乳牙間充質干細胞的制備方法及配合使用的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種乳牙間充質干細胞的制備方法：用生理鹽水和75%酒精對乳牙組織表面進行清洗、消毒，乳牙保存液中保存；乳牙中取牙髓，加入牙髓消化液消化；獲得單細胞懸液；加入細胞培養液，離心清洗，沉淀細胞加入細胞培養液，放入二氧化碳培養箱中培養；原代細胞達70%融合時，加入細胞洗劑液，晃動培養瓶沖洗細胞，吸棄細胞洗劑液，加入細胞消化液消化，加入細胞培養液終止消化，反復吹打瓶底至細胞完全脫落，加入細胞培養液接種到培養瓶中，放入二氧化碳培養箱內培養，為P1代間充質干細胞；P1代融合達70?80%時，胰蛋白酶消化，收集消化細胞，離心，接種；3d后再經胰蛋白酶消化，收集消化細胞，離心，計數，接種，后P3代細胞生長到80%時收獲細胞凍存。
【專利說明】
乳牙間充質干細胞的制備方法及配合使用的試劑盒
技術領域
[0001]本發明涉及干細胞培養領域，尤其涉及乳牙間充質干細胞的制備方法及配合使用的試劑盒。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是成體干細胞的一種，具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點，其在一定條件的誘導下，可分化為成骨、軟骨、脂肪、成肌等多種中胚層來源的細胞。目前，干細胞在臨床上的應用越來越廣泛，主要涉及細胞移植治療、基因治療、生物組織工程以及免疫治療。
[0003]間充質干細胞主要來源于骨髓、臍帶、臍帶血、脂肪、牙周等。因為獲取骨髓和脂肪均會對供體帶來痛苦，甚至可能導致感染、出血和慢性疼痛等;臍帶和臍帶血的獲取時間只能是產婦生產時，錯過時間就難以得到自體間充質干細胞;而乳牙的獲取則容易無痛，且每個人一生中首先長出來的是20顆乳牙，乳牙在半歲左右即開始萌出，約2歲半出齊，6-12歲之間乳牙陸續脫落，因此從乳牙牙髓獲取間充質干細胞將越來越普遍。
[0004]2003年，Miura等從脫落乳牙的牙髓中分離出具有高度增殖能力和多向分化能力的干細胞-SHED。由于其具有良好的間充質干細胞的生物學特性，組織來源易得且無創傷，被認為是干細胞組織工程技術中進行組織再生修復比較理想的種子細胞。
[0005]現代研究發現乳牙間充質干細胞在治療骨和牙組織再生修復、神經系統疾病及肌肉萎縮、免疫系統疾病、皮膚外傷、肝臟疾病等方面有廣闊的應用前景。因此，開發簡單、快速、安全獲得大量乳牙間充質干細胞方法成為當務之急，而目前現有技術中還未有用于制備乳牙間充質干細胞的試劑盒，使得相關科研工作進展緩慢。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種乳牙間充質干細胞的制備方法及配合使用的試劑盒。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:乳牙間充質干細胞的制備方法，制備方法包括以下步驟:
(1)乳牙保存；乳牙取出后，用生理鹽水對乳牙組織表面進行清洗、消毒，用75%酒精浸泡乳牙lmin，浸泡消毒結束后用再用生理鹽水清洗乳牙;處理后的乳牙放入乳牙保存液中保存；
所述乳牙保存液為含0.3?0.6g/L青霉素、0.5?lg/L鏈霉素、0.02?0.04g/L甲硝唑、
0.015?0.025g/L兩性霉素B、5?1g/!羥甲基纖維素、50?10ugAJ夷島素的MEM溶液或DMEM溶液或IPM-1640溶液；
所述乳牙保存液中的胰島素的MEM可以用DMEM或IPM-1640替代；
(2)從乳牙中拔取牙髓，加入牙髓消化液消化l-3h;獲得單細胞懸液；
每Iml所述牙髓消化液包含1-3mg膠原酶、2_4mg DISPASE Π酶、余量為I3BS緩沖液；
(3)牙髓細胞培養，消化結束后加入5ml細胞培養液，400g離心5min，離心清洗2次，沉淀細胞加入1ml細胞培養液接入T75培養瓶中，放入二氧化碳培養箱中培養；
培養至第5天培養瓶內液體離心后全量換液，之后每2天全量換液一次；
所述細胞培養液為含I?10ug/L H)GF、1?10ug/L氫化可的松、I?5ng/L EGF、l?5ng/L b-FGF、50?200ng/L PTH、1 ?10ml/L SITE(sigma)、200?400Mm/L 抗壞血酸、I?20Mm/L地塞米松的IMDM培養基；
(4)牙髓細胞洗滌，原代細胞達70%融合時吸棄培養瓶內液體，加入細胞洗劑液，晃動培養瓶沖洗細胞，吸棄細胞洗劑液，加入細胞消化液，消化時間為2-5min，然后加入細胞培養液終止消化，反復吹打瓶底至細胞完全脫落，移入50ml離心管內，400g離心8min。根據計數結果，按照5.0 X 15個/ml加入細胞培養液接種到T75培養瓶中，放入二氧化碳培養箱內培養，計為Pl代間充質干細胞；
所述細胞洗劑液為PBS、HBSS、D-Hanks或生理鹽水；
所述細胞消化液為含1.25?2.5mg/ml EDTA的生理鹽水、PBS或HBSS溶液；
(5)間充質干細胞的凍存，Pl代間充質干細胞融合達70-80%時，胰蛋白酶消化2-5min，收集消化細胞，400g離心8min，計數后按8000-10000個/cm2的密度接種；3d后P2代細胞達70-80%時再經胰蛋白酶消化，2-5min，收集消化細胞，400g離心8min，計數，按照8000-10000個/cm2密度接種，3d后P3代細胞生長到80%時收獲細胞凍存；
所述細胞凍存液為含10?20% DMSO的乳牙間充質干細胞培養基。凍存獲得的干細胞，使復蘇后的干細胞有極高的存活率。
[0008]優選的，所述步驟(I)中乳牙保存液的配置方法:取保存液一半量的MEM溶液，加入青霉素、鏈霉素、甲硝唑、兩性霉素B、羥甲基纖維素、胰島素，攪拌溶解，加入MEM定容至全量，攪拌均勻，用0.22um濾膜過濾除菌，將制得的溶液無菌分裝即得。
[0009]優選的，制備10ml步驟(2)中所述牙髓消化液的方法:稱取0.1-0.3g膠原酶、0.2-0.4g DISPASE Π酶溶于10mlPBS緩沖液中，攪拌均勻，用0.22um濾膜過濾除菌，即得。
[0010]—種用于乳牙間充質干細胞制備方法配合使用的試劑盒，所述試劑盒內存放有6個試劑瓶，試劑瓶內分別盛裝有上述所述的乳牙保存液、牙髓消化液、細胞培養液、細胞洗劑液、細胞消化液和細胞凍存液。
[0011]本發明優點:本發明的乳牙間充質干細胞的制備方法可在20天內獲得一定量乳牙間充質干細胞(細胞數量可達17數量級)，并且具有使用方便，成本低廉，無血清，減少動物來源的病原體感染風險，更安全等特點，將在干細胞臨床試驗及其相關研究中發揮重要作用，應用前景極為廣泛。
【具體實施方式】
[0012]以下結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0013]用于制備乳牙間充質干細胞的試劑盒的制備:
1、溶液配置:
(I)乳牙保存液配置方法:配制IL離體牙齒保存液，取0.5L的MEM溶液，加入青霉素0.58、鏈霉素0.88、甲硝唑0.038、兩性霉素8 0.02g、羥甲基纖維素8g、胰島素80ug，攪拌溶解，加入MEM至IL定容，攪拌均勻，用0.22um濾膜過濾除菌，將制得的溶液無菌分裝至已滅菌的采集瓶內，每瓶25ml。
[0014](2)乳牙洗劑液配制方法:醫用生理鹽水，75%酒精。
[0015]( 3 )牙髓消化液配制方法:按照每I m I牙髓消化液包含1-3mg膠原酶、2 -4mgDISPASE Π酶、余量為I3BS緩沖液的比例稱取混合，攪拌均勻，用0.22um濾膜過濾除菌，分裝2ml/管。
[0016](4)細胞培養液配制方法:基礎培養基為IMDM，IL培養基中含有I*濃度的SITE(sigma),抗壞血酸200-400mM，SI TE為細胞生長必需的組份，抗壞血酸有助于牙髓干細胞形成細胞外基質，利于牙髓干細胞生長。含有PDGFl-lOug，氫化可的松l-10ug，EGF l_5ng，b-FGF l-5ng，PTH 50_200ng 地塞米松 l_20mM，人血白蛋白 l_10g。
[0017](5)細胞洗劑液配制方法:PBS，配方為 NaCl 8.50g,Na2HPO4.12H20 3.58g、NaIfePCU.2H2O 0.39g，加雙蒸水至1000ml，調整pH至7.2-7.4之間，高壓滅菌即可。
[0018](6)細胞消化液配制方法:0.25%的胰蛋白酶消化液用醫用生理鹽水稀釋至0.05%。
[0019](7)細胞凍存液配制方法:1mlDMSO緩慢加入到上述配好的90ml細胞培養液中。
[0020]2、乳牙間充質干細胞的制備:
用75%酒精消毒拔除的牙齒，置于采集套裝中，24小時內4°C運送到實驗室，于4°C冰箱保存。
[0021]取出乳牙，用生理鹽水清洗牙齒表面，除去血污；用75%酒精浸泡乳牙lmin，浸泡消毒結束后用生理鹽水清洗牙齒。止血鉗固定牙齒，用車針破損或切除牙冠，拔髓針取出牙髓組織。牙髓組織適度剪碎，加入2ml牙髓消化液消化l-3h。
[0022]消化結束后加入5ml細胞培養液，400g離心5min，離心清洗2次，取沉淀細胞。
[0023]沉淀細胞加入1ml細胞培養液接入T75培養瓶中，放入二氧化碳培養箱中培養。培養后第5天培養瓶內液體離心后全量換細胞培養液，之后每2天全量換細胞培養液一次，培養的細胞為原代細胞。
[0024]原代細胞達70%融合時吸棄培養瓶內液體，加入細胞洗滌液，晃動培養瓶沖洗細胞，吸棄細胞洗劑液，加入細胞消化液，消化時間為2-5min，然后加入細胞培養液終止消化，反復吹打瓶底至細胞完全脫落，移入50ml離心管內，400g離心8min。根據計數結果，按照5.0X 15個/ml加入細胞培養液接種到T75培養瓶中，放入二氧化碳培養箱內培養，計為Pl代。
[0025]待3d左右，Pl代細胞融合達70-80%時，胰蛋白酶消化2_5min，收集消化細胞，400g離心8min，計數后按8000-10000個/cm2的密度接種；3d后P2代細胞達70-80%時再經胰蛋白酶消化，2-5min，收集消化細胞，400g離心8min，計數，按照8000-10000個/ cm2密度接種，3d后P3代細胞生長到80%時收獲細胞凍存。
【主權項】
1.乳牙間充質干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)乳牙保存；乳牙取出后，用生理鹽水對乳牙組織表面進行清洗、消毒，用75%酒精浸泡乳牙lmin，浸泡消毒結束后用再用生理鹽水清洗乳牙;處理后的乳牙放入乳牙保存液中保存； 所述乳牙保存液包含0.3?0.6g/L青霉素、0.5?lg/L鏈霉素、0.02?0.04g/L甲硝唑、0.015?0.025g/L兩性霉素B、5?1g/!羥甲基纖維素、50?10ugAJ夷島素的MEM溶液或DMEM溶液或IPM-1640溶液； (2)從乳牙中拔取牙髓，加入牙髓消化液消化l_3h;獲得單細胞懸液； 每Iml所述牙髓消化液包含l-3mg膠原酶、2_4mg DISPASE Π酶、余量為PBS緩沖液； (3)牙髓細胞培養，消化結束后加入5ml細胞培養液，400g離心5min，離心清洗2次，沉淀細胞加入1ml細胞培養液接入T75培養瓶中，放入二氧化碳培養箱中培養； 培養至第5天，將培養瓶內液體離心后全量換細胞培養液，之后每2天全量換細胞培養液一次； 所述細胞培養液為含I?1ug/L PDGF、I?1ug/Ι氫化可的松、I?5ng/L EGF、I?5ng/L b-FGF、50?200ng/L PTH、1 ?10ml/L SITE、200?400Mm/L 抗壞血酸、I?20MmAi也塞米松的IMDM培養液； (4)牙髓細胞洗滌，原代細胞達70%融合時吸棄培養瓶內液體，加入細胞洗滌液，晃動培養瓶沖洗細胞，吸棄細胞洗劑液，加入細胞消化液，消化時間為2-5min，然后加入細胞培養液終止消化，反復吹打瓶底至細胞完全脫落，移入50ml離心管內，400g離心8min;根據計數結果，按照5.0 X 15個/ml加入細胞培養液接種到T75培養瓶中，放入二氧化碳培養箱內培養，計為Pl代間充質干細胞； 其中細胞洗滌液為PBS、HBSS、D-Hanks或生理鹽水； 其中細胞消化液為含1.25?2.5mg/ml EDTA的生理鹽水、PBS或HBSS溶液； (5 )間充質干細胞的凍存，Pl代間充質干細胞融合達70-80%時，胰蛋白酶消化2-5min，收集消化細胞，400g離心8min，計數后按8000-10000個/cm2的密度接種；3d后P2代細胞達70-80%時再經胰蛋白酶消化2-5min，收集消化細胞，400g離心8min，計數，按照8000-10000個/cm2密度接種，3d后P3代細胞生長到80%時收獲細胞凍存； 所述細胞凍存液為含10?20% DMSO的乳牙間充質干細胞培養液。2.根據權利要求1所述的乳牙間充質干細胞的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述乳牙保存液的配置方法:取保存液一半量的MEM溶液，加入青霉素、鏈霉素、甲硝唑、兩性霉素B、羥甲基纖維素、胰島素，攪拌溶解，加入MEM定容至全量，攪拌均勻，用0.22um濾膜過濾除菌，將制得的溶液無菌分裝即得。3.據權利要求1所述的乳牙間充質干細胞的制備方法，其特征在于，制備10ml步驟(2)中所述牙髓消化液的方法:稱取0.1-0.3g膠原酶、0.2-0.4g DISPASEΠ酶溶于10mlPBS緩沖液中，攪拌均勻，用0.22um濾膜過濾除菌，即得。4.用于乳牙間充質干細胞制備方法配合使用的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內存放有6個試劑瓶，試劑瓶內分別盛裝有如權利要求1至3中任一項中所述的乳牙保存液、牙髓消化液、細胞培養液、細胞洗劑液、細胞消化液和細胞凍存液。
【文檔編號】A01N1/02GK105907711SQ201610476143
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月27日
【發明人】晁若瑜, 莊莎莎, 王穎
【申請人】安徽新生命干細胞科技有限公司