一種蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法
【專利摘要】蚯蚓是一種自然中非常重要的動物，其體內含有豐富的蛋白質和多種人體所需的氨基酸，其中一類具有纖溶酶活性的蛋白質——蚓激酶具有很高的藥用和經濟價值。蚓激酶可通過口服后經腸胃進入血液，降低血液粘稠度和改善微循環，對多種心腦血管疾病具有良好的治療作用，當前國內外許多科研機構都在致力于這類新藥的開發。我國一直有人工養殖蚯蚓的傳統，但產品的經濟價值較低，本發明旨在提供一種蚓激酶高效提取的方法，采用分段鹽析的方式，節省提取成本，提高所提取蚓激酶的活性和純度。
【專利說明】
一種蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法，屬于生物工程和制藥領域。
【背景技術】
[0002]蚯蚓是一種常用的動物藥材，在傳統中醫理論中，蚯蚓具有解熱、定驚、利尿、降壓等功效。現代研究發現，蚯蚓含有豐富的蛋白質和多種人體所需的氨基酸，其蛋白含量甚至超過大豆蛋白。上世紀80年代，日本研究人員在蚯蚓體內提取出一類具有纖溶酶活性的蛋白質，命名為蚓激酶。蚓激酶具有溶解人體血管內纖維蛋白和激活纖維酶原間接溶解纖維蛋白的雙重作用，是目前最具有開發前景的纖溶藥物之一。在臨床上，蚓激酶可通過口服后經腸胃進入血液，降低血液粘稠度、改善微循環。對心腦血管病、血栓病、高血壓、動脈硬化等具有良好的治療作用。蚓激酶的穩定性好、纖溶活性強、藥理作用廣泛、口服有效、副作用小，目前國內外許多科研機構都在致力于這類新藥的研發。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種蚓激酶的高效提取方法。
[0004]本發明的技術方案如下:
(1)清洗蚯蚓
使用自來水洗滌蚯蚓數次，清洗蚯蚓表面并刺激其排出體內污物，將蚯蚓從水中撈出后，用濾紙吸去多余水分，稱重；
(2)勻漿
加入PH為7.8的緩沖液，每克重量蚯蚓加入2ml緩沖液，于勻漿器中勻漿10分鐘，破壞蚯蚓細胞膜，使蚓激酶從蚯蚓細胞中釋放出來，置于4°C冰箱中冷藏4小時，在4 °C離心機中高速離心10分鐘，取上清液；
(3)鹽析
向步驟(2 )中的上清液加入硫酸銨，使硫酸銨在溶液中的質量分數為18.5%，高速離心10分鐘，收集上清液。再加入硫酸銨使其在溶液中的質量分數為35.9%，于4°C冰箱中靜置過夜，高速離心1分鐘，收集沉淀；
(4)超濾
向鹽析后的沉淀物中加入緩沖液，使其溶解，對溶液進行超濾，去除溶液中的鹽和其它小分子物質，同時濃縮溶液體積；
(5)真空冷凍干燥
將超濾后的溶液進行真空冷凍干燥，冷凍溫度_60°C以下，升華溫度不高于30°C，干燥時間12小時，即可獲得蚓激酶干粉。
[0005]本發明優點
本發明采用了分段鹽析的方法進行蚓激酶的提取，由于不同的蛋白質的溶解度與等電點不同，沉淀時所需的離子強度也不同，改變鹽的濃度與溶液的PH值，可將混合液中的蛋白質分批鹽析出來。一般蛋白質在質量分數為15%的硫酸銨溶液中開始沉淀，而當硫酸銨質量分數達到18.5%后，沉淀基本不再增加，故第一次鹽析的最佳濃度為18.5%。第二次鹽析中硫酸銨的質量分數在32%以上時，都可以算是最佳濃度。雖然當硫酸銨濃度較高時可以沉淀全部蛋白質，但多出來的沉淀很可能不是蚓激酶，反而會使產品純度降低，所以選擇35.9%作為第二次鹽析的濃度。
【具體實施方式】
實施例
[0006](I)清洗蚯蚓
取活蚯蚓，使用自來水洗滌蚯蚓數次，清洗蚯蚓表面并刺激其排出體內污物，將蚯蚓從水中撈出后，用濾紙吸去多余水分；
(2)勻漿
稱取清洗瀝干后的蚯蚓10g，加入200 ml pH為7.8的緩沖液(磷酸氫二鈉3.58g，加水溶解并稀釋至100 ml為A液，取磷酸二氫鈉0.78g，加水溶解并稀釋至500 ml為B液，將A、B兩液混合至PH為7.8)，于勻漿器中勻漿10分鐘，破壞蚯蚓細胞膜，使蚓激酶從蚯蚓細胞中釋放出來，置于4 °C冰箱中冷藏4小時，在4 °C離心機中10000 rpm離心1分鐘，取上清液；
(3)鹽析
向步驟(2 )中的上清液加入硫酸銨，使硫酸銨在溶液中的質量分數為18.5%，高速離心10分鐘，收集上清液。再加入硫酸銨使其在溶液中的質量分數為35.9%，于4°C冰箱中靜置過夜，高速離心1分鐘，收集沉淀；
(4)超濾
向鹽析后的沉淀物中加入200 ml緩沖液，使其溶解，使用截留分子量為7k的超濾膜對溶液進行超濾，去除溶液中的鹽和其它小分子物質，200 ml的溶液，超濾后體積為50 ml，濃縮4倍；
(5)真空冷凍干燥
超濾后的溶液進行真空冷凍干燥，冷凍溫度_60°C以下，升華溫度不高于30°C，干燥時間12小時，蚓激酶酶粉產率為蚯蚓重量的3-5%，經酶活測定，所得蚓激酶酶粉的酶活為1250u/mgo
【主權項】
1.一種蚓激酶的高效提取方法，其特征在于: (1)使用pH為7.8的磷酸鹽作為緩沖液，每克重量艇蚓加入2ml緩沖液； (2)采用分段鹽析提取蚓激酶，向勻漿離心后的上清液中加入硫酸銨，使硫酸銨的質量分數為18.5%，高速離心1分鐘，收集上清液。2.再加入硫酸銨至質量分數為35.9%，于4°C冰箱中靜置過夜，高速離心10分鐘，收集沉淀。3.根據權利要求1所述的蚓激酶高效提取方法，其特征在于所述第(I)步中使用pH為7.8的磷酸鹽作為緩沖液。4.根據權利要求1所述的蚓激酶高效提取方法，其特征在于所述第(I)步中每克重量蚯蟲弓丨加入2ml緩沖液。5.根據權利要求1所述的蚓激酶高效提取方法，其特征在于所述第(2)步中采用分段鹽析提取蚓激酶，第一次鹽析硫酸銨的質量分數為18.5%，第二次鹽析硫酸銨質量分數為.35.9%o
【文檔編號】C12N9/68GK105907738SQ201610525548
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】黃訪, 王紅, 李維尊, 王強, 黃磊, 胡會信
【申請人】奧為（天津）環保科技有限公司