枯草芽胞桿菌及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)及其應用，其中枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2014年10月29日，保藏編號為CGMCC NO.9870。本發明的枯草芽胞桿菌菌株，具有較廣的抑菌譜，本發明利用發酵生產的菌劑既能防病，又能保護環境，減少化學農藥的殘留，在可持續農業發展中應用前景廣闊。CGMCC NO.987020141029
【專利說明】
枯草芽胞桿菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物領域，尤其涉及一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)及其 應用。
【背景技術】
[0002] 葡萄是我國重要的果樹樹種，我國葡萄種植面積和產量均位居世界前列。但種植 現狀卻不容樂觀，特別是病蟲害種類多、危害嚴重，農藥使用次數多、使用量大。葡萄霜霉病 是鮮食和釀酒葡萄上最為嚴重的世界性病害。引起葡萄霜霉病的病原菌是Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.)Berl et de Toni,屬鞭毛菌門、霜霉目、單軸霉屬真菌，是專性 寄生菌。該病原菌主要侵染葡萄葉片，也可侵染花序和幼果。
[0003] 化學農藥防治仍然是目前防治葡萄霜霉病的主要方法，被果農廣泛接受，但施藥 次數過多帶來了許多嚴重問題。化學防治不僅增加了生產成本，而且造成環境污染和果實 殘毒，降低了葡萄及其加工產品的品質，也降低了葡萄和葡萄酒質量;隨著殺菌劑大量和頻 繁使用，病菌的抗藥性問題在世界各地接連出現;農藥在抑制病原菌的同時，也使微生物活 動受阻，有益生物量減少。
[0004] 隨著人們對食品安全和環境保護意識的增強，對農藥殘留、病菌抗藥性等問題認 識逐漸深入，對尋找和開發安全高效的殺菌劑要求日益迫切。所以生物防治因其對環境和 動物有較好的安全性而逐漸成為人們所關注的焦點和熱點，尤其是芽胞桿菌在植物病害防 治中的應用倍受人們的青睞。
[0005] 植物內生菌是指，那些生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織 和器官內部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暫時的）不表現出外在病癥，可通過組織 學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法 來證明其內生，包括一切生活在植物體內的腐生、寄生和共生真菌、細菌、防線菌等一類微 生物。葡萄內生細菌的研究從20世紀90年代開始陸續有報道，已有研究結果顯示，葡萄內生 細菌表現出豐富的多樣性，具有防病、促生、對環境脅迫抗性等生物學作用。
[0006] 芽胞桿菌生理特征豐富多樣，分布極其廣泛，極易分離培養，是土壤和植物體、根 際的重要微生物種群。具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用；芽胞桿菌突出的特征是能產 生耐熱、抗逆的芽胞，這有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖。批 量生產上工藝簡單，成本也較低，施用方便，儲存期長，是一種較理想的生防微生物。芽胞桿 菌在抑制病原菌的過程中有多種機制參與其中，主要包括抗生作用，競爭作用，誘導抗性及 微生態調控等機制。近年來，已有不少文章陸續報道了芽胞桿菌對多種葡萄病原真菌具有 拮抗作用，如利用芽胞桿菌防治葡萄灰霉病、白粉病、枝干病害等。篩選有效防治葡萄霜霉 病的芽胞桿菌并探究其生防機制為葡萄霜霉病生物防治提供有效的菌株和重要指導意義， 為葡萄及葡萄酒的安全生產奠定了一定的基礎。
【發明內容】
[0007] 本發明旨在解決上面描述的問題。本發明的目的是提供一種枯草芽胞桿菌 GLB191，該枯草芽胞桿菌存在于葡萄葉片中，其無菌代謝液發揮主要生防作用，屬于葡萄內 生細菌。
[0008] 根據本發明的一個方面，提供了一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191， 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰 西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏日期為2014年10月29日，保藏 編號為CGMCC N0.9870。
[0009] 其中，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191為葡萄內生細菌。
[0010]其中，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191可分離于葡萄植株的健康葉片 中。
[0011]其中，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191是包括葡萄座腔菌、葡萄枝枯病 菌、葡萄蔓枯病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌、蘋果黑腐皮殼菌、粉紅單端孢、鏈格 孢果生鏈核盤菌、葡萄孢菌、草莓灰霉病菌、膠孢炭疽菌、致病疫霉、尖孢鐮刀菌、小麥全蝕 病菌、小麥紋枯病菌、茄鏈格孢菌、棉花黃萎病菌在內的致病菌的拮抗菌。
[0012] 其中，枯草芽胞桿菌GLB191的16S rRNA基因序列為：
[0013]
[0014]
[0015]其中，gyrA基因序列為：
[0016]
[0017] 根據本發明的另一個方面，提供了一種菌劑，其包含如權利要求1~4的任意一項 的枯草芽胞桿菌GLB191。
[0018] 其中，菌劑包括枯草芽胞桿菌GLB191的發酵液、無菌代謝液中的一種或兩種。
[0019] 根據本發明的第三個方面，提供一種如權利要求1~4的任一項枯草芽胞桿菌 GLB191或如權利要求5的菌劑在防治葡萄病害、梨病害、辣椒病害、馬鈴薯病害、草莓病害和 棉花病害中的用途。
[0020] 其中，葡萄病害包括葡萄霜霉病。
[0021] 本發明具有以下有益效果：
[0022] (1)與現有的枯草芽胞桿菌相比，本發明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，具有較 廣的抑菌譜，對葡萄、梨、辣椒、馬鈴薯、草莓和棉花等多種作物的致病菌均具有較強的拮抗 活性。
[0023] (2)本發明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，特別對葡萄的霜霉病具有良好的生 防作用，其對葡萄霜霉病的實驗室生防效果可以達到69.0%，田間防效可達82.2%。
[0024] (3)本發明提供的菌劑，屬于生物防治菌劑，能夠減少化學農藥的施用，避免環境 污染，促進可持續農業的發展。
【附圖說明】
[0025]并入到說明書中并且構成說明書的一部分的附圖示出了本發明的實施例，并且與 描述一起用于解釋本發明的原理。在這些附圖中，類似的附圖標記用于表示類似的要素。下 面描述中的附圖是本發明的一些實施例，而不是全部實施例。對于本領域普通技術人員來 講，在不付出創造性勞動的前提下，可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1是枯草芽胞桿菌GLB191菌株在LB培養基平板上的培養形態；
[0027] 圖2是枯草芽胞桿菌GLB191與相關菌株的16S rRNA系統發育樹；
[0028] 圖3是枯草芽胞桿菌GLB191與相關菌株的gyrA系統發育樹；
[0029]圖4是霜霉病侵染的葡萄植物的離體葉片；
[0030]圖5是枯草芽胞桿菌GLB191菌株對葡萄霜霉病菌的離體葉片篩選圖片；
[0031] 圖6是實驗點1的枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的田間防治效果圖；
[0032] 圖7是實驗點2的枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的田間防治效果圖；
[0033]圖8是枯草芽胞桿菌GLB191的發酵液、菌懸液和無菌代謝液對葡萄霜霉病的防治 效果對比圖。
[0034]圖9是枯草芽胞桿菌GLB191的發酵液的作用下，葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌 發圖片；
[0035]圖10是枯草芽胞桿菌GLB191的無菌代謝液的作用下，葡萄霜霉病的致病菌的孢子 囊萌發圖片；
[0036] 圖11是正常萌發的葡萄霜霉病的致病菌的孢子囊萌發圖片。
【具體實施方式】
[0037] 為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例 附圖，對本發明的技術方案的實施例進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發 明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒 有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。需要說明 的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。
[0038] 實施例1:枯草芽胞桿菌GLB191的分離及篩選方法
[0039] (1)樣品米集：
[0040] 樣品采集自全國13個葡萄主產區的主栽葡萄品種葉片，用低溫箱保存帶回實驗 室，24小時內完成內生細菌的分離。樣品采集地點及時間見表1。
[0041]表1樣品米集地點及時間
[0042]
[0044] (2)枯草芽胞桿菌菌株GLB191的獲得：
[0045]表面消毒：取新鮮的葡萄葉片，用無菌水沖洗干凈，分別用70%乙醇（20s)、2%次 氯酸鈉溶液(3min)、70%乙醇（20s)處理，再用無菌水沖洗4次，取100μΙ第4次漂洗水涂布 TSA平板，設3個重復，28 °C恒溫培養箱中培養4-5天，無菌落形成說明表面消毒徹底。
[0046]分離方法:稱取表面消毒的葡萄葉片大約2.0g放入已滅菌的研缽中，加8mL無菌水 和少量滅菌的石英砂充分研磨，靜置lmin，吸200uL懸浮液涂布TSA平板，設3個重復，28°C 恒溫培養箱中培養，待培養基里長出的菌落數平穩后，將菌落形態差異的菌株進行轉管純 化并保存于4°C。
[0047] TSA培養基:每升培養基中含15g Tryptone(胰蛋白胨），5g大豆蛋白胨，5g NaCl， 15-18g瓊脂;pH 7 · 2-7 · 4; 121°C滅菌20min后備用。
[0048] LB液體培養基:每升培養基中含10g NaCl、10gTrypt〇ne(胰蛋白胨）和5g Yeast Extract(酵母膏）；pH 7.2_7.4;121°C滅菌20min后備用。
[0049] LB固體培養基:每升LB液體培養基中加入15g瓊脂粉;121°C滅菌20min后備用。
[0050] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基）：馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂20g，用蒸餾 水定容至l〇〇〇mL; 121°C滅菌20min后備用。
[0051 ]芽胞桿菌GLB191菌株在LB培養基平板上的培養形態見圖1。
[0052] (3)菌株GLB191的鑒定
[0053] 通過對菌株GLB191 16SrRNA和gyrA基因序列的分析，如圖2和圖3所示，鑒定菌株 GLB191為枯草芽胞桿菌，并在GenBank(美國國家生物技術信息中心的DNA序列數據庫)上獲 取登錄號分別為KR233009、KR233007。
[0054]實施例2:枯草芽胞桿菌GLB191的拮抗譜測定
[0055] 在PDA培養基上相距3cm處分別接入制備好的病原菌餅作對峙培養，以單獨接種各 供試菌的菌餅為對照，置于培養箱25°C黑暗培養，每處理設3次重復。3d后測量菌落直徑，計 算供試菌株對病原菌生長的抑制率。結果顯示枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄、梨、辣椒、馬鈴 薯、草莓和棉花等多種作物致病菌具有較強的拮抗活性。枯草芽胞桿菌GLB191菌株的抑菌 譜見表2。
[0056] 表2枯草芽胞桿菌GLB191抑菌譜
[0057]
[0058]
[0059] 其中，+，++和+++分別代表在PDA培養基中的抑菌效果的三個檔次，即31~50%，51 ~70%和多71 %，注:表中的實驗數據均為三次重復的平均值。
[0060] 實施例3:枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的實驗室防治實驗
[0061] 從田間采回新鮮的葡萄霜霉病病葉，帶回實驗室過夜保濕培養，用毛筆將新鮮的 孢子囊刷洗配制成1X104個/mL的懸浮液待用。枯草芽胞桿菌GLB191接種LB液體培養基， 180rpm搖陪至95 %以上菌體產孢。取新鮮的葡萄葉片，打成1.5cm直徑的葉盤，用芽胞桿菌 菌懸液10倍稀釋液浸泡處理30min，取出后在超凈工作臺晾干。在滅菌的空磁盤內鋪4層用 無菌水潤濕的紗布，將晾干的葉盤放置于磁盤中，每盤放30個葉盤，保鮮膜封口保濕，以無 菌水浸泡的葉盤為對照，每個處理設3個重復，20°C放置1天后噴施病原菌，20°C，98 %相對 濕度培養，從對照發病開始調查，記錄各級病葉數及調查總葉數，結果見表4。
[0062] 葡萄霜霉病調查分級標準見表3(GB/T 17980.122-2004)。
[0063] 表2葡萄霜霉病分級調查標準
[0064]
[0066] 生防效果計算公式：
[0067] 發病率（％ )=發病葉盤數/調查總葉盤數X 100
[0068] 病情指數=Σ (各級發病葉盤數X相對級數值)/(調查總葉盤數X 9) X 100
[0069]防治效果（％ )=(對照區病情指數一處理區病情指數)/對照區病情指數X 100。
[0070]表4枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病離體葉片防效測定
[0071] L〇〇72」注：數據為三次里復的平均值
[0073]枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的作用見圖4和圖5的對比。
[0074]實施例4:枯草芽胞桿菌GLB191田間防治試驗
[0075] 試驗中所用到的生防菌劑芽胞桿菌GLB191在中農綠康(北京)生物技術有限公司 發酵生產。
[0076] 試驗點1:天津市武清區天津農科院林果所，品種為鮮食葡萄玫瑰香，該果園葡萄 霜霉病相對比較嚴重，選樹齡在3年左右產量穩定的果樹，每個處理約30棵果樹。
[0077] 試驗點2:河北省懷來縣中法莊園。品種為釀酒葡萄赤霞珠，該果園葡萄霜霉病每 年都發生，選樹齡在8年左右產量穩定的果樹，每個處理約50棵果樹。
[0078]處理:每個處理選樹勢大小一致的果樹，設4個重復小區。在葡萄展葉后開始噴灑， 葉片正反面噴霧處理，滴水為度，生防菌劑芽胞桿菌GLB191芽胞量為1 X 108CFU/mL，生長季 共噴施處理8次，間隔10天。
[0079] 從對照發病開始調查，每隔7-8天調查一次，每個小區調查中間連續的3株樹，每 株在上、中、下三個部位各選擇1個枝條，調查全部葉片，記錄各級病葉數及調查總葉數，葡 萄霜霉病調查分級標準見表5(GB/T 17980.122-2004)，其中，試驗點1的防治效果見圖6和 表6，試驗點2的防治效果見圖7和表6。
[0080] 表5葡萄霜霉病分級調查標準
[0081]
[0082]生防效果計算公式：
[0083]病情指數=Σ (各級發病葉片數X相對級數值)/(調查總葉片數X 9) X 100
[0084] 防治效果（％ )=(對照區病情指數一處理區病情指數)/對照區病情指數X 100
[0085] 表6枯草芽胞桿菌GLB191對葡萄霜霉病的田間防效
[0086]
[0087] 其中，需要說明的是，試驗點1處理18d和試驗點2處理19d的防效較低，是因為當時 處于園間修剪期，對照組病枝被修剪，病情指數降低，防效降低，屬特殊因素，不計為正常實 驗結果數據。
[0088] 實施例5:枯草芽胞桿菌GLB191抑菌效果對比實驗
[0089]制備枯草芽胞桿菌GLB191的無菌代謝液:將枯草芽胞桿菌GLB191接種LB液體培養 基，180rpm搖陪發酵至95 %以上菌體產孢，離心培養液，收集菌體和上清液，上清液過濾滅 菌獲得無菌代謝液。
[0090]制備枯草芽胞桿菌GLB191的菌懸液:將上一過程的得到的菌體用無菌水重懸獲得 菌懸液。
[0091 ]取新鮮的葡萄葉片，打成1.5cm直徑的葉盤，分別用發酵液、無菌代謝液、菌懸液的 10倍稀釋液浸泡處理30min，取出后在超凈工作臺晾干。在滅菌的空磁盤內鋪4層用無菌水 潤濕的紗布，將晾干的葉盤放置于磁盤中，每盤放30個葉盤，保鮮膜封口保濕，以無菌水浸 泡的葉盤為對照，每個處理設3個重復，20°C放置1天后噴施病原菌孢子囊懸浮液，濃度IX 104個/mL，20°C，98%相對濕度培養，從對照發病開始調查，記錄各級病葉數，計算病情指 數，三種菌液對葡萄霜霉病的防治對比如圖8所示。
[0092] 由圖8可以看出，在實驗進行的第4~6天，發酵液和無菌代謝液均對葡萄霜霉病產 生了明顯的防治效果，而菌懸液則對葡萄霜霉病完全沒有防治效用。
[0093] 并且，根據掃描電鏡進一步的觀察發現，GLB191發酵液和無菌代謝液可以抑制孢 子囊萌發，具體分別如圖9和圖10所示，圖11為正常的孢子囊萌發的電鏡圖片，根據以上三 幅電鏡圖片和上述實驗結果的對比，大致可以推斷，枯草芽胞桿菌GLB191防治葡萄霜霉病 的原理，應該與GLB191分泌的某些胞外物質能夠抑制病原菌Plasmopara viticola的孢子 囊萌發有關。
[0094]綜上所述，本發明具有以下有益效果：
[0095] (1)與現有的枯草芽胞桿菌相比，本發明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，具有較 廣的抑菌譜，對葡萄、梨、辣椒、馬鈴薯、草莓和棉花等多種作物的致病菌均具有較強的拮抗 活性。
[0096] (2)本發明提供的枯草芽胞桿菌菌株GLB191，特別對葡萄的霜霉病具有良好的生 防作用，其對葡萄霜霉病的實驗室生防效果可以達到69.0%，田間防效可達82.2%。
[0097] (3)本發明提供的菌劑，屬于生物防治菌劑，能夠減少化學農藥的施用，避免環境 污染，促進可持續農業的發展。
[0098]最后應說明的是:在本文中，術語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋 非排他性的包含，從而使得包含一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要 素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備 所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句"包括一個…"限定的要素，并不排除在包 括所述要素的過程、方法、物品或者設備中還存在另外的相同要素。
[0099]以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制。盡管參照前述實施例 對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施 例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換;而這些修改或者 替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191，保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2014年10月29日，保藏編號為CGMCC NO.9870。2. 如權利要求1所述的枯草芽胞桿菌GLB191，其特征在于， 所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191為葡萄內生細菌。3. 如權利要求1所述的枯草芽胞桿菌GLB191，其特征在于， 所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191可分離于葡萄植株的健康葉片中。4. 如權利要求1所述的枯草芽胞桿菌GLB191，其特征在于， 所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191是包括葡萄座腔菌、葡萄枝枯病菌、葡 萄蔓枯病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌、蘋果黑腐皮殼菌、粉紅單端孢、鏈格孢果生 鏈核盤菌、葡萄孢菌、草莓灰霉病菌、膠孢炭疽菌、致病疫霉、尖孢鐮刀菌、小麥全蝕病菌、小 麥紋枯病菌、茄鏈格孢菌、棉花黃萎病菌在內的致病菌的拮抗菌。5. -種菌劑，其包含如權利要求1~4的任意一項所述的枯草芽胞桿菌（Baci Ilus subtilis)GLB191。6. 如權利要求5所述的菌劑，其特征在于， 所述菌劑包括所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191的發酵液、無菌代謝液 中的一種或兩種。7. 如權利要求1~4任一所述的枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)GLB191或如權利要 求5所述的菌劑在防治葡萄病害、梨病害、辣椒病害、馬鈴薯病害、草莓病害和棉花病害中的 用途。8. 如權利要求7所述的用途，其特征在于， 所述葡萄病害包括葡萄霜霉病。
【文檔編號】A01N63/02GK105907662SQ201610218211
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月8日
【發明人】王 琦, 張珣, 周瑩瑩, 李燕
【申請人】中國農業大學