一種枯草芽孢桿菌j-5及其生物菌劑和應用
【專利摘要】本發明提供了一種保藏號為CGMCCNo.11750的枯草芽孢桿菌(Busillus subtilis)，以及含有此枯草芽孢桿菌的微生物菌劑，還提供了所述枯草芽孢桿菌或微生物菌劑在防治番茄、黃瓜、草莓等果蔬灰霉病中的應用，本發明提供的保藏號為CGMCCNo.11750的枯草芽孢桿菌及含有該菌的微生物菌劑對灰霉病菌有很強的拮抗作用，且見效快，防效持續時間長。利用本發明篩選出的枯草芽孢桿菌菌株可以制成相應的微生物制劑，將制得的微生物菌劑施用到田間后，通過該枯草芽孢桿菌的作用能夠防治番茄、黃瓜、草莓等蔬菜灰霉病的發生，從而降低果蔬生產過程中化學農藥的施用。CGMCC No. 1175020151127
【專利說明】
一種枯草芽孢桿菌J-5及其生物菌劑和應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌J-5及其生物菌劑和應用。
【背景技術】
[0002] 灰霉菌(Botrytis cinerea)，又稱灰葡萄孢菌，是一類世界性分布的真菌，它是一 種廣寄主性的、能夠引起200多種已知植物(如水果、蔬菜及花卉)灰霉病的壞死營養型病原 真菌。以菌核、分生孢子及菌絲體隨病殘組織在土壤中越冬，通過傷口、自然孔口及幼嫩組 織侵入寄主，發病后又可產生大量分生孢子，借風雨傳播蔓延進行多次再侵染，引起灰霉 病，花、果、葉、莖均可發病，造成作物萎蔫死亡，影響產量和品質，是生產上防治最艱難的重 要病害之一。
[0003] 在黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等上，灰霉病病苗色淺，葉片、葉柄發病呈灰白色，水 漬狀，組織軟化至腐爛，高濕時表面生有灰霉。幼莖多在葉柄基部初生不規則水浸斑，很快 變軟腐爛，縊縮或折倒，最后病苗腐爛枯萎病死。果實染病，青果受害重，殘留的柱頭或花瓣 多先被侵染，后向果實擴展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉層，呈水腐狀，葉片發 病從葉尖開始，沿葉脈間成"V"形向內擴展，灰褐色，邊有深淺相間的紋狀線，病鍵交界分 明。染病地塊輕則減產20%，嚴重的減產50%以上。
[0004] 目前灰霉病已成為黃瓜、番前、前、甜椒、草莓生產上的一種主要病害，對黃瓜、番 茄、茄、甜椒、草莓產量和品質構成了極為嚴重的威脅，該病目前主要通過殺菌劑類化學農 藥進行防治，但是效果不佳且對環境污染較為嚴重，急需尋找低污染、高防效的灰霉病防治 方式。
[0005] 利用拮抗微生物防治農作物病害由于具有低污染、低殘留、不引起病害抗性等優 點，近年來得到廣泛的重視。該防治方式的關鍵是篩選出對病原微生物有拮抗作用且抑菌 譜廣的拮抗微生物，并利用菌劑或者其代謝產物粗提取物形成生物制劑，在黃瓜、番茄、茄、 甜椒、草莓的灰霉病防治上進行應用。目前已有一些用于灰霉病生物防治的生防制劑，但大 多抑菌效果不夠理想，抑菌譜窄，且作用持續時間短。因此，迫切需要篩選出一種能夠高效、 持久拮抗灰霉病病源菌的微生物菌株及相關的微生物菌劑，從而通過生物防治降低灰霉病 給黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生產帶來的危害。
【發明內容】
[0006] 基于以上技術現狀，本發明的目的在于提供一種能夠有效、持久抑制灰霉菌生長， 尤其是能夠高效拮抗黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的枯草芽孢桿菌菌株，并且本發明還 提供了一種含有上述枯草芽孢桿菌菌株的用于防治灰霉菌感染所致的黃瓜、番茄、茄、甜 椒、草莓灰霉病的生物菌劑。
[0007] 為了達到上述發明目的，本發明所采用的技術方案如下： 本發明所述的枯草芽孢桿菌J-5于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為:CGMCC No. 11750。
[0008] 本發明還提供了含有所述枯草芽孢桿菌J-5的生物菌劑，其中枯草芽孢桿菌J-5的 含量為4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g菌劑。
[0009] 所述生物菌劑為枯草芽孢桿菌J-5的芽孢菌劑的混合菌劑。
[0010] 本發明還提供了所述枯草芽孢桿菌J-5及其菌劑在防治黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓 等果蔬灰霉病中的應用。
[0011] 本發明的有益效果為： 本發明的枯草芽孢桿菌J-5可以有效抑制灰霉菌感染所致的黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓 灰霉病，具有高效的防治作用，有效率可以達到60%以上，且見效快，作用持續時間長。作為 生物介入手段，可以避免化學品如農藥引起的殘留和污染，是一種更經濟、環保、綠色的植 物病害防治手段。
[0012] 本發明的枯草芽孢桿菌J-5可以制成多種生物菌劑，或作為有效成分添加到現有 生物菌劑中，當制成芽孢菌劑時，可適應多種保存環境，并具有較長的保質期，在常溫常壓 下，可保存1 -3年，利于倉儲和運輸。
[0013] 生物樣品保藏信息 枯草芽孢桿菌J-5，分類命名為ifeciDus 已于2015年11月27日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路1號 院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號為CGMCC No. 11750。
【附圖說明】
[0014] 圖1為枯草芽孢桿菌J-5在固體LB培養基上培養48小時的菌落形態。
[0015]圖2為枯草芽孢桿菌J-5復紅染色后的光學顯微鏡下的形態。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1對黃瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病具有拮抗作用的細菌的分離、篩選 米集灰霉病害發病嚴重黃瓜、番前、前、甜椒、草莓地塊中的健康植株根際土壤作為試 驗材料，在實驗室內從該樣品中進行細菌分離，在LB培養基上進行多次分離純化，得到純培 養菌落后，以番茄灰霉病菌為指示菌，采用對峙試驗方法進行拮抗性能高的菌株的篩選。
[0017] 具體步驟:上述土壤樣品來自河北省、寧夏、山東、山西等地的染有灰霉病害的黃 瓜、番茄、茄、甜椒、草莓種植田地中，將該土壤經梯度稀釋后涂布于PB培養基中，于28°C恒 溫培養箱培養。上述培養基根據"微生物培養基手冊"的記載制備得到，培養基配方為:牛肉 膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，自來水100〇1111，？!17.2~7.4，121°(：滅菌2〇1^11后使用。 待平板長出菌落后，挑取不同形態的單菌落采用劃線分離法反復進行分離純化，直到得到 單菌落的純培養物，純化后的菌株保存于PB培養基斜面。
[0018] 以番茄灰霉菌為指示菌，采用十字交叉法測定不同菌株對灰霉菌生長的抑制率。 將篩選出的細菌菌株點接在距平板中央3cm處的4個角上，平板中央同時接種直徑5mm的 活化的番茄灰霉病菌塊，每個菌株重復三次，28 °C恒溫培養5d，測量、記錄抑菌圈直徑的大 小并計算平均抑制率。篩選出了對番茄灰霉菌拮抗作用最強的菌株J-5。
[0019] 并對該菌株進行了保藏，保藏號為CGMCC No. 11750。
[0020] 實施例2拮抗菌株遺傳穩定性的確定 將菌株J-5在PB培養基上采用劃線法進行傳代培養，培養20代后，采用平板對峙法測定 傳代后的J-5菌株對番茄灰霉菌的拮抗效果，以原始J-5菌株為對照，該拮抗菌株經過20代 培養后與原始菌株具有相同的拮抗作用，說明該拮抗菌株具有良好的遺傳穩定性，將抑菌 效果穩定的拮抗菌進行PB培養基液體培養，吸取菌液進行-80°C甘油保存。
[0021]實施例3拮抗菌株的鑒定 根據《常見細菌系統鑒定手冊》中記載的實驗內容和實驗方法，對篩得的保藏號為 CGMCC No. 11750的菌株J-5進行鑒定，菌落形態觀測是在1?培養基上進行的，將菌株劃線接 種后，于28°C恒溫培養24小時觀察菌落形態。保藏號為CGMCC No. 11750的菌株的菌落近圓 形，邊緣嚙蝕狀，臍突狀突起，表面皺褶，顏色為乳白色，無光澤不透明，與培養基結合不緊 密。挑取培養24小時菌苔革蘭氏染色后在光學顯微鏡的100倍油鏡下觀察。在顯微鏡下可 以看到，保藏號為CGMCC No. 11750的菌株為芽孢桿菌，革蘭氏陽性菌，芽孢位置中生或近中 生，芽孢膨大，無伴孢晶體，單個出現。初步確定為芽孢桿菌。
[0022] 16SrDNA鑒定：將保藏號為CGMCC No. 11750的菌株接種到1?培養液，28°C搖床培 養24 h，采用天根生化科技（北京）有限公司基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的基因組 0嫩，然后以提取的總0祖作為模板，以上游引物小27(5/^6461'11^^〇^6(：1^6-3 /)和下 游引物R1492 (5。TACGGCTA CCTTGTTA CGAC TT -3 〇引物對進行PCR擴增。PCR反應體系 為25 μL，反應體系為:基因組DNA lyL，10XPCR buffer 2.5yL，F27引物0.5yL，Ri492引物0.5 yL，dNTPs 2yL，Taq 酶（5U/yL) 0.25yL，ddH20 18.25yL。反應條件為：95°C 預變性5 min; 95°C變性30s，50°C退火lmin，72°C延伸2min，循環30次;72°C 10 miruPCR產物用1%瓊脂糖 凝膠進行電泳檢測，將PCR條帶大小約為1500bp的PCR產物送上海生工生物技術有限公司測 序后，將獲得的DNA序列(見序列1)，輸入GenBank，用Blast程序與數據庫中的所有序列進行 比較分析。利用MEGA4.1進行系統發育樹的構建。經過序列分析顯示，保藏號為CGMCC No. 11750的菌株屬于枯草芽孢桿菌。
[0023]實施例4-7枯草芽孢桿菌J-5的番茄種植田間應用 將保藏號為CGMCC No. 11750枯草芽孢桿菌菌株接種到裝有15L 1?液體培養基的30L發 酵罐中，于28°C、180r/min的恒溫條件下培養36小時，離心獲得枯草芽孢桿菌的芽孢，然后 噴霧干燥，用可溶性淀粉混勻該菌的芽孢干粉，形成終濃度為4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制劑。
[0024]在河北省青縣和泊頭市兩地區的番茄連作田對番茄灰霉病進行芽孢桿菌劑的田 間試驗。將芽孢制劑和水1:300的重量比懸溶后分別噴施在番茄定植10天后、開花期和初果 期，每次使用劑量為每畝300g芽孢制劑;常規對照使用常規劑量的化學農藥高巧作為防治 藥物，空白對照不施用防治藥物但施加與實施例組相同重量的水;每個處理3次重復，調查 番前灰霉病的發病情況。
[0025]調查方法： 在成熟期采用對角線五點取樣法，每個點定株20株，共取樣100株調查株發病率與病情 指數，記錄總調查株數、總發病株數。
[0026]番茄灰霉病病情指數分級標準： 0級:全株無害病斑；1級：少數葉片發病至全株下部1/4以下的葉片有病斑;2級:全株 中下部1/2以下的葉片有病斑或者莖桿分枝上有病斑;3級:全株3/4以下部位的葉片有病斑 或者單個分支莖桿枯死和單株有1~2個果實發病腐爛;4級:全株3/4以上的葉片發病枯黃或 者莖桿枯死，單株有2個以上的果實發病腐爛。
[0027]防效計算方法： 番前株發病率=總發病株數/總調查株數X 100 病情指數=Σ (發病株數X該發病株級值)/(總調查株數X最高級值）X 100 防治效果(％)=(對照區病情指數一處理區病情指數)/對照區病情指數X100 防治效果如表1所示，J-5芽孢菌劑對番茄灰霉病具有良好的防效，在施用J-5芽孢菌劑 的情況下番茄灰霉病發病率和病情指數均降低，不同實施例的防病效果均在80%以上。 表1不同菌劑施用對番茄灰霉病的防治效果
[0028]實施例8-11枯草芽孢桿菌J-5的黃瓜種植田間應用 將保藏號為061〇：如.11750枯草芽孢桿菌菌株接種到裝有151^1^液體培養基的3(^發 酵罐中，于28°C、180r/min的恒溫條件下培養36小時，離心獲得枯草芽孢桿菌的芽孢，然后 噴霧干燥，用可溶性淀粉混勻該菌的芽孢干粉，形成終濃度為4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制劑。
[0029]在河北省衡水市和泊頭市兩地區的黃瓜田地對灰霉病進行芽孢桿菌劑的田間試 驗。將芽孢制劑和水1:300的重量比懸溶后分別噴施在黃瓜定植10天后和開花期，每次使用 劑量為每畝300g芽孢制劑;常規對照使用常規劑量的化學農藥高巧作為防治藥物，空白對 照不施用防治藥物但施加與實施例組相同重量的水;每個處理3次重復，調查黃瓜灰霉病的 發病情況。
[0030] 調查方法： 在成熟期采用對角線五點取樣法，每個點定株20株，共取樣100株調查株發病率與病情 指數，記錄總調查株數、總發病株數。
[0031] 黃瓜灰霉病病情指數分級標準： 0級:無病癥； 1級:接種葉出現少量病斑； 2級:病斑面積占葉面積的1/3; 3級:病斑面積占葉面積的1/3-1/2; 4級:病斑面積占葉面積的1/2-2/3; 5級:病斑面積占葉面積的2/3以上 防效計算方法： 黃瓜株發病率=總發病株數/總調查株數X 100 病情指數=Σ (發病株數X該發病株級值)/(總調查株數X最高級值）X 100 防治效果(％)=(對照區病情指數一處理區病情指數)/對照區病情指數X100 利用J-5芽孢菌劑在河北省衡水市和泊頭市兩地區進行黃瓜灰霉病的防治試驗，結果 見表2,使用該芽孢菌劑可降低黃瓜灰霉病發病率、降低病情指數，防病效果在80%以上。
[0032]表2不同菌劑施用對黃瓜灰霉病的防治效果
[0033]實施例12-15枯草芽孢桿菌J-5的草莓種植田間應用 將保藏號為061〇：如.11750枯草芽孢桿菌菌株接種到裝有151^1^液體培養基的3(^發 酵罐中，于28°C、180r/min的恒溫條件下培養36小時，離心獲得枯草芽孢桿菌的芽孢，然后 噴霧干燥，用可溶性淀粉混勻該菌的芽孢干粉，形成終濃度為4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制劑。
[0034]在河北省欒城和邯鄲兩地區的草莓連作大棚對灰霉病進行芽孢桿菌劑的田間試 驗。將芽孢制劑和水1:300的重量比懸溶后噴施在草莓初果和植株葉片上，過七天進行調查 灰霉病情況，使用劑量為每畝1〇〇克芽孢制劑;常規對照使用常規劑量的化學農藥高巧作為 防治藥物，空白對照不施用防治藥物但施加與實施例組相同重量的水;每個處理3次重復， 調查草莓灰霉病的發病情況和產量。
[0035]調查方法： 在成熟期采用對角線五點取樣法，每個點定株20株，共取樣100株調查株發病率與病情 指數，記錄總調查株數、總發病株數。
[0036]草莓灰霉病病情指數分級標準： 〇級:無病癥； 1級:病斑面積占整個果面的5%以下； 3級:病斑面積占整個果面的6%~10%以下； 5級:病斑面積占整個果面的11%~25%以下； 7級:病斑面積占整個果面的26%~50%以下； 9級:病斑面積占整個果面的50%以上。
[0037] 防效計算方法： 番前株發病率=總發病株數/總調查株數X 100 病情指數=Σ (發病株數X該發病株級值)/(總調查株數X最高級值）X 100 防治效果(％)=(對照區病情指數一處理區病情指數)/對照區病情指數X100 防治效果如表3所示，使用該芽孢菌劑可降低草莓灰霉病發病率、降低病情指數，7天防 病效果即可達90%以上。
[0038]表3不同菌劑施用對草莓灰霉病的防治效果
[0039]由上述結果可以看出，本發明篩選出的保藏號為CGMCC No. 11750的菌株對草莓灰 霉病有良好的拮抗作用，其芽孢菌劑能夠有效防治草莓大棚灰霉病的發生。
[0040] 實施例16-19枯草芽孢桿菌J-5的甜椒種植田間應用 將保藏號為061〇：如.11750枯草芽孢桿菌菌株接種到裝有151^1^液體培養基的3(^發 酵罐中，于28°C、180r/min的恒溫條件下培養36小時，離心獲得枯草芽孢桿菌的芽孢，然后 噴霧干燥，用可溶性淀粉混勻該菌的芽孢干粉，形成終濃度為4 X 109cfu/g~7 X 109cfu/g的 芽孢制劑。
[0041] 在河北省欒城和邯鄲兩地區甜椒連作大棚已感染灰霉病的甜椒幼苗(病情指數為 1.25%)進行芽孢桿菌劑的田間試驗。將芽孢制劑和水1:300的重量比懸溶后噴施在甜椒葉 片上，畝用量l〇〇g，間隔期7天噴施第二次，分別在第二次噴施后7天、30天和45天進行調查 灰霉病情況。
[0042]調查方法： 采用對角線五點取樣法，每個點定株20株，共取樣100株調查病情指數。
[0043]甜椒灰霉病病情指數分級標準： 〇級:無病癥； 1級:接種葉出現少量病斑； 2級:病斑面積占葉面積的1/3; 3級:病斑面積占葉面積的1/3-1/2; 4級:病斑面積占葉面積的1/2-2/3; 5級:病斑面積占葉面積的2/3以上 防效計算方法： 病情指數=Σ (發病株數X該發病株級值)/(總調查株數X最高級值）X 100 防治效果(％)=(初始病情指數-調查時病情指數)/初始病情指數X 100 表4不同菌劑施用對甜椒灰霉病的防治效果
[0044」由表4結果顯示，使用該芽孢菌劑可有效防治甜椒灰霉病，施用7天后，不同濃度J-5芽孢菌劑對甜椒灰霉病的防效均在80%以上，與化學農藥的常規對照防治效果相當。與常 規對照相比，J-5芽孢菌劑更為持久，45天后防效均在60%以上。明顯高于對照的28.56%。 [0045]由上述結果可以看出，本發明篩選出的保藏號為CGMCC No. 11750的菌株對甜椒灰 霉病有良好的拮抗作用，其芽孢菌劑能夠有效防治甜椒大棚灰霉病。
[0046]本發明枯草芽孢桿菌對番茄、黃瓜、茄、甜椒和草莓具有相當的防治效果，以上僅 為本發明的較佳實施方式，而非對其保護范圍的限制，本領域技術人員在不需要付出創造 性勞動的前提下對本發明做出的任何改進，均應認為在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種枯草芽孢桿菌J-5,該枯草芽孢桿菌于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為:CGMCC No. 11750。2. 含有權利要求1所述枯草芽孢桿菌J-5的生物菌劑，其特征在于:其中每克菌劑中枯 草芽孢桿菌J-5的含量為4 X 109cfu/g~7 X IO9Cfu。3. 根據權利要求2所述的生物菌劑，其特征在于:所述菌劑為枯草芽孢桿菌J-5的芽孢 菌劑或芽孢與菌體的混合菌劑。4. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌J-5在防治作物灰霉病中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述作物為黃瓜、番茄、茄、甜椒或草莓。6. 權利要求2或3所述的生物菌劑在防治作物灰霉病中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述作物為黃瓜、番茄、茄、甜椒或草莓。
【文檔編號】A01N63/02GK105907680SQ201610359661
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】賈振華, 金偉偉, 黃亞麗, 宋水山, 馬宏, 宋聰, 張立文
【申請人】河北省科學院生物研究所