一種表皮生長因子受體的單克隆抗體及其應用
【專利摘要】本發明涉一種表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。前述的單克隆抗體能用用于檢測癌細胞的試劑盒中的應用，所述癌細胞優選為表皮腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、結腸癌以及相關疾病的治療。CGMCC No. 1204620160310
【專利說明】
一種表皮生長因子受體的單克隆抗體及其應用
技術領域
[0001 ]本發明涉一種表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR)的 單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株以及所述的抗體的應用。
【背景技術】
[0002] 原癌基因被激活會導致基因變異，而基因變異與惡性腫瘤的發生、發展有著密切 的關系。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)主要位于細胞質 膜上，屬于受體酪氨酸激酶家族，受到表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等配 體激活后通過二聚化引發細胞內域形成酪氨酸激酶活性，并進一步激化下游的細胞信號轉 導通路，完成跨膜信號轉導過程（1)。表皮生長因子受體(EGFR)的編碼基因是一種原癌基 因，在正常的生理狀態下它不表達或只是有限制的表達，不具有致癌性。但是如果該基因發 生突變，便會導致表皮生長因子受體大量產生，增強細胞信號的傳導，容易誘發癌癥(2)。研 究表明，EGFR至少與33 % -50 %的人類表皮腫瘤相關(3 )，是表皮腫瘤治療的重要靶點。EGFR 在許多腫瘤細胞中高比例表達，頭頸癌中為90%-95%、乳腺癌中為82%-90%、腎癌中為 76%-89%、子宮頸癌中為90%。在胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤細胞中 也都存在EGFR的高水平表達。
[0003] 表皮生長因子受體(EGFR)是一個巨大的跨膜糖蛋白，分子量約為HOKDaiGFR為I 型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，定位于細胞膜，與HER2/ErbB-2/Neu/pl85、HER3/ErbB-3、 HER4/ErbB-4等同歸于HER/ErbB家族(4)。由胞外區、跨膜區、以及胞內區三部分組成（5)。其 配體包括表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF)、轉化生長因子a(transforming growth factor-α，TGF_a)、β-細胞素 （beta cellulin，BTC)、雙調蛋白（amphiregulin)、表 皮素（epiregulin)、肝素結合的表皮生長因子(heparin-binding EGF,HB-EGF)等，以EGF和 TGF-α最為重要。EGFR與其他配體胞外區結合后相互作用形成同源二聚體或異源二聚體。與 同源二聚體相比，異源二聚體在介導細胞增值、分化、迀移等信號傳遞中起著更為重要的作 用(6)。二聚體的形成導致細胞內酪氨酸激酶區的激活，進而通過轉磷酸化和磷酸化作用， 促使受體酪氨酸殘基磷酸化，啟動一系列級聯反應。EGFR活化可分為三個步驟（l)EGFR與配 體結合可導致受體形成同源二聚體，也可與其他EGFR家族形成異源二聚體；（2)二聚體的形 成促使EGFR胞內區6個特異的受體酪氨酸殘基磷酸化，分別依次將外界各種信號轉導至胞 內。主要通過兩種途徑將信號傳遞至細胞核，一條是Ras-Raf-MAPK途徑；另一條是PI3K-PKC-IKK途徑；（3)當信號傳導至細胞核后，引起核內基因轉錄水平的增加，使細胞增值、轉 化，使EGFR表達增高（7)。
[0004] 隨著對信號轉導及其異常與腫瘤關系的研究的不斷深入，提出了信號轉導干預治 療這一全新的概念。信號轉導干預治療，即通過單克隆抗體、免疫毒素、酪氨酸激酶抑制劑， 反義核苷酸、顯性負性突變體等物質，針對信號轉導通路中發生異常的環節來干預這種不 正常的信號轉導，從而達到抑制腫瘤生長的目的。EGFR單克隆抗體是與內源性配體競爭結 合EGFR，通過抑制酪氨酸激酶的活性、促進EGFR內化等作用產生抗腫瘤效應，與其他化療藥 物相比，EGFR單抗作用特異性強，副作用小，在臨床上取得了較好的療效。
【發明內容】
[0005] 為了克服上述技術難題，本發明提供了一種雜交瘤細胞系，其特征在于，所述雜交 瘤細胞系的保藏號為CGMCC No. 12046。
[0006] 本發明的另一個方面提供了一種由前述的雜交瘤細胞系分泌的表皮生長因子受 體的單克隆抗體，其特征在于，其能夠特異地結合表皮生長因子。
[0007] 本發明的再一個方面提供了一種前述雜交瘤細胞及前述的單克隆抗體在檢測靶 蛋白表皮生長因子中的應用。
[0008] 本發明的再一個方面提供了一種包含前述的雜交瘤細胞和/或前述的單克隆抗體 的試劑盒。
[0009] 本發明的再一個方面提供了前述的雜交瘤細胞及前述的單克隆抗體在檢測癌細 胞的試劑盒中的應用，所述癌細胞優選為表皮腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、非小細 胞肺癌、前列腺癌、結腸癌。
[0010] 本發明的再一個方面提供了前述的雜交瘤細胞及前述的單克隆抗體在制備治療 EGFR的過表達疾病藥物中的用途，優選地，EGFR的過表達疾病為表皮腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、 腎癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、結腸癌。
[0011] 本發明還提供了一種雜交瘤細胞株6H11及其產生的單克隆抗體的制備方法：
[0012] 1.抗原制備
[0013] (1)獲得目的基因
[0014] Trizol Reagent試劑提取HeLa細胞總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA并以cDNA為模板 PCR擴增EGFR基因。
[0015] (2)構建重組表達載體
[0016]將步驟（1)獲得的PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體 pET41a，構建重組質粒pET41a-EGFR。載體經過酶切和測序鑒定后用于轉化表達細菌。
[0017] (3)獲得含重組表達質粒的表達菌種
[0018]將步驟(2)獲得的重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固體培養基篩選，挑取單克隆用于抗原表達。
[0019] ⑷誘導表達和純化
[0020] 將含有表達質粒的R〇setta(DE3)細菌單克隆接種于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養基中，37度，220rpm培養10hr。將菌液按1:100稀釋倍數接種于200ml新鮮的LB培養 基，培養至0D值為0.6，加入0.1 mM IPTG誘導表達，20度5hr，收集菌液超聲破碎，從上清中純 化重組抗原EGFR。
[0021] 2.單克隆抗體的制備和純化
[0022] (1)免疫動物
[0023] 一般使用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方法進行三次免疫注射。
[0024] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射0.2ml乳化液（100ul純化的重 組蛋白EGFR(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏完全佐劑，含100ug抗原）。
[0025] 第二次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul純化的 重組蛋白EGFR(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含lOOug抗原）。
[0026]第三次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul純化的重組蛋白EGFR(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含lOOug抗原）。
[0027]測效價根據融合時間安排，第三次免疫7-10天后取血檢測，用常規的western法檢 測效價，選擇效價達到1:1000的小鼠用于融合。
[0028]加強免疫融合前3天，向待取脾小鼠進行加強免疫，小鼠腹腔注射200ul液體（含 60ug抗原，溶劑為1 X PBS，pH7 · 4)。
[0029] (2)細胞融合
[0030] 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，放入帶200目不銹鋼網的平皿 中研磨，制備細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇（50% )。采用HAT選擇培養基，進行雜交瘤細胞的選 擇性培養和篩選。
[0031] 用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為8ug/ml加入96孔酶標板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被過夜。棄去包被液，用 PBST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。將雜交瘤細胞培養上清加入酶標板lOOul/well，同時加入PBST(磷酸鹽緩 沖液)作為陰性對照。37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul終止液（2mol/L硫酸）。使用酶標儀測 定，酶標儀設置為:450nm比色。和陰性對照相比，如果是0D值2.5倍之上就是陽性。最后篩選 得到一株效價最好(如果有效價數據，建議加入）的抗EGFR的雜交瘤細胞株，命名為6H11，亞 型鑒定為IgGl。
[0032] 將篩選出的陽性雜交瘤細胞株6H11進行單克隆篩選(有限稀釋法），獲得能產生 高效價(WB稀釋比>1:1000)單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養，并凍 存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人EGFR雜交瘤細胞系6H11，該細胞系已保存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 12046。
[0033] (3)單克隆抗體的制備與純化
[0034]將步驟(2)獲得的細胞株6H11接種至BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中純 化抗體(所獲抗體命名為anti-EGFR)。
[0035] 抗EGFR單克隆抗體的純化：使用Protein G親和純化法。將用PB溶液平衡好的 Protein G填料裝入純化柱中，加入經PB溶液稀釋的單克隆抗體anti-EGFR的腹水過柱。上 樣結束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然后用0.1M pH3.0的甘氨酸-鹽酸溶液洗 脫，收集整個洗脫峰的溶液。洗脫液經過透析濃縮并更換為PBS溶液。SDS-PAGE結果顯示，純 化后抗體純度在95 %以上(參見圖1)。
[0036]本發明的小鼠雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCC No. 12046,保藏單位為中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3 號中國科學院微生物研究所;保藏日期為2016年3月10日。
【附圖說明】
[0037] 圖1、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SD S-P AGE )檢測純化的EGF Receptor 抗體
[0038] 圖2、免疫印跡檢測不同裂解液(⑶S7、A549、MDA-MB-468)中EGF Receptor蛋白的 表達(抗體稀釋倍數1:1000)
[0039] 圖3、EGF Receptor抗體的免疫熒光測試（所用細胞系：HeLa、MDA-MB-468,抗體稀 釋比1:200)
[0040]圖4、EGF Receptor抗體的免疫沉淀檢測
[00411圖5、EGF Receptor抗體的免疫組化檢測（非小細胞肺癌病理切片，抗體稀釋比1: 800)
【具體實施方式】
[0042]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。
[0043]試劑、酶、載體及細胞株：
[0044] (1)細胞株:HeLa( ATCC?CCL_2?)、大腸桿菌Rosetta(DE3) (Novagen)、骨髓瘤細 胞 SP2/0(ATCC?CRL-1581?)、A549(ATCC@CCL-185?)、C0S7(ATCC?CRL-1651tm)和 MDA-MB-4HH( ATCC? HTB-132?)。
[0045] (2)實驗動物:雌性BALB/c小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）；
[0046] (3)載體：pET41a(Novagen)
[0047] (4)酶及抗體試劑:構建載體過程和PCR過程的各種酶購自Fermentas，ELISA實驗 所用抗體anti-mouse IgG/HRP(Jackson ImmunoResearch)，ELISA底物TMB(Sigma)、逆轉錄 試劑盒(Fermentas)，BSA購自（北京元亨金馬生物科技有限公司）
[0048] (5)、其他試劑如無特別說明為國產分析純。
[0049] 實施例1:雜交瘤細胞株6H11及其產生的單克隆抗體的獲得
[0050] 1.抗原制備
[0051] (1)獲得目的基因
[0052] Trizol Reagent試劑提取HeLa細胞總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA并以cDNA為模板 PCR擴增EGFR基因。
[0053] (2)構建重組表達載體
[0054]將步驟（1)獲得的PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體 pET41a，構建重組質粒pET41a-EGFR。載體經過酶切和測序鑒定后用于轉化表達細菌。
[0055] (3)獲得含重組表達質粒的表達菌種
[0056]將步驟(2)獲得的重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固體培養基篩選，挑取單克隆用于抗原表達。
[0057] (4)誘導表達和純化
[0058]將含有表達質粒的Rosetta(DE3)細菌單克隆接種于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養基中，37度，220rpm培養10hr。將菌液按1:100稀釋倍數接種于200ml新鮮的LB培養 基，培養至0D值為0.6，加入0.1 mM IPTG誘導表達，20度5hr，收集菌液超聲破碎，從上清中純 化重組抗原EGFR。
[0059] 2.單克隆抗體的制備和純化
[0060] (1)免疫動物
[0061] 一般使用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方法進行三次免疫注射。
[0062] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射0.2ml乳化液（100ul純化的重 組蛋白EGFR(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏完全佐劑，含100ug抗原）。
[0063] 第二次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul純化的 重組蛋白EGFR(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。
[0064]第三次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul純化的重組蛋白EGFR(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。
[0065]測效價根據融合時間安排，第三次免疫7-10天后取血檢測，用常規的western法檢 測效價，選擇效價達到1:1000的小鼠用于融合。
[0066]加強免疫融合前3天，向待取脾小鼠進行加強免疫，小鼠腹腔注射200ul液體（含 60ug抗原，溶劑為1 X PBS，pH7 · 4)。
[0067] (2)細胞融合
[0068] 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，放入帶200目不銹鋼網的平皿 中研磨，制備細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇（50% )。采用HAT選擇培養基，進行雜交瘤細胞的選 擇性培養和篩選。
[0069]用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為8ug/ml加入96孔酶標板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被過夜。棄去包被液，用 PBST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。將雜交瘤細胞培養上清加入酶標板lOOul/well，同時加入PBST(磷酸鹽緩 沖液)作為陰性對照。37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul終止液（2mol/L硫酸）。使用酶標儀測 定，酶標儀設置為:450nm比色。和陰性對照相比，如果是0D值2.5倍之上就是陽性。最后篩選 得到一株效價最好的抗EGFR的雜交瘤細胞株，命名為6H11，亞型鑒定為IgGl。
[0070] 將篩選出的陽性雜交瘤細胞株6H11進行單克隆篩選(有限稀釋法），獲得能產生高 效價(WB稀釋比>1:1000)單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養，并凍存 保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人EGFR雜交瘤細胞系6H11，該細胞系已保存于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 12046。
[0071] (3)單克隆抗體的制備與純化
[0072]將步驟(2)獲得的細胞株6H11接種至BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中純 化抗體(所獲抗體命名為anti-EGFR)。
[0073] 抗EGFR單克隆抗體的純化：使用Protein G親和純化法。將用PB溶液平衡好的 Protein G填料裝入純化柱中，加入經PB溶液稀釋的單克隆抗體anti-EGFR的腹水過柱。上 樣結束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然后用0.1M pH3.0的甘氨酸-鹽酸溶液洗 脫，收集整個洗脫峰的溶液。洗脫液經過透析濃縮并更換為PBS溶液。SDS-PAGE結果顯示，純 化后抗體純度在95 %以上(參見圖1)。
[0074]實施例2:單克隆抗體鑒定及應用
[0075] 1.小鼠抗EGFR單克隆抗體(anti-EGFR)的免疫印跡檢測鑒定
[0076]提取各種腫瘤細胞系的細胞裂解液，總蛋白濃度調整到2mg/ml，上樣至8%的 SDS-PAGE膠孔中，20ug/孔，電泳后將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉后， 用實施例1制備得到的anti-EGFR抗體進行免疫染色：加入實施例1步驟(3)制備并純化的 anti-EGFR，工作濃度為1:1000，37度孵育1小時，然后加入HRP標記的山羊抗鼠抗體，工作濃 度1:20000，于37度反應1小時，每個裂解液均出現170Kd的條帶(參見圖2)，此抗體為抗EGFR 的特異性抗體;抗體稀釋梯度達到1: 1〇〇〇(抗體工作濃度能達到〇. 2-lug/ml)有清晰條帶， 能夠檢測EGFR在A549、C0S7和MDA-MB-468細胞中的表達。
[0077] 2.免疫熒光細胞染色鑒定
[0078] HeLa、MDA-MB-468細胞用PBS洗兩次，4 %多聚甲醛室溫固定30min，PBS沖洗，用 0.5%Triton X-100PBS室溫透化20min。然后加入5%BSA PBS以封閉非特異性反應。加入實 施例1步驟(3)制備并純化的anti-EGFR單克隆抗體1:200，37度孵育30min。沖洗，加入FITC 標記的山羊抗鼠 IgG，室溫避光孵育lhr。去除游離的二抗，PBS沖洗，熒光封片劑封片，熒光 顯微鏡下觀察，用藍色光激發觀察綠色熒光信號。實驗結果（圖3)清楚觀察到細胞膜上呈現 明顯綠色熒光，定位和文獻報道一致。說明此抗EGFR的特異抗體可以用于免疫熒光檢測觀 察EGFR的表達和定位。
[0079] 3.免疫沉淀檢測鑒定
[0080]配制適量新鮮HeLa細胞裂解液，將細胞收集到離心管中用細胞裂解液冰浴裂解 O.S-lhi^nOOOrmp/min 15min 4度，小心取上清(避免細胞殘渣和脂肪膜），將lul anti-EGFR抗體與500ul預冷的細胞裂解物混合，4 °C翻轉過夜。陰性對照抗體采用小鼠正常血清 純化IgG lul。取70-100ul 10 %的ProteinG珠子加入抗原抗體復合物混合，4°C孵育（翻轉 搖床)3-處。40(^ 4°C離心5min去上清，用預冷裂解緩沖液洗3次。最后一次離心后，小心吸 取上清，加入25_35ul 2X Loading buffer煮5-10min，14000g 4°C離心5min，取上清，用于 免疫印跡檢測。
[0081 ]結果顯示（圖4)，anti-EGFR小鼠單克隆抗體能夠有效的將EGFR蛋白從復雜的細胞 裂解液樣品中純化出來。免疫沉淀效果非常好。
[0082] 4.免疫組化檢測
[0083] 非小細胞肺癌組織的石蠟切片經過脫蠟水化后，加入3%H202室溫孵育5~10分鐘， 以消除內源性過氧化物酶的活性。采用高壓抗原修復方法進行抗原修復，溶液使用枸櫞酸 鹽緩沖液(PH6.0)。經5 %正常山羊血清（PBS稀釋）封閉后，加入ant i -EGFR單克隆抗體1: 800，37度孵育30min，PBS沖洗3次，加入HRP標記的山羊抗鼠 IgG，室溫孵育lhr。PBS沖洗5次， 添加顯色劑顯色(DAB)。自來水充分沖洗，復染，封片。實驗結果（圖5)清楚觀察到細胞膜上 呈現明顯染色，定位和文獻報道一致。說明此抗EGFR的特異抗體可以用于免疫組化檢測觀 察EGFR在組織中的表達和定位。
[0084] 參考文獻
[0085] (l)Bazley L.A.,Gullick ff.J.(2005)The Epidermal Growth Factor Receptor Family.Endocer Relat Cancer.12，S17_27
[0086] (2)Castillo L,Etienne-Grimaldi M.C.,Fischel J.L.,Formento P,MagneN, Milano G.(2004)Pharmacological background of EGFR targeting.Ann Oncol.15(7): 1007-12
[0087] (3)Sebastian S, Settleman J,Reshkin S.J. ,Azzariti A，Bellizzi A， Paradiso A. The complexity of targeting EGFR signal ling in cancer: from expression to turnover.Biochim Biophys Acta.1766(1),120-39.
[0088] (4)Franklin ff.A.,Veve R,Hirsch F.R.,Helfrich B.A.,Bunn PA Jr.(2002) Epidermal growth factor recertor family in lung cancer and premalignancy. Semin Oncol.29(Suppl 4):3-14
[0089] (5)Jorissen R.N.,ffalker F,Pouliot N,Garrett T.P.,ffard C.ff.,Burgess A.ff.(2003)Epidermal growth factor receptor:mechanism of activation and signaling.Exp Cell Res.284(1):31-35
[0090] (6)Kani K,ffarren C.M.,Kaddis C.S.,Loo J.A.,Landgraf R.(2004)01igomers of ERBB3have two distinct interfaces that differ in their sensitivity to disruption by geregulin.J Biol Chem 280(9),8238-47
[0091] (7)Ahsan A,Hiniker S.M.,Davis M.A.,Lawrence T.S.,Nyati M.K.(2009)Role of cell cycle in erpdermal growth factor receptor inhibitor-mediated radio sensitization.Cance Res,69(12),5108-5114〇
【主權項】
1. 一種分泌的表皮生長因子受體的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其特征在于，所述雜 交瘤細胞系的保藏號為CGMCC No. 12046。2. -種由權利要求1所述的雜交瘤細胞系分泌的表皮生長因子受體的單克隆抗體，其 特征在于，其能夠特異地結合表皮生長因子。3. 根據權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，其亞型為IgGl。4. 權利要求1所述的雜交瘤細胞及權利要求2所述的單克隆抗體在檢測靶蛋白表皮生 長因子中的應用。5. -種包含權利要求1所述的雜交瘤細胞和/或權利要求2所述的單克隆抗體的試劑 盒。6. 權利要求1所述的雜交瘤細胞及權利要求2所述的單克隆抗體在檢測癌細胞的試劑 盒中的應用，所述癌細胞優選為表皮腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、前 列腺癌、結腸癌。7. 權利要求1所述的雜交瘤細胞及權利要求2所述的單克隆抗體在制備治療EGFR的過 表達疾病藥物中的用途，優選地，EGFR的過表達疾病為表皮腫瘤、頭頸癌、乳腺癌、腎癌、胰 腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、結腸癌。
【文檔編號】C12N5/20GK105907722SQ201610258126
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月22日
【發明人】聶子梅, 邱俊康, 張泰川, 蔣洪嬌
【申請人】成都正能生物技術有限責任公司