病毒顆粒為二十面體，表面的殼膜由252個殼粒組成。腺病毒存在于許多禽類和 哺乳動物中，在自然界分布廣泛。自1953年第一次分離到腺病毒，迄今為止已分離到100種 以上不同血清型的腺病毒，其中人的腺病毒有50種以上。
[0010] 腺病毒載體起源于20世紀60年代初，主要通過去除腺病毒基因組的某些區域而獲 得，目前已發展到第三代載體，但是臨床和科研中應用的主要是第一代腺病毒載體。2型 (Ad2)和5型(Ad5)腺病毒對人類致病性較小，是目前常用的載體。
[0011]以腺病毒為基礎構建的基因傳遞系統，主要治療心血管病、遺傳病、腫瘤等疾病， 具體而言有以下優點：（1)高水平的基因表達，可以在殺死腫瘤細胞后迅速降解，從而減少 外源基因引起的不良免疫反應；（2)宿主范圍廣，可以在肝臟、骨骼肌、心臟、腦、肺、胰腺和 腫瘤組織中表達；（3)人類是腺病毒的天然宿主，腺病毒載體對人體致病性低，可以快速感 染大多數人體細胞，所以比較安全；（4)容易獲得高滴度，在體外穩定，易于制備與純化。（5) 裝載容量大。在基因治療中大多采用缺失E1和E3基因區的腺病毒載體，比逆轉錄病毒和腺 相關病毒的容量大很多，可容納約8.5kb的外源基因。
[0012] 腺病毒存在一些不足，限制了其應用和發展。主要表現在：1、缺乏特異性，它幾乎 可以感染所有的細胞，因此在感染靶細胞時，可能造成非靶細胞的感染。如果治療基因超表 達，那么就存在潛在的副作用；2、表達時間短暫，因腺病毒不能整合到宿主染色體上，所以 很快被機體的網狀內皮細胞吞噬，不能持續表達所需產物，需重復給予;3、可能會刺激機體 免疫反應，引起中和抗體產生，重復給藥的效果會逐漸降低。
[0013] 由于介導腺病毒吸附的柯薩奇一腺病毒受體在正常組織中分布較為廣泛，而在大 多數腫瘤組織中卻低表達，因而腺病毒載體易引發人體免疫反應、缺乏宿主靶向性等不足。 近年來，關于腺病毒載體進行改造或修飾已成為備受關注的研究熱點。
[0014] 關于腺病毒外殼的改造：（1)由于纖毛上的頭部蛋白負責識別和結合靶細胞的特 異受體，因此纖毛在腺病毒感染細胞過程中起關鍵作用。研究人員針對腺病毒纖毛進行改 造的策略主要是:在纖毛上連接特異靶向腫瘤的蛋白和對不同亞屬的腺病毒進行纖毛嵌合 改造。（2)六鄰體的改造:據調查大多數人具有5型腺病毒感染史，因此體內存在大量5型腺 病毒抗體，這樣就很容易被人體的抗體免疫中和，使得最終到達腫瘤的病毒量很少，影響治 療效果。于是有研究人員通過使用化學修飾劑掩蓋六鄰體或者改造5型腺病毒的六鄰體，從 而改變5型腺病毒的免疫性。其中外在修飾最成功的是使用無免疫原性、無毒性、水溶性強 的聚乙二醇(PEG)對腺病毒共價修飾。
[0015] 關于腺病毒基因組的改造:腺病毒對腫瘤的殺傷性主要包括兩個方面:腺病毒自 身對腫瘤細胞的殺傷性;腺病毒攜帶的外源基因的殺傷作用。因此一方面通過提高腺病毒 對腫瘤的靶向性來提高對腫瘤細胞殺傷的準確性，減少腺病毒對正常細胞的傷害，另一方 面可選擇合適的外源基因以及提高外源基因的表達量，增強腺病毒的殺傷效果。
[0016] 病毒載體用于基因治療主要存在安全性和靶向性問題，它容易引發機體的免疫反 應，尤其是安全性低使得病毒載體在實際應用中受到限制。另一方面，隨著人們對病毒載體 的研究不斷深入，結合疾病特點以及靶組織或靶細胞的特性選擇相應病毒載體會顯得尤為 重要。因此研究并探索病毒基因載體的改性，使病毒載體一方面保持其自身較高的轉染效 率，同時又能克服細胞毒性和免疫原性缺點，也就是同時具備病毒載體與非病毒載體的各 自優勢將具有十分重要的應用價值。沿著這條思路，將病毒載體與合成材料結合起來已經 獲得了一些探索和發展。例如有實驗者將逆轉錄病毒和聚合物如聚乙烯亞胺、聚賴氨酸等 結合起來。還有些研究者用PEG對腺病毒表面進行聚乙二醇化或者修飾，使得傳遞載體的性 能有所提高。然而，上述報道主要是單方面提高病毒載體的安全性、靶向性或轉染效率，未 見有能用于基因治療的安全性、靶向性和轉染效率均較高的病毒載體的相關報道。

【發明內容】

[0017] 本發明所要解決的技術問題是提供一種安全性、靶向性和轉染效率均較高的腫瘤 靶向腺病毒復合載體。
[0018] 本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體的組成為由三嵌段聚合物PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA和Ad形成的復合物；其中，PEI為聚乙烯亞胺，PEG為聚乙二醇，FA為葉酸，Ad為腺病 毒。
[0019] 其中，上述的PEI和PEG可以采用常用分子量的PEI和PEG，考慮到安全性更好，以及 為了提高基因轉染效率，上述的PEI分子量優選為2500~8500，上述的PEI分子量更優選為 2800，PEG分子量優選為2000。
[0020] 進一步的，上述的腺病毒優選為2型腺病毒或5型腺病毒;上述的腺病毒更優選為5 型腺病毒
[0021] 其中，上述的PEI可以為枝狀或線狀，為了提高轉染效率，上述的PEI優選為線狀 PEI。
[0022] 進一步的，上述的腺病毒優選為腫瘤靶向啟動子控制復制缺陷型腺病毒，上述的 腺病毒更優選為缺失E1和E3基因區的腺病毒。
[0023] 其中，為了提高復合載體的轉染效率，上述腫瘤靶向腺病毒復合載體中的PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾比優選為1:2~6;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad 顆粒的摩爾比優選為1 X 1〇3~2 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的 摩爾比更優選為1.5 X 103~1.5 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的 摩爾比最優選為1.5X103:1。
[0024] 進一步的，當PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾比為1:4時，復合載體的轉染效率 最高。
[0025] 其中，表面電位、粒徑是決定復合載體被細胞吸收的兩個關鍵因素。一般來說，復 合物的正電性與細胞膜的負電性之間存在非特異性的正負電相互作用，所以較高表面電位 有利于復合載體進入細胞，但是過高正電性對細胞有較強的毒性;另外較小的粒徑有利于 細胞內吞。綜上，選擇相對較小粒徑、表面電荷適量的復合載體，可以更好地被細胞吸收，從 而提尚基因轉染效率。考慮表面電位、粒徑的影響，為了進一步提尚復合載體的轉染效率， 本發明優選如下技術方案：
[0026] 當PEI分子量為2800時，復合載體中的PEI-PEG-PEI濃度為0.02~0.6mg/ml，復合 載體中的PEI-PEG-FA濃度為0.08~2.4mg/ml，復合載體中的腺病毒濃度為10 9~10nPFU;當 PEI分子量為2800時，復合載體中的PEI-PEG-PEI濃度更優選為0.6mg/ml，復合載體中的 PEI-PEG-FA濃度更優選為2.4mg/ml，復合載體中的腺病毒濃度更優選為10nPFU。
[0027] 本發明還提供了一種抗腫瘤藥物，其含有上述腫瘤靶向腺病毒復合載體。
[0028] 另外，本發明還提供了上述腫瘤靶向腺病毒復合載體在制備治療抗腫瘤藥物中的 用途。
[0029] 本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體，其制備方法包括如下步驟：
[0030] a、用稀釋液將PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA分別稀釋至濃度為0.05~5mg/ml，然后 通過0 · 22um孔徑的過濾器進行過濾；
[0031] b、用稀釋液將腺病毒稀釋至滴度為0.5 X 101Q~1 X 10nPFU;
[0032] c、將a步驟過濾后的PE I -PEG-PEI液與PE I -PEG-FA液混合，然后滴加入到的腺病毒 溶液中，混勻，在室溫條件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合載體；
[0033]其中，所述的稀釋液為PBS液、去離子水或5wt%葡萄糖溶液;所述的稀釋液優選為 PBS 液。
[0034] 其中，上述方法中的PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA可以采用常規方法制備得到或采 用市售產品。為了提高減少或避免副產物的生成，從而提高產品純度，上述的的PEI-PEG-PEI優選采用下述方法制備得到：
[0035] 1)、合成 Ts〇-PEG-〇Ts
[0036] 以Et3N和CHC13為溶劑，使PEG與TsCl在室溫條件下進行對甲苯磺酰化，反應時間為 0.5-2h;反應后的產物加入CHC13使其溶解，然后加入去離子水，靜置分層，下層有機相溶液 用飽和NaCl溶液再進行萃取，萃取結束后蒸掉多余CHC1 3溶劑;將乙醚溶液緩慢滴入上述萃 取液中，然后靜置分層，將下層乳濁液進行離心分離，制得TsO-PEG-OTs;
[0037] 該條件下進行對甲苯磺酰化可以避免反應劇烈發生危險，更為重要的是能提高 TsO-PEG-OTs 的純度。
[0038] 2)合成 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0
[0039] 以陽離子聚合物2-乙基-2-惡唑啉(EtOZO)為底物，Ts〇-PEG-〇Ts作為引發劑，在惰 性氣體保護條件下，以乙腈為溶劑，于65-75Γ反應65-75h;反應完成后蒸掉多余的乙腈溶 劑，然后用三氯甲烷溶解產物，再將產物緩慢滴入乙醚中，靜置分層，下層沉淀物離心，制得 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0；
[0040] 3)水解
[0041 ] PEt0Z0-PEG-PEt0Z0在10%鹽酸溶液、100°C、惰性氣體保護條件下水解16小時，然 后將水解后的混合物pH值調至12.5，析出沉淀，離心分離沉淀即得PEI-PEG-PEI。
[0042]其中，上述的惰性氣體為不參加反應的氣體，如:氮氣、氦氣、氬氣等，從成本考慮， 優選氮氣。
[0043]進一步的，上述制備腫瘤靶向腺病毒復合載體的方法，其步驟1)中PEG、TsCl和 Et3N的摩爾比為1:2~4:3~5。PEG、TsCl和Et3N的摩爾比優選為l :3:4。CHCl3作溶劑，可適當 過量。
[0044] 本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體，其中的PEI-PEG-FA和PEI-PEG-PEI可以通過一 側的PEI靜電作用包裹在腺病毒表面，既保持了小分子量線性PEI特有的低毒性，同時通過 葉酸連接PEG能夠進一步降低載體的毒性，并且葉酸又具有腫瘤分子靶向作用，大幅提高了 轉染效率(PEI-PEG-FA和PEI-PEG-PEI物理吸附腺病毒載體模式如圖26所示）。聚合物包裹 在腺病毒表面，一方面通過EPR效應能夠提高腺病毒在腫瘤組織的累積量，另一方面具有較 低的肝臟攝取率，從而提高了載體的安全性。本發明為腫瘤基因治療提供了一種新的復合 載體，該復合載體具有安全性、靶向性和轉染效率均較高的特點，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0045] 附圖1為聚乙二醇對甲苯磺酸酯核磁表征(⑶Cl3)圖；
[0046] 附圖 2為PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的核磁譜表征（CDC13)圖；
[0047] 附圖 3 為 PEI-PEG-PEI 核磁表征（DMS0-d6)圖；
[0048] 附圖 4 為 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0(4900-2000-4900)的紅外光譜圖；
[0049] 附圖 5 為 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0(8100-2000-8100)的紅外光譜圖；
[0050] 附圖 6 為 PEI-PEG-PEI (4900-2000-4900)與 PEI-PEG-PEI (8100-2000-8100)紅外光 譜圖對照；
[0051 ] 附圖7為FA-PEG-OH的合成路線圖；
[0052] 附圖8為FA-PEG-C00H的合成路線圖；
[0053] 附圖9為FA-PEG-PEI的合成路線圖；
[0054] 附圖10為PEI-PEG-FA核磁表征(D20)圖；
[0055] 附圖11為三組不同濃度的復合物粒徑圖；A組為Ad/PEI-PEG-PEI( 2800-2000-2800)，B組為Ad/PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)，C組為Ad/PEI-PEG-FA;
[0056] 附圖12為裸腺病毒粒徑和電位圖；
[0057]附圖13為三組不同濃度的復合物電位圖；
[0058] A組為Ad/PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)，B組為Ad/PEI-PEG-PEI (8100-2000-8100)，C組為Ad/PEI-PEG-FA;
[0059] 附圖 14為裸Ad及Ad復合物SEM圖（a:裸病毒，b:Ad/PEI-PEG-PEI);
[0060] 附圖 15為裸Ad及Ad復合物TEM圖（a:裸病毒，b:Ad/PEI-PEG-PEI);
[0061] 附圖16為腺病毒感染宿主細胞原理圖；
[0062]附圖17為SK-0V-3細胞在不同Μ0Ι下的熒光圖片（圖片從左到右的Μ0Ι值分別為0、 10、100、1000;
[0063]附圖18為KB細胞在不同Μ0Ι下的熒光圖片（圖片從左到右的Μ0Ι值分別為0、10、 100、1000;
[0064] 附圖19為KB細胞熒光圖片，圖中A1、B1、C1是用含葉酸的培養基篩選的KB細胞，其 中 A1: Ad; B1: Ad/PE I -PEG-PEI /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /1); C1: Ad/PE I -PEG-PEI/PEI-PEG-FA(npEi-peg-PEi/npEi-peg-「△=1/4)42、82、02是用不含葉酸的培養基篩選的仙細 胞，其中A2 :Ad;B2:Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA(npEI-PEG-PEI/npEI-PEG-FA=l/l)C2 :Ad/PEI-PEG-PEI /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /4)，D1: Ad/PE I -PEG-FA · D2: Ad/PE I -PEG-PEI；
[0065] 附圖20為為SK-0V-3細胞熒光圖片；
[0066] A1、B1、C1是用含葉酸的培養基篩選的SK-0V-3細胞，其中Al:Ad;
[0067] B1: Ad/PE I -PEG-PE I /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /1)
[0068] Cl ： Ad/PE I-PEG-PE I/PE I-PEG-FA (npEi-PEG-PEi/npEi-PEG-FA= 1/4),
[0069] A2、B2、C2是用不含葉酸的培養基篩選的SK-0V-3細胞，其中A2: Ad;
[0070] B2: Ad/PE I -PEG-PE I /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /1)
[0071] C2: Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA(npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa= 1/4)
[0072] D1:Ad/PEI-PEG-FA·D2:Ad/PEI-PEG-PEI;
[0073] 附圖21為不同ELISA方法的作用原理圖；
[0074] 附圖22為小鼠 IgG標準曲線圖；
[0075] 附圖23為小鼠血清免疫球蛋白濃度圖；
[0076]附圖24為KB細胞熒光圖片；
[0077] A:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀釋20倍；
[0078] B:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀釋40倍；
[0079] C:注射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀釋20倍；
[0080] D:注射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀釋40倍；
[0081 ] 附圖25為SK-0V-3細胞熒光圖；
[0082] A:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀釋20倍；
[0083 ] B:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀釋40倍；
[0084] C:注射Ad/PE I -PEG-PE I /PE I-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀釋20倍；
[0085] D:注射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀釋40倍；
[0086] 圖26為PEI-PEG-FA和PEI-PEG-PEI物理吸附腺病毒載體模式圖；
[0087]圖27為腫瘤抑制實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0088]本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體的組成為由三嵌段聚合物PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA和Ad形成的復合物；其中，PEI為聚乙烯亞胺，PEG為聚乙二醇，FA為葉酸，Ad為腺病 毒。
[0089] 其中，上述的PEI和PEG可以采用常用分子量的PEI和PEG，考慮到安全性更好，以及 為了提高基因轉染效率，上述的PEI分子量優選為2500~8500，上述的PEI分子量更優選為 2800，PEG分子量優選為2000。
[0090]進一步的，上述的腺病毒優選為2型腺病毒或5型腺病毒;上述的腺病毒更優選為5 型腺病毒
[0091] 其中，上述的PEI可以為枝狀或線狀，為了提高轉染效率，上述的PEI優選為線狀 PEI。
[0092] 進一步的，上述的腺病毒優選為腫瘤靶向啟動子控制復制缺陷型腺病毒，上述的 腺病毒更優選為缺失E1和E3基因區的腺病毒。
[0093]其中，為了提高復合載體的轉染效率，上述腫瘤靶向腺病毒復合載體中的PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾比優選為1:2~6;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad 顆粒的摩爾比優選為1 X 1〇3~2 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的 摩爾比更優選為1.5 X 103~1.5 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的 摩爾比最優選為1.5X103:1。
[0094] 進一步的，當PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾比為1:4時，復合載體的轉染效率 最高。
[0095] 其中，表面電位、粒徑是決定復合載體被細胞吸收的兩個關鍵因素。一般來說，復 合物的正電性與細胞膜的負電性之間存在非特異性的正負電相互作用，所以較高表面電位 有利于復合載體進入細胞，但是過高正電性對細胞有較強的毒性;另外較小的粒徑有利于 細胞內吞。綜上，選擇相對較小粒徑、表面電荷適量的復合載體，可以更好地被細胞吸收，從 而提尚基因轉染效率。考慮表面電位、粒徑的影響，為了進一步提尚復合載體的轉染效率， 本發明優選如下技術方案：
[0096] 當PEI分子量為2800時，復合載體中的PEI-PEG-PEI濃度為0.02~0.6mg/ml，復合 載體中的PEI-PEG-FA濃度為0.08~2.4mg/ml，復合載體中的腺病毒濃度為10 9~10nPFU;當 PEI分子量為2800時，復合載體中的PEI-PEG-PEI濃度更優選為0.6mg/ml，復合載體中的 PEI-PEG-FA濃度更優選為2.4mg/ml，復合載體中的腺病毒濃度更優選為10nPFU。
[0097] 本發明還提供了一種抗腫瘤藥物，其含有上述腫瘤靶向腺病毒復合載體。
[0098] 另外，本發明還提供了上述腫瘤靶向腺病毒復合載體在制備治療抗腫瘤藥物中的 用途。
[0099] 本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體，其制備方法包括如下步驟：
[0100] a、用稀釋液將PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA分別稀釋至濃度為0.05~5mg/ml，然后 通過0 · 22um孔徑的過濾器進行過濾；
[0101] b、用稀釋液將腺病毒稀釋至滴度為0.5X101Q~lX10nPFU;
[0102] c、將a步驟過濾后的PE I -PEG-PEI液與PE I -PEG-FA液混合，然后滴加入到的腺病毒 溶液中，混勻，在室溫條件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合載體；
[0103] 其中，所述的稀釋液為PBS液、去離子水或5wt%葡萄糖溶液;所述的稀釋液優選為 PBS 液。
[0104] 其中，上述方法中的PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA可以采用常規方法制備得到或采 用市售產品。為了提高減少或避免副產物的生成，從而提高產品純度，上述的的PEI-PEG-PEI優選采用下述方法制備得到：
[0105] 1)、合成 Ts〇-PEG-〇Ts
[0106] 以Et3N和CHC13為溶劑，使PEG與TsCl在室溫條件下進行對甲苯磺酰化，反應時間為 0.5-2h;反應后的產物加入CHC13使其溶解，然后加入去離子水，靜置分層，下層有機相溶液 用飽和NaCl溶液再進行萃取，萃取結束后蒸掉多余CHC1 3溶劑;將乙醚溶液緩慢滴入上述萃 取液中，然后靜置分層，將下層乳濁液進行離心分離，制得TsO-PEG-OTs;
[0107] 該條件下進行對甲苯磺酰化可以避免反應劇烈發生危險，更為重要的是能提高 TsO-PEG-OTs 的純度。
[0108] 2)合成 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0
[0109] 以陽離子聚合物2-乙基-2-惡唑啉(EtOZO)為底物，Ts〇-PEG-〇Ts作為引發劑，在惰 性氣體保護條件下，以乙腈為溶劑，于65-75Γ反應65-75h;反應完成后蒸掉多余的乙腈溶 劑，然后用三氯甲烷溶解產物，再將產物緩慢滴入乙醚中，靜置分層，下層沉淀物離心，制得 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0；
[0110] 3)水解
[0111] PEt0Z0-PEG-PEt0Z0在10%鹽酸溶液、100°C、惰性氣體保護條件下水解16小時，然 后將水解后的混合物pH值調至12.5，析出沉淀，離心分離沉淀即得PEI-PEG-PEI。
[0112] 其中，上述的惰性氣體為不參加反應的氣體，如:氮氣、氦氣、氬氣等，從成本考慮， 優選氮氣。
[0113] 進一步的，上述制備腫瘤靶向腺病毒復合載體的方法，其步驟1)中PEG、TsCl和 Et3N的摩爾比為1:2~4:3~5。PEG、TsCl和Et3N的摩爾比優選為l :3:4。CHCl3作溶劑，可適當 過量。
[0114] 下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發明限 制在所述的實施例范圍之中。
[0115] 試驗例1三嵌段聚合物PEI-PEG-PEI的合成
[0116] 1、試劑
L0121」3、合成方法
[0122] 3.1制備 Ts〇-PEG-〇Ts
[0123] 3.1.1PEG 的除水
[0124] 稱取PEG(3.6g，1.8mmol)于50ml圓底燒瓶中，用電吹風進行適當加熱，讓上層固體 部分溶解，以防止后面加熱時向瓶口沖。設置電加熱器溫度為ll〇°C，燒瓶內的溫度為60°C， 在加熱燒瓶的同時抽真空、通氮氣約2h。關閉時，先通氮氣，然后抽吸氣交替進行三次后關 掉閥門。實驗室所用的氮氣在預處理中已除去微量的氧氣和水。
[0125] 3.1.2蒸餾三乙胺溶液
[0126] 在50ml圓底蒸餾瓶中倒入三乙胺溶液5ml，加入兩勺氫化鈣固體后連接回流冷凝 管和溫度計，最上端口通入保護氣體氮氣。蒸餾瓶內溫度設為110°c，電加熱器的溫度設為 150°C，回流大約3h后開始蒸餾，棄去初餾分，收集純度更高的三乙胺。
[0127] 3.1.3反應過程
[0128] (1)在第一個反應瓶中加入1.03g對甲苯磺酰氯(TsCl)，用6ml三氯甲烷溶解后，讓 其充分攪拌lh。
[0129] (2)稱取3.6g PEG于第二個反應瓶中，然后加入lml三乙胺溶液以及7.2ml三氯甲 烷溶劑，將其充分攪拌約lh。
[0130] (3)將第二個反應瓶于室溫條件下，在通他的情況下，緩慢將第一個反應瓶中的所 有溶液加入到PEG中，反應進行lh。
[0131] (4)反應后處理
[0132] ①萃取
[0133] 在上述所得產物中，加入一定量的三氯甲烷(體積為樣品溶液的30%_50%)，讓其 充分溶解混合，然后轉移到分液漏斗中，同時加入去離子水，靜置分層。最后將下層有機相 溶液轉移到分液漏斗中，用飽和NaCl溶液再進行萃取，步驟同上。萃取結束后在旋轉蒸發儀 上蒸掉多余三氯甲烷溶劑。
[0134] ②過濾
[0135] 將60ml乙醚倒入燒杯后開啟磁力攪拌器，用滴管緩慢滴入上述萃取液，同時觀察 產生沉淀情況，若為絮狀物，則說明溶液濃度適宜，將濃縮液全部滴完。關閉攪拌器，靜置分 層后，將下層乳濁液轉移到離心管中進行離心分離，轉速設為4000r/min，時間為5min。最后 將所得樣品進行抽真空，干燥保存。
[0136] 3·2制備PEt0Z0-PEG-PEt0Z0
[0137] 3.2.1蒸餾 2-乙基-2-惡唑啉(EtOZO)
[0138] 反應瓶中加入2-乙基-2-惡唑啉、2勺氫化鈣固體，通入保護氣體N2，開啟攪拌，進 行除水4h，不加熱以防止聚合。然后進行常壓蒸餾，反應瓶內溫度設定在160°C(2-乙基-2-惡唑啉沸點為128 °C)，電加熱器溫度為210°C。大約4h后蒸餾開始，將前餾分5-6滴棄掉后得 到純度更高的產物。
[0139] 3.2.2反應過程
[0140] 首先將反應體系進行無水無氧處理，用加熱槍加熱反應裝置同時對反應體系抽真 空、通氮氣，重復三次。將乙腈溶劑用氫化鈣進行除水。將〇.2184g聚乙二醇對甲苯磺酸酯 (Ts〇-PEG-〇Ts)以及0 · 993ml 2-乙基-2-惡唑啉加入到兩 口瓶中（η(Ε?_)/η(Τ3〇-peg-QTs) = 104/ 1)，待溶解完全后再加入l〇ml乙腈溶劑。開啟循環水，油浴溫度設為70°C，反應過程中通小 量他保證史蘭克雙排管內有足夠正壓，反應進行3天。
[0141] 3.2.3反應后處理
[0142] 首先在旋轉蒸發儀上蒸掉多余的乙腈溶劑，然后用一定量的三氯甲烷溶解產物。 在燒杯內倒入過量的冰乙醚，將產物緩慢滴入乙醚中，觀察出現的是絮狀物時，將其全部滴 加完畢。靜置分層，將下層沉淀物轉移到離心管中進行離心。最后將所得產物抽真空4h。
[0143] 3·3制備PEI-PEG-PEI
[0144] 稱取1.05g PMeOZO-PEG-PMeOZO加入到圓底燒瓶中，安裝反應裝置并對其進行無 水無氧處理，抽真空、通氮氣重復3次。氮氣保護下加入6ml鹽酸溶液（10wt%)，接上回流冷 凝管和溫度計，在l〇〇°C通氮氣條件下回流12h。
[0145] 反應結束待產物冷卻后，用1M氫氧化鈉調節反應產物的PH值，當PH調至11時，混合 物開始變為乳濁液，當調至12.5左右時，觀察發生沉淀現象。然后將聚合沉淀物進行高速離 心分離，轉速設為l〇〇〇〇r/min，時間8min，取下層沉淀，用去離子水對產物洗滌兩次后，再重 復離心分離一次，最后將產物冷凍干燥后得到淺黃色固體粉末。
[0146] 4、結果分析
[0147] 4.1 Ts〇-PEG-〇Ts的合成結果分析
[0148] 產物的核磁譜圖（如圖1所示）顯示的信號分別在S2.44(PEG-0S02C 6H4CH3,6H)， 3.63(PEG，180H)，4.16(CH2CH 20S02C6H4CH3，4H)從這幾個基峰能夠確定對PEG甲苯磺酰化可 以定量得到聚乙二醇對甲苯磺酸酯(TsO-PEG-OTs)，并且本發明方法沒有引入其他雜質，產 率達到95 %。
[0149] 4.2 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的合成結果分析
[0150] PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的典型核磁表征（CDC13)如圖2所示。其中δ2.00-2.20的共振 態以及δ3.42分別是PEtOZO中的乙基和亞甲基。δ3.64的單峰是PEG中的亞甲基部分。通過對 峰3.42和3.64的氫譜積分面積，可以計算出三嵌段共聚物的分子質量為4900-2000-4900 8/ mo 1，與預期的分子量4500-2000-4500g/mo 1比較接近。
[0151] 4.3 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的合成結果分析
[0152] PEI-PEG-PEI的核磁譜圖如圖3所示。其中有兩個單峰分別在δ2.55和3.60，它們分 別是PEI和PEG的亞甲基，由這兩個峰的積分面積可以計算出三嵌段共聚物PEI-PEG-PEI的 相對分子質量是2800-2000-2800g/mol，在δ?.95附近有個非常小的峰，應該是還有部分殘 余的乙酰基。根據95和2.55的積分面積可以看出，超過99%的乙酰基被移走，產物的純 度較高。通過改變mEtozco/mTso-PEG-QTs) = 208/1，用類似的方法還合成出了PEI-PEG-PEI相對 分子質量為8100-2000-8100g/mol。
[0153] 4.4聚合物的表征
[0154] 不同分子量PEtOZO-PEG-PEtOZO紅外譜圖以及紅外對照譜圖分別見圖4、5、6所示。 在2940cm- 1附近，-CH3和-CH2不對稱伸縮振動；1638cm-1附近，酯鍵中C = 0伸縮振動；1424(^1 附近，C-N伸縮振動；1376CHT1附近，-CH3對稱彎曲振動；1195cnf1附近，C-0伸縮振動;750CHT 1 附近，NH2面外搖。紅外譜圖結果與聚合物的預計結構相一致，且由不同分子量的紅外譜圖 對照顯示，兩者特征峰的位置基本相同。
[0155] 試驗例2 FA-PEG-PEI的合成
[0156] 1、實驗試劑和儀器 葉酸 97% 阿拉丁 羥基琥珀酰亞胺（NHS) 98% 阿拉丁 丁二酸酐（SA) 98% 阿拉丁 二甲亞砜(DMS0) Μ 成都市科龍化工試劑廠 二甲硅油 紐成都市科龍化工試劑廠 氯仿 AR 成都市科龍化工試劑廠
[0157] 二氯甲烷 AR 成都市科龍化工試劑廠 乙醚 AR 成都市科龍化工試劑廠 三乙醇胺(TEA) AR 成都市科龍化工試劑廠 α -羥基-ω-氨基聚乙二醇（Mn=3400) 上海西寶生物科技有限公司 聚乙烯亞胺（PEI Μη=1400) 99% 阿拉丁 N，N-二環己基碳二亞胺(DCC) 99% 阿拉丁 電子天平 PL203 瑞士 METTLER TOLEDO公司 恒溫磁力攪拌器 85-2 鞏義予華儀器有限公司 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 DF-101S 上海標和儀器有限公司
[0158] 旋轉蒸發儀 R206 上海申生科技 核磁共振儀 AM400 瑞士 Bruker公司 旋葉式真空泵 XI)-020 上海南光真空泵廠 冷凍千燥機 \fFD2000 北京博醫康公司
[0159 ] 2、α-羥基-ω -葉酸聚乙二醇(FA-PEG-OH)的合成
[0160] 合成路線如圖7所示。葉酸的活化:將0.22g葉酸加至50ml的兩口瓶中，真空干燥4 小時后，加入20ml無水DMS0,然后依次加入0.12g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，0.21g N，N-二 環己基碳二亞胺(DCC)，避光反應12h，在6000r/min，10min條件下離心，去掉反應的不溶物。
[0161] 將活化的葉酸加入到預先溶有H0-PEG-NH2 (0.86g，Mn = 3.4kDa)的5ml DMS0溶液 中，用三乙胺將反應體系pH值調到8,避光反應24h。反應結束后用透析袋(MWC0=lkDa)在蒸 餾水中透析76h，平均4h換一次蒸餾水，最后經冷凍干燥得黃色粉末狀產物:葉酸功能化的 端羥基聚乙二醇(FA-PEG-OH)。
[0162] 3、α-羧基-ω -葉酸聚乙二醇(FA-PEG-C00H)的合成
[0163] 合成路線如圖8所示。將FA-PEG-OH(0.50g)加入反應瓶中，真空干燥8h。用20ml三 氯甲烷將其溶解后，再加入〇.125g過量丁二酸酐，70°C攪拌回流反應進行49h。減壓除掉過 量溶劑三氯甲烷，然后在蒸餾水中溶解，用透析袋(MWC0= lkDa)透析48h。最后冷凍干燥后 得到白色粉末狀產物:FA-PEG-C00H。
[0164] 4、葉酸偶聯聚乙二醇接枝聚乙烯亞胺FA-PEG-PEI的合成
[0165] 合成路線如圖9所示。FA-PEG-C00H的活化:稱取0.10g FA-PEG-C00H加入到50ml的 反應瓶中，加入1 〇ml二氯甲烷（氫化鈣除水）將其溶解，然后依次加入0.60g NHS、0.15g DCC，避光反應24h，最后離心去掉反應生成的不溶物。
[0166] 稱取0.22g聚乙烯亞胺(PEI)加入兩口瓶中，溶解在10ml roS(pH=7.4)中，然后把 已活化的FA-PEG-C00H加入到PEI溶液中，室溫下避光反應24h。將反應后的產物在過量蒸餾 水中透析48小時，最后冷凍干燥得到淺黃色粘稠狀產物:FA-PEG-PEI。
[0167] 5、產物 FA-PEG-PEI 的表征
[0168] 產物FA-PEG-PEI的核磁表征（D20)如圖10所示。其中δ2.40-2.80歸屬為-012012順-，-〇(0 = 0)0120120)-質子的化學位移的重疊。66.4、7.5及8.6是葉酸分子結構中 苯環質子的化學位移。S3.65為PEG上亞甲基質子的化學位移，由此可以確定目標產物被成 功合成。
[0169] 實施例1 Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合載體的制備
[0170] 1、實驗材料
[0171]本實驗所用腺病毒購買自漢恒生物科技有限公司，細胞株選用293A細胞。腺病毒 包裝系統為兩質粒系統，其組成為穿梭質粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和骨架質粒pBHGlox (delta)El,E3Cre〇
[0172] 2、實驗流程及方法
[0173] 由漢恒生物技術公司合成CMV啟動子，GFP基因擴增所需引物，選用缺失Ela及Elb 啟動子的Ad5腺病毒，在缺失Ela啟動子的部位插入經過修飾的CMV啟動子，在Ela與Elb之間 插入插入GFP基因，E3保留。制備腺病毒穿梭質粒后，分別對腺病毒穿梭質粒和骨架質粒進 行高純度無內毒素抽提，通過試劑盒共轉染293A細胞，轉染6h后將培養基更換為完全培養 基，在四天左右更換一次新鮮培養基，共培養十幾天。
[0174] 在病毒收集前，首先要觀察病毒空斑是否形成。通常為了更好的形成空斑及限制 病毒擴散，會在培養液中加入一定量的瓊脂糖。轉染7天左右便可以在顯微鏡下看到小的空 斑，最后將空斑和瓊脂糖一起挑起，放入新鮮培養基中過夜。第二天給含有病毒的培養基中 加入新鮮的293A細胞培養液，進行病毒少量擴增。至細胞再次出現空斑，收集細胞及上清 液，反復凍融三次后收集病毒，最后以2000rpm離心5分鐘，取細胞上清液即為病毒初代原 液。連續三代反復擴增收集病毒后，進行病毒的大量擴增。然后通過CsCl密度梯度離心-透 析聯用法純化病毒，最后進行病毒顆粒數(0PU)的測定，方法如下：
[0175] 以適當倍數對CsCl離心純化得到的病毒進行稀釋，使0D值在0.1-1.0之間，測波長 在260nm下的0D值，估算病毒顆粒數，OPU/ml = 0D26Q X稀釋倍數X 1.1 X 1012。由于此種方法 測出的是病毒的物理濃度，沒有考慮生物學活性，因此經驗上估算PFU/ml =0PU/100。
[0176] 3、Ad/PE I -PEG-PEI /FA 復合物的制備
[0177] 準備不同分子量的聚合物 PEI-PEG-PEI(2800-2000-2800、8100-2000-8100)以及 PEI-PEG-FA，用roS將其濃度稀釋為2mg/ml至0.05mg/ml不等，然后通過0.22um孔徑的過濾 器進行過濾。用PBS將腺病毒稀釋至滴度為10 1()PFU。將一系列不同濃度的聚合物溶液分別逐 滴加入到等體積的腺病毒溶液中，輕輕地混勻之后，在室溫條件下孵育25-30min，帶負電的 腺病毒與帶正電的聚合物形成靜電粒子，分別制得Ad/PEI-PEG-PEI符合載體和Ad/PEI-PEG-FA復合載體。
[0178] 另外，采用上述方法將過濾后的PEI-PEG-PEI液與PEI-PEG-FA液混合，然后滴加入 到的腺病毒溶液中，混勻，在室溫條件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合載體。
[0179] 4、復合物的粒徑和表面電位測定
[0180] 三元共聚物PEI-PEG-PEI及PEI-PEG-FA與腺病毒所形成的復合物粒徑分布及表面 電位使用Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀(英國Malvern公司）進行測量。在測量之前， 準備200ul的裸病毒溶液及不同濃度的Ad/PEI-PEG-PEI、Ad/PEI-PEG-FA復合物樣品（各包 含10ul 101QPFU的Ad)，然后分別溶解在lml的超純水中。在25°C下進行測量，散射光以90°檢 測并在自動加速器上收集。待測樣品組分見表1、2、3所示，對于每組樣品，取三次測量的平 均值，每次測量保持一分鐘間隔進行。檢測表面電位時使用專用的微量檢測樣品池，以提高 檢測數據的準確性。復合物粒徑和表面電位的測量能夠為體外轉染研究篩選出最優的聚合 物濃度。
[0181] 表 1 PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)組分
[0182]
[0184] 表2 PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)組分
[0185]
[0186] 表3 PEI-PEG-FA組分
[0187]

[0188] 5、復合物的掃描電子顯微鏡(SEM)
[0189] 用導電膠將拋光的單晶硅片貼到掃描電鏡樣品臺上，取適量樣品稀釋至不同濃度 梯度，然后將其滴到硅片上，液體樣品烘干后進行掃描電鏡分析。工作距離8.4mm、電子束電 壓3kv、電子密度1 ΟμΑ、放大倍數10K~50K倍。
[0190] 6、復合物的透射電子顯微鏡(ΤΕΜ)
[0191] 裸病毒以及Ad5/PEI-PEG-PEI復合物的形貌通過透射電子顯微鏡(ΤΕΜ)進行觀察， 加速電壓為20KV。將最優比例的20ul裸病毒溶液及20ul的Ad/PEI-PEG-PEI復合溶液待測樣 品（各包含IX l〇9PFU的Ad5)，滴到碳支持膜銅網上，放置10分鐘，保證有足夠的吸收，然后 在37°C下烘干后檢測。應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析TEM數據。
[0192] 7、結果分析
[0193] 7.1聚合物/Ad復合物的粒徑
[0194] 粒子尺寸大小是影響細胞轉染效率和運輸過程的一個重要因素。粒子被細胞吸收 的效率很大程度上取決于粒徑大小。如果基因傳遞載體的尺寸太大會影響細胞吸收，從而 導致轉染效率下降。我們將靶向聚合物(PEI-PEG-FA)及非靶向聚合物PEI-PEG-PEI(2800-2000-2800、8100-2000-8100)分別以不同濃度復合腺病毒，并對其粒徑進行檢測，結果如圖 11所示。對于A組Ad/PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)而言，當聚合物濃度為0.2mg/ml時，它 的粒徑最小，為237.97nm。對于B組Ad/PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)而言，當聚合物濃度 為0. lmg/ml時，它的最小粒徑是520.13nm。對于C組Ad/PEI-PEG-FA，當聚合物PEI-PEG-FA的 濃度為〇. 2mg/ml時，它的最小粒徑是355.55nm。裸腺病毒的粒徑和電位如圖12所示。與裸病 毒粒徑(122.16nm)相比，三種復合物粒徑均有所增加，且聚合物濃度不同，粒徑增加的幅度 也不相同。結果表明，PEI-PEG-PEI以及PEI-PEG-FA均能通過靜電作用與腺病毒復合。
[0195] 7.2聚合物/Ad復合物的表面電位
[0196] 將聚合物連接到帶負電荷的腺病毒表面會改變復合物表面總的電荷數。裸腺病毒 及復合物(Ad5/PEI-PEG-PEI，Ad5/PEI-PEG-FA)的表面電荷通過納米粒度電位儀進行測量， 結果如圖13所示。隨著聚合物濃度的增加，復合物的電位逐漸增大，且由負電逐漸變為正 電。對于三組而言，只有當聚合物的濃度均為0.05mg/ml時，其表面帶負電荷，且最小值為-4.323mV。在其他濃度下，復合物的表面電荷均呈現正電，與裸病毒(-17.13mV)表面電位相 比，說明聚合物通過離子鍵已經固定在腺病毒表面，形成了新型混合載體。
[0197] 表面電位，粒徑是決定復合載體被細胞吸收的兩個關鍵因素。一般來說，復合物的 正電性與細胞膜的負電性之間存在非特異性的正負電相互作用，所以較高表面電位有利于 復合載體進入細胞，但是過高正電性對細胞有較強的毒性;另外較小的粒徑有利于細胞內 吞。基于以上認識，我們認為選擇相對較小粒徑、表面電荷適量的復合載體，可以更好地被 細胞吸收，從而提高基因轉染效率。
[0198] 結合圖11與圖12的數據可知，對于Ad/PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)而言，當 PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)的濃度為 0.2mg/ml 時，其粒徑為 237.97nm，表面電荷為+ 3.765mV，有著較為理想的粒徑和適量表面正電。對于Ad/PEI-PEG-PEI (8100-2000-8100)而 言，當PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)的濃度為0. lmg/ml，其粒徑為520.13nm，表面電荷為+ 1.5mV較為適合。對于Ad/PEI-PEG-FA來說，當PEI-PEG-FA的濃度為0.2mg/ml時，它的粒徑為 355.55nm，表面電荷為+1.277mV，粒徑和表面電位較為合適。因此對于這三種復合物Ad/ PEI-PEG-PEI(2800-2000-2800)，Ad/PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)及Ad/PEI-PEG-FA而 言，我們分別選取濃度為〇. 2mg/ml、0. lmg/ml、0.2mg/ml用于掃描電鏡和透射電鏡的表征以 及其他各項生物學檢測。
[0199] 7.3聚合物/Ad復合物的掃描電鏡
[0200] 圖14為裸Ad以及Ad復合物在最優聚合物濃度下的SEM圖，可以看出裸病毒及Ad復 合物是球狀顆粒，體積大小均一且分布較為均勻。
[0201] 7.4聚合物/Ad復合物的透射電鏡
[0202]圖15顯示了裸病毒以及聚合物/Ad復合物在最優比例下的TEM圖，裸Ad以及復合物 均顯示出有規律的形態，且分布較好。相比裸病毒而言，Ad/PEI-PEG-PEI復合物顯示出明顯 的包裹結構，這個結果表明聚合物已經通過離子鍵固定在腺病毒的蛋白表面，形成了包裹 的腺病毒載體。
[0203] 試驗例3 Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合物體外活性研究（復合載體中的PEI-PEG-PEI的 分子量為 2800-2000-2800)
[0204] 3.1細胞培養
[0205] 3.1.1試劑 DMEM高糖培養基 Hye.lone 新生胎牛血清（Fetal Rrovine. Serum FES). B：i.o 1 ogical Indust.r.ies 0· 25%胰酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA) Gibco
[0206] 青-鏈霉素混含液 碧云天 二甲亞砜（DMS0) Α0ΚΕ 臺盼藍染色液 Beyotime ELISA 試劑盒 Elabscience
[0207] 卵巢癌細胞SK0V-3、人口腔表皮癌細胞KB均由四川大學華西科技園細胞庫贈送。
[0208] 3.1.2主要儀器 儀器 型號 廠家 二氧化碳細胞培養箱 Thermo 311 Thermo scientific 生物安全柜 BSC-1300IIA2 蘇凈安泰 倒置顯微鏡 CKX41 Olympus 臺式冷凍離心機 Centrifuge5810R Eppendorf 水浴鍋 SSW-600 上海博訊 立式壓力蒸汽滅菌器 LDZM-80KCS-II 上海申安醫療器械廠
[0209] 電熱鼓風千燥箱 GZX-9246MBE 上海博訊 .多功能酶標儀 EPOCH Β?α lek Instrument. 激光共聚焦熒光顯微鏡 1X83 Olympus 細胞計數板 BD Falcon公司 24孔板 BD Falcon公司 移液槍 KC14091O 德國Eppendorf公司 微型真空泵 GL-802B 海門市其林貝爾儀器制造公司
[0210] 3.1轉染效率研究
[0211] 腺病毒感染細胞的過程一般是：1.先結合CAR等細胞表面受體，再結合整合素。2. 內吞作用將腺病毒內化到細胞中并進入溶酶體。3.從溶酶體中釋放。4.腺病毒顆粒轉位到 細胞核。5.通過核孔將病毒DNA釋放到細胞核內。6.轉錄，復制，病毒包裝在細胞核中進行。 見圖16所示。
[0212] 因為不同細胞的感染復數(multiplicity of infection，M0I)不同，所以在病毒 正式感染目的細胞之前，需要先確定目的細胞中加入的病毒數。傳統的Μ0Ι概念起源于噬菌 體感染細菌的研究，其含義是感染時噬菌體與細菌的數量比值，也就是平均每個細菌感染 噬菌體的數量。噬菌體的數量單位為pfu。一般認為Μ0Ι是個比值，沒有單位，其實隱含的單 位是pfu number/cell。后來Μ0Ι被普遍用于病毒感染細胞的研究中，含義是感染時病毒與 細胞數量的比值。
[0213] 然而，由于病毒的數量單位有不同的表示方式，從而使Μ0Ι產生了不同的含義。能 產生細胞裂解效應的病毒如腺病毒、單純皰疹病毒等習慣上仍用pfu表示病毒數量，因此其 Μ0Ι的含義與傳統的概念相同。而對于某些病毒如AAV病毒，采用活性單位表示病毒數量，如 TU或IU，M0I的含義是指平均每個細胞感染病毒的活性單位數。如果采用病毒顆粒或基因組 數表示病毒數量，如v. P或v. g，Μ0Ι的含義便是指平均每個細胞感染病毒的病毒顆粒或基因 組數。這兩種表示方法在數值和含義上都有所不同，因此在使用過程中需要注意Μ0Ι的具體 含義和單位。
[0214] 各病毒載體在感染目的細胞時，實驗操作均有所不同，具體情況見表4所示。
[0215]表4各病毒載體感染目的細胞比較
[0216]
[0217] ；3.丄.丄佛疋敢1兀恐栄一見數觀丄
[0218] 本實驗所用的細胞株為葉酸受體高表達的SK-0V-3細胞和KB細胞，其中SK-0V-3細 胞用RPMI MEDIUM 1640培養液，加10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青霉素/鏈霉素），KB細胞 用DMEM培養液，加10%胎牛血清和1 %的雙抗，將這兩種細胞置37°C、5 %C02培養箱中培養。 當細胞生長密度為80 %左右時，用0.25%的胰酶消化并傳代。
[0219] 細胞轉染過程：
[0220] 1、細胞鋪板:準備24孔板，先向第一個孔內加入少量無血清培養基，晃動浸潤整個 孔底，然后用移液槍吸至第二孔，其他孔依次類推，目的是讓細胞鋪板時分散更均勻。將SK-0V-3細胞、KB細胞以1X10 5細胞每孔接種到24孔板，每孔分別加入500ul完全培養基，加完 后放工作臺靜置一下，然后在37°C、5%C〇2培養箱中培養24h。
[0221] 2、感染貼壁細胞
[0222] (1)若細胞匯集度為50 %左右，則準備下述實驗。吸走原有培養基，更換為250ul不 含血清的培養基。
[0223] (2)冰上解凍腺病毒，計算需要添加的病毒量，并對其濃度進行稀釋。吸取lOOul病 毒原液(C〇 = l X 101()PFU/ml)，加入到900ul培養目的細胞所用的培養基中，混勻，標記濃度 為(& = 1 X 109PFU/ml)，類似方法得到濃度為(C2 = 1 X 108PFU/ml)
[0224] Μ0Ι(感染復數）=病毒個數/轉染時細胞數
[0225] 所需的病毒體積=病毒個數/病毒滴度
[0226] (3)將濃度曲線設為0、10、100、1000，其中^)1為0作為負性控制來檢測細胞生長與 死亡。在各孔中加入特定Μ0Ι值的腺病毒各10ul，8字混勻后放入培養箱感染2h，然后補充 250ul含有血清的新鮮培養基。
[0227] (4)在37°C繼續培育細胞24h。
[0228] (5) 24h后換液，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態。
[0229] 如圖17、18所示，對于SK-0V-3細胞、KB細胞而言，當感染復數Μ0Ι = 0，也就是不加 入腺病毒時，兩個細胞不表達熒光，從白光下觀察細胞生長狀況良好。當M0I = 10時，兩種細 胞均能看到些許熒光，熒光強度不高，說明轉染效率一般。當Μ0Ι = 100時，熒光強度明顯增 強，表明轉染效率有所提高。當Μ0Ι = 1000時，SK-0V-3細胞熒光強度很高，而KB細胞熒光強 度沒有明顯提高。一般高數量的病毒能夠引起細胞毒素的副作用，因此，在實驗中在保證轉 染效率的前提下應盡量選擇較低點的Μ0Ι，減少對其他正常細胞的損傷。因此，將最優感染 復數確定為100。
[0230]將篩選出的葉酸受體陽性SK-0V-3細胞及KB細胞進行培養，傳代幾次后將這2種細 胞分別接種到24孔板，每孔加入500ul含血清培養基，使細胞濃度為1 X 105/ml細胞，在37 °C、5 %⑶2培養箱中培養24h。然后更換為250ul新鮮培養基，分別在每孔加入不同比例的 PEI-PEG-PEI/FA聚合物（10ul)與腺病毒（10ul)的復合物，37°C下培養2h后補充250ul的含 血清培養基繼續培養24h，最后觀察GFP表達情況。
[0231] 為了對比實驗結果，將之前篩選出的葉酸受體表達陰性的SK-0V-3細胞及KB細胞 也做上述實驗。結果如圖19、20所示。對于KB細胞而言，裸病毒轉染KB細胞時，熒光強度很 弱，表明轉染效率非常低。用Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA復合物轉染KB細胞時，隨著PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA摩爾比的不斷降低，熒光強度進一步增強。特別是當二者的摩爾比 nPEI-PEG-PEl/nPEI-PEG-FA= 1/4時，焚光強度顯著增強，轉染效率大幅度提高。同時，不含葉酸的 培養基篩選的KB細胞其熒光表達量更強一些，這是因為若細胞培養的環境中缺乏葉酸，則 細胞為葉酸受體高表達，而葉酸受體陽性其親和力更好，因此在轉染過程中熒光強度更高， 結果表明：Ad/PE I -PEG-PEI /PE I-PEG-FA三元復合物的病毒轉染效率明顯高于Ad/PE I-PEG-FA二兀復合物和Ad/PEI-PEG-PEI二兀復合物的病毒轉染效率，且npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa= 1/4 時，Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA三元復合物的病毒轉染效率最高。
[0232] 對于SK-0V-3細胞而言，實驗結果與KB細胞類似。裸病毒轉染SK-0V-3細胞時，熒光 強度很弱，轉染效率低。用Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA復合物轉染SK-0V-3細胞時，隨著 PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA摩爾比的降低，熒光強度逐漸增強。當二者的摩爾比nPEI-PEG- PEI/ nPEI-PEC-FA= 1/4時，焚光強度較大，轉染效率同樣最高。另一方面，從圖中可以看出葉酸受體 陽性細胞總體熒光強度要更強。
[0233] 3.2免疫原性研究
[0234] 選用年齡6-8周歲雌雄各半的SPF級C57小鼠（購買于北京維通利華實驗動物技術 有限公司）適應環境一段時間過后，將實驗動物分為三組，其中A組注射腺病毒，B組注射聚 合物修飾的腺病毒，C組注射生理鹽水。
[0235] 采用尾靜脈注射的方式，每只動物均給予50ul的劑量(其中腺病毒為101()VP)。實驗 第1天和第14天分別給藥后，第28天動物框靜脈采血。最后分離血清，將其保存于-80°C冰 箱，用于后續血清樣品中和抗體的檢測。
[0236] 3.2.1 ELISA 實驗
[0237] ELISA-般可用于測定抗原和抗體，它的原理是:抗原與抗體的特異反應。測量時， 抗原(抗體)先結合在固相載體上，保留其免疫活性，然后加抗體(抗原）與酶結合成的偶聯 物(標記物），此偶聯物保留原免疫活性與酶活性，當偶聯物與固相載體上的抗原(抗體)特 異反應結合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色，所產生的顏 色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比，可以用酶標儀定量測定。
[0238] 根據具體條件可設計出不同類型的檢測方法，用于臨床檢驗的ELISA主要有以下 幾種類型：1.直接法2.間接法3.雙抗體夾心法測抗原4.雙抗原夾心法測抗體5.競爭法測抗 體等，如圖21所不。
[0239] 本實驗中利用小鼠免疫球蛋白G(IgG)酶聯免疫分析試劑盒測定小鼠血清中免疫 球蛋白G(IgG)的含量。該試劑盒采用雙抗原夾心法測定標本中小鼠免疫球蛋白G(IgG)水 平。雙抗原夾心法的原理同雙抗體夾心法原理類似，是以包被抗原和酶標抗原檢測待檢抗 體，反應層次為:包被抗原一待檢抗體一酶標抗原一底物。操作步驟是：1、將已知抗原包被 固相載體，形成固相抗原。洗滌除去未結合物。2、加入待撿標本，溫育，使待檢抗體和固相抗 原結合。洗滌取出未結合物。3、加入酶標抗原，溫育，形成固相抗原-待檢抗體-酶標抗原復 合物。洗滌除去未結合物。4、加底物顯色。具體的操作過程如下：
[0240]從冰箱中取出試劑盒，放置20min平衡至室溫。用雙蒸水將25倍的濃縮洗滌液稀釋 成原倍洗滌液。在凍干標準品中加入lml標準品稀釋液，靜置10分鐘，待其充分溶解后，用移 液器將其輕輕混勻，標記濃度為l〇〇ng/mL，然后稀釋成以下濃度：100、50、25、12.5、6.25、 3.13、1.56、0ng/ml。取所需數量的酶標包被板，固定在框架上。分別設空白孔、標準孔和待 測樣品孔。在空白孔加樣品稀釋液l〇〇ul，標準孔加入標準品lOOul，待測樣品孔內分別加入 樣品原液、稀釋5倍樣品及稀釋10倍樣品各100ul。給酶標板覆膜，37 °C恒溫箱孵育90min。棄 去液體，甩干，每個孔中加入生物素化抗體工作液1 〇〇ul，酶標板加上覆膜，在37 °C溫育 60min。棄去孔內液體，甩干后，每孔加入350ul洗滌液，浸泡l-2min后甩干，在吸水紙上輕拍 將孔內液體拍干，如此重復洗板3次。每孔加100ul酶結合物工作液，加上覆膜后在37°C溫育 30min。棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每孔加入90ul底物溶液，酶標板加上覆膜37 °C避光顯 色15min，當標準孔出現明顯梯度時即可終止。每孔加入終止液50ul，終止反應，此時觀察到 藍色轉為黃色。用酶標儀在450nm波長下測量各孔的吸光值(0D值），根據標準品的0D值，計 算出標準曲線的直線回歸方程，然后將樣品的0D值代入方程式，計算出對應的樣品濃度，最 終濃度為稀釋倍數乘以實際測定濃度。
[0241] 將原樣品稀釋10倍后，采用ELISA法測得的標準曲準及小鼠血清中腺病毒IgG抗體 水平分別如圖22、23所示。從圖中可以看出，正常小鼠體內抗腺病毒抗體的水平較低，如果 注射裸病毒后，會促使小鼠體內產生大量的抗腺病毒抗體。但是將腺病毒與聚合物結合而 成的復合物注射在小鼠體內，則小鼠的抗腺病毒抗體水平有所下降。因為腺病毒能被免疫 系統識別，產生的野生腺病毒抗體和反復給藥后誘發的中和抗體會抑制病毒復制，所以我 們希望這種抑制作用降到最小，結合實驗結果可以看出，我們構建的PEG松散修飾的溶瘤腺 病毒基因傳遞系統能夠在一定程度上減少小鼠體內抗腺病毒抗體的產生。
[0242] 3.2.2中和抗體的分析
[0243] ELISA實驗初步證實，包裹后的病毒刺激小鼠免疫系統的能力較弱，血清內抗病毒 抗體的濃度相對比較低，為進一步評價腺病毒刺激機體所產生抗體對病毒復制、轉染效率 的影響，我們希望通過使用含抗體的小鼠血清與攜帶GFP基因的裸病毒孵育，考察中和抗體 的情況。
[0244]將生長狀態良好的SK-0V-3細胞和KB細胞分別接種到24孔板，使細胞濃度為IX 105/ml，分別加入500ul RPMI 1640培養基和DMEM培養基，在培養箱中培養24小時。保證第 二天進行病毒感染時，細胞匯合率介于50%至70%之間。24小時后更換為250ul的新鮮培養 基，然后在孔中加入l〇ul含抗體的小鼠血清及10ul腺病毒，為使結果具有可比性，每孔中的 腺病毒感染復數相同，每個梯度下設2個復孔。在37°C感染2小時后，不換液，追加250ul的完 全培養液，繼續感染過夜。24小時后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察GFP表達。結果如圖 24、25所示。
[0245] 對于KB細胞而言，將兩種血清分別稀釋20倍及40倍后與腺病毒孵育，相比而言，注 射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清與腺病毒孵育后，熒光表達量要更強，轉染效率 更高，并且稀釋40倍的血清其熒光表達量均要高于稀釋20倍的血清。
[0246] 腺病毒特定的中和抗體能夠修飾腺病毒衣殼蛋白，且抑制病毒在體內的復制，因 此腺病毒傳遞載體面臨的阻礙之一就是中和抗體的誘導作用。實驗結果表明，與裸腺病毒 相比，通過聚合物修飾溶瘤腺病毒表面，腺病毒特定中和抗體的產生明顯減少。另一方面， 在適應性免疫反應中，PEG共價結合腺病毒起到更好的保護作用，相比裸腺病毒，PEG在降低 適應性免疫反應中具有重要作用。
[0247] 由于中和抗體抑制腺病毒的復制，從而導致腺病毒載體無法重復起作用，若通過 靜脈注射，腺病毒特定中和抗體的減少能夠使腺病毒重復且多次起作用，從而具有很好的 治療效果。對于SK-0V-3細胞，研究結果與KB細胞類似。注射Ad/PE I-PEG-PEI/PE I-PEG-FA的 小鼠血清與腺病毒孵育后，熒光表達量要強于注射裸病毒的小鼠血清，說明其轉染效率顯 著提高。上述實驗結果均表明：用陽離子聚合物"物理吸附"包裹病毒的復合基因載體能夠 減少體內中和抗體的產生，從而降低機體的免疫反應。
[0248] 試驗例4 Ad/roi-PEG-TOI/FA復合物抑制腫瘤活性的動物試驗（復合載體中的 PEI-PEG-PEI 的分子量為 2800-2000-2800)
[0249] BALB/c-nu小鼠，SPF級，4-6周齡，體重（20-30)g，雄雌不限，15只，右前肢腋下部位 接種人口腔上皮癌KB細胞，1 X 107/mL，150ul。小鼠成瘤后（~80mm3)，尾靜脈給藥，隔天一 次，連續3次。包括生理鹽水組、治療組(Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合物，現用現配，終濃度病毒 濃度0·5X10 11PFU，PEI-PEG-PEI濃度0·6mg/mL和/FA-PEG-PEI濃度2·4mg/mL)，連續觀察35 天。病毒載體為刪除Elb-55kb序列，具有一定腫瘤靶向啟動活性，并攜帶IL-24的工具病毒。 [0250]實驗結果顯示（如圖27所示），生理鹽水組的腫瘤持續生長，使用了病毒的腫瘤生 長都不同程度受到了抑制，其中，包裹病毒的Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合物的抑瘤率顯著高于 裸病毒(P〈〇.〇5)。
[0251] 試驗例5 Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合物體內分布研究
[0252] BALB/c-nu小鼠，SPF級，4-6周齡，體重（20-30)g，雄雌不限，3只，右前肢腋下部位 接種人口腔上皮癌KB細胞，1 X 107/mL，150ul。小鼠成瘤后（~200mm3)，尾靜脈給藥，隔天一 次，連續3次。最后一次給藥后72小時，安樂死后取腫瘤組織和肝臟，勻漿后，熒光定量PCR檢 測病毒體內分布情況。
[0253] (PCR檢測所用引物:AE-F: CGGAGCTATGCTAACCAGCGTA，
[0254] AE-R:TGAGCATGACTACGATGTGCTTTC，
[0255] ΑΕρ:fam+CGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAA+BHQl)。
[0256] 結果顯示，肝臟組織中未檢測出病毒基因，腫瘤組織中測得平均絕對1.03 X 106拷 貝，即本發明腫瘤靶向腺病毒復合載體的包裹可以大大提高病毒在腫瘤組織中的定向分 布，減少在肝臟中的蓄積。
【主權項】
1. 腫瘤靶向腺病毒復合載體，其特征在于：其組成為由三嵌段聚合物pei-peg-pei和 PEI-PEG-FA和Ad形成的復合物;其中，PEI為聚乙烯亞胺，PEG為聚乙二醇，FA為葉酸，Ad為腺 病毒。2. 根據權利要求1所述的腫瘤靶向腺病毒復合載體，其特征在于:所述的PEI分子量為 2500~8500,所述PEG分子量為2000;所述的腺病毒為2型腺病毒或5型腺病毒;所述的PEI分 子量優選為2800;所述的腺病毒優選為5型腺病毒。3. 根據權利要求2所述的腫瘤靶向腺病毒復合載體，其特征在于：所述的PEI為線狀 PEI;所述的腺病毒為腫瘤靶向啟動子控制復制缺陷型腺病毒，所述的腺病毒優選為缺失El 和E3基因區的腺病毒。4. 根據權利要求1~3任一項所述的腫瘤靶向腺病毒復合載體，其特征在于= PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾比為1:2~6 ;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的摩 爾比為IX IO3~2 X105:l ;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的摩爾比優選為 1.5 X IO3~1.5 X IO5:1;PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾總量與Ad顆粒的摩爾比最優選為 1.5X10 3:1〇5. 根據權利要求4所述的腫瘤靶向腺病毒復合載體，其特征在于:PEI-PEG-PEI與PEI-PEG-FA的摩爾比為1:4;當PEI分子量為2800時，復合載體中的PEI-PEG-PEI濃度為0.02~ 0.6mg/ml，復合載體中的PEI-PEG-FA濃度為0.08~2.4mg/ml，復合載體中的腺病毒濃度為 IO9~IO11PFU;當PEI分子量為2800時，復合載體中的PEI-PEG-PEI濃度優選為0.6mg/ml，復 合載體中的PEI-PEG-FA濃度優選為2.4mg/ml，復合載體中的腺病毒濃度優選為10 nPFU。6. 抗腫瘤藥物，其特征在于:含有權利要求1~3任一項所述的腫瘤靶向腺病毒復合載 體。7. 權利要求1~3任一項所述的腫瘤靶向腺病毒復合載體在制備治療抗腫瘤藥物中的 用途。8. 制備權利要求1~5任一項所述的腫瘤靶向腺病毒復合載體的方法，其特征在于包括 如下步驟： a、 用稀釋液將PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA分別稀釋至濃度為0.05~5mg/ml，然后通過 0 · 22um孔徑的過濾器進行過濾； b、 用稀釋液將腺病毒稀釋至滴度為0.5 X IOiq~I X IO11PFU; c、 將a步驟過濾后的PEI-PEG-PEI液與PEI-PEG-FA液混合，然后滴加入到的腺病毒溶液 中，混勻，在室溫條件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA復合載體； 其中，所述的稀釋液為PBS液、去離子水或5wt%葡萄糖溶液;所述的稀釋液優選為PBS 液。9. 根據權利要求8所述的制備腫瘤靶向腺病毒復合載體的方法，其特征在于：所述的 PEI-PEG-PEI采用下述方法制備得到： 1)、合成 TsO-PEG-OTs 以Et3N和CHCl3為溶劑，使PEG與TsCl在室溫條件下進行對甲苯磺酰化，反應時間為0.5-2h;反應后的產物加入CHCl 3使其溶解，然后加入去離子水，靜置分層，下層有機相溶液用飽 和NaCl溶液再進行萃取，萃取結束后蒸掉多余CHCl3溶劑;將乙醚溶液緩慢滴入上述萃取液 中，然后靜置分層，將下層乳濁液進行離心分離，制得TsO-PEG-OTs; 2) 合成 PEtOZO-PEG-PEtOZO 以陽離子聚合物2-乙基-2-惡唑啉(EtOZO)為底物，TsO-PEG-OTs作為引發劑，在惰性氣 體保護條件下，以乙腈為溶劑，于65-75Γ反應65-75h;反應完成后蒸掉多余的乙腈溶劑，然 后用三氯甲烷溶解產物，再將產物緩慢滴入乙醚中，靜置分層，下層沉淀物離心，制得 PEtOZO-PEG-PEtOZO; 3) 水解 PEtOZO-PEG-PEtOZO在10 %鹽酸溶液、100°C、惰性氣體保護條件下水解16小時，然后將 水解后的混合物pH值調至12.5，析出沉淀，離心分離沉淀即得PEI-PEG-PEI。10.根據權利要求9所述的制備腫瘤靶向腺病毒復合載體的方法，其特征在于：步驟1) 中PEG、TsCl和Et3N的摩爾比為1:2~4:3~5;PEG、TsCl和Et3N的摩爾比優選為1:3:4。
【文檔編號】C12N15/64GK105907787SQ201610326722
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】雷寧, 張青
【申請人】成都理工大學