一株具有低溫降解石油功能的交替假單胞菌及其應用
【專利摘要】本發明公開了一株在海洋環境中具有低溫降解石油功能的交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp.DC?2，其保藏號為CGMCC No.11633。該菌株篩選自我國北方受石油污染的海域，可在低溫條件下高效地降解石油，特別是可在0℃的極端環境下高效地降解石油。本發明的交替假單胞菌DC?2可應用于海洋石油污染的生物修復中，尤其可應用于我國北方海域冬季(包括冰期)等低溫環境下的溢油生物修復工作中。CGMCC No. 1163320151109
【專利說明】
一株具有低溫降解石油功能的交替假單胞菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，涉及一株海洋低溫菌及其在海洋石油污染生物修復 中的應用。所述菌株在海洋環境中具有能在o°c的極端條件下高效降解石油烴的特點，可用 于我國北方海域冰期溢油的生物修復工作。
【背景技術】
[0002] 隨著海洋運輸業的高速發展和海洋開采業的快速崛起，海洋溢油事故日益頻發， 使得海洋環境的平衡遭到了嚴重的破壞。在冬季，特別是冰期，發生海上溢油事故，由于短 鏈石油烴蒸發緩慢，長鏈烴凝為固體，使有機污染物持久存在，會對當地生態系統造成相當 大的危害，而且也加大了溢油應急和生態修復工作的難度。在我國北方地區，尤其北黃海和 渤海海域，一年中有近5個月處于低溫期，冬季海水溫度平均在2°C左右，也會有結冰期。雖 然目前已經發現了一些能在〇°C左右降解石油的海洋低溫降解菌，但菌源主要來自極地環 境。外源菌的大量引入易對生態環境產生威脅，因此在我國低溫海域篩選出高效的低溫降 解石油烴的細菌本地種，進一步商業化，對我國北方海域的石油污染清除將有很高的應用 價值，也會產生出可觀的經濟效益。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于針對上述現有技術的不足提供一株在低溫條件下可降解石油 的海洋石油降解菌。該菌株篩選自我國北方受石油污染的海域，可在〇°C的極端環境下高效 地降解石油。
[0004] 本發明所提供的具有在低溫條件下降解石油性能的交替假單胞菌 (Pseudoalteromonas sp. )DC_2是從大連海域篩選獲得的。該菌株已在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（簡稱:CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中 國科學院微生物研究所，郵編：100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 11633,保藏日期為2015年 11月09日。
[0005] 本發明的Pseudoalteromonas sp.DC-2的特征如下：
[0006] (1)菌落特征:乳白、不透明、隆起、邊緣不規則。
[0007] ( 2 )遺傳學特征：1 6 S r D N A分析，表明其屬于交替假單胞菌屬 (Pseudoalteromonas)。菌株Pseudoalteromonas sp·DC-2的 16S rDNA序列具體可見序列 表。
[0008] (3)石油降解性能特征:經過30天的降解實驗后，柴油降解率可達52%。
[0009] 本發明還提供交替假單胞菌(Pseudoalteromonas sp. )DC_2在低溫條件下降解石 油中的應用，優選地，該菌降解石油中的石油烴。所述低溫條件是指〇°C~15°C，尤其是指0 °(：~4°(：，最好為0°(：。本發明的交替假單胞菌0(：-2可應用于海洋石油污染的生物修復中，尤 其可應用于低溫環境中。
[0010] 本發明的有益效果：
[001 1 ] 本發明的？8611(1〇3]^61'01]101^8 8口.002是一株高效海洋低溫石油降解菌，即使是 在〇°C的條件下還能保持較高的石油烴降解活力。
[0012] 本發明的菌株培養方法簡單，培養基原料易得，菌株對石油烴降解能力強，適用于 我國北方海域溢油(包括冰期溢油）的生物修復工作。
【具體實施方式】
[0013] 下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。另外，下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方 法，所用材料、試劑等均可從生物或化學試劑公司購買。
[0014] 下述實施例采用的培養基及其組成為如下：
[0015] MMC培養基為：NaCl 24g，NH4N03 1.0g，KCl 0.7g，KH2P〇4 2.0g，Na2HP〇43.0g， MgS〇4.7H20 7.0g，微量元素 CaCl2 0.02mg/L，FeCl3.6H20 0.5mg/L，CuS〇4〇.005mg/L， MnCl2.4H2〇 0.005mg/L，ZnS〇4.7H20 0.1mg/L，加去離子水至lL，pH 7.4;
[0016] 2216E液體培養基為：蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高鐵0. lg，加去離子水至lOOOmL， pH值7.4~7.8;
[0017] 2216E瓊脂培養基為:蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高鐵0· lg，瓊脂15g，加去離子水至 100〇1^，？田直7.4~7.8。
[0018] 實施例1菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的分離與鑒定
[0019] 1 ·菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的分離
[0020] (1)樣品采集:大連港大港區客滾碼頭附近的表層海水；
[0021] (2)富集馴化:于250mL三角瓶中加入100mL MMC培養基，120°C下滅菌15min，加入 采集回來的海水樣品5mL和滅菌后的柴油lmL。將混合液置入生化培養箱，于150r/min、10°C 下振蕩培養30d;培養結束后取培養液5mL進行下一輪轉接培養:將5mL培養液加入到已滅菌 的含有lmL柴油的100mL麗C培養液中，于150r/min條件下培養30d。重復上述步驟，每輪的 培養溫度比上一輪低1°C，直至0°C，并在0°C條件下長期馴化；
[0022] (3)分離純化:將經過富集馴化的微生物培養液進行梯度稀釋，并在2216E固體培 養基上進行平板劃線，〇°C培養直至長出清晰菌落。挑選生長良好的菌落，在已滅菌的2216E 固體培養基上分3個區域進行劃線，置入生化培養箱，于0°C下培養。挑取3區具有生長優勢 的單菌落，進行二次劃線分離。如此反復多次劃線，直到分離出菌落單一的菌株，命名為菌 株DC-2。
[0023] 2.菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的鑒定
[0024] (1)菌落特征:乳白、半透明、濕潤、隆起、邊緣不規則。
[0025] (2)遺傳學特征：16S rDNA分析，表明其屬于交替假單胞菌屬 (Pseudoalteromonas)，被分類為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。該菌株已在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No . 11633，保藏日 期為2015年 11 月09日。16S rDNA序列如SEQ ID No.l。
[0026] 實施例2菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的發酵
[0027] 用無菌接種環挑取純化后的菌苔至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養基的三角 瓶錐形中，低溫振蕩培養7(1(0°(：，12(^/1^11)，成為種子液；將種子液按10%體積比加入 2216E液體培養基中，0 °C下培養7天，獲得發酵液。
[0028] 實施例3在0°0條件下菌株?8611(1〇31丨61'01]10仙8 8。.002石油經降解率的測定
[0029] (1)降解菌種子液
[0030]用無菌接種環挑取純化后的菌苔至裝有lOOmL已滅菌的2216E液體培養基的三角 瓶錐形中，低溫振蕩培養7d(0°C，120r/min)。
[0031] (2)降解培養
[0032]將lmL柴油加入裝有1 OOmL已滅菌的MMC液體培養基的三角瓶錐形中，按照10 %的 接種量接種菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2種子液，低溫振蕩培養30d(0°C，120r/min) 〇 以不接種降解菌的培養液作為空白組。
[0033] (3)萃取
[0034]降解培養結束后，在培養液中加入3mL 50%的硫酸溶液進行酸化。將酸化后的培 養液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振蕩后靜置。液體明顯分層后把下層液體轉至三角瓶中，上層液離心后通過鋪滿無水硫 酸鈉的砂芯漏斗過濾除水后收集，進行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上層液。
[0035] (4)柴油標準曲線繪制
[0036] 稱取O.lg油樣品溶于正己烷中，移至100ml的容量瓶中，定容得到濃度為l.OOmg/ ml的油標準儲備溶液。移取5ml油標準儲備溶液于50ml容量瓶中，用正己烷定容，得到濃度 為0. lmg/ml油標準使用液。分別移取一定量的0. lmg/ml油標準使用液于25ml容量瓶中，用 正己烷定容，得到一系列已知濃度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm處測其吸光度。 以油濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。
[0037] (5)測量
[0038]采用紫外分光光度計吸光度測量。在227nm的波長下，以正己烷的吸光度為參比， 用10mm石英比色皿測萃取液吸光度。若吸光值超過標準曲線范圍，則對萃取液按照1/10的 比例逐級稀釋。根據標準曲線，算出其相應的濃度。
[0039] (6)結果
[0040] 降解率的計算:降解率D =( Co-&) /Co X 100 %
[0041 ]式中Co:空白瓶(不加菌）中柴油的濃度;&:實驗瓶(加菌）中柴油的濃度。
[0042] 計算結果為降解率為52%，說明在0°C條件下本發明的菌株對柴油中石油烴具有 尚效的降解能力。
[0043] 實施例4在15°(^條件下菌株?8611(1〇&1丨61'〇1]1〇仙8 8口.002石油經降解率的測定
[0044] (1)降解菌種子液
[0045]用無菌接種環挑取純化后的菌苔至裝有100mL已滅菌的2216E液體培養基的三角 瓶錐形中，低溫振蕩培養5d( 15°C，120r/min)。
[0046] (2)降解培養
[0047]將lmL柴油加入裝有100mL已滅菌的麗C液體培養基的三角瓶錐形中，按照10%的 接種量接種菌株？8611(1〇31丨61'01]101^3 3卩.002種子液，低溫振蕩培養30(1(15<€，12〇1'/111；[11)0 以不接種降解菌的培養液作為空白組。
[0048] (3)萃取
[0049]降解培養結束后，在培養液中加入3mL 50%的硫酸溶液進行酸化。將酸化后的培 養液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充 分振蕩后靜置。液體明顯分層后把下層液體轉至三角瓶中，上層液離心后通過鋪滿無水硫 酸鈉的砂芯漏斗過濾除水后收集，進行下一步分析。萃取2~3次，然后合并上層液。
[0050] (4)柴油標準曲線繪制
[00511 稱取0 . 1 g柴油樣品溶于正己烷中，移至1 00ml的容量瓶中，定容得到濃度為 1.00mg/ml的油標準儲備溶液。移取5ml油標準儲備溶液于50ml容量瓶中，用正己烷定容，得 到濃度為0. lmg/ml油標準使用液。分別移取一定量的0. lmg/ml油標準使用液于25ml容量瓶 中，用正己烷定容，得到一系列已知濃度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm處測其吸 光度。以油濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。
[0052] (5)測量
[0053]采用紫外分光光度計吸光度測量。在227nm的波長下，以正己烷的吸光度為參比， 用10mm石英比色皿測萃取液吸光度。若吸光值超過標準曲線范圍，則對萃取液按照1/10的 比例逐級稀釋。根據標準曲線，算出其相應的濃度。
[0054] (6)結果
[0055] 降解率的計算:降解率D =( Co-&) /Co X 100 %
[0056] 式中Co:空白瓶(不加菌）中柴油的濃度;&:實驗瓶(加菌）中柴油的濃度。
[0057] 計算結果為降解率為61 %，說明在15°C條件下本發明的菌株對柴油具有高效的降 解能力。
【主權項】
1. 一株在海洋環境中具有低溫降解石油功能的交替假單胞菌Pseudoalteromonas sp .DC-2,其保藏號為CGMCC No .11633。2. 如權利要求1所述的交替假單胞菌DC-2在低溫條件下降解石油中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述交替假單胞菌DC-2降解石油中的石油 烴。4. 根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于，所述低溫條件為(TC~15 °C。5. 根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于，所述石油降解的環境為海洋環境。6. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述低溫條件為(TC。
【文檔編號】C12R1/38GK105907676SQ201610290966
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】郭平, 林建國, 曹賓霞
【申請人】大連海事大學