一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法
【專利摘要】本發明提供一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法，包括以下步驟：取枯草芽胞桿菌菌落接入搖瓶培養；配制種子發酵培養基，其中種子發酵培養基的初始的pH值為6.5～7.7；將搖瓶種子液接入種子發酵培養基中發酵，培養8～13小時，得到種子罐菌液；配制液體發酵培養基，其中液體發酵培養基的初始的pH值為6.5～7.7；將種子罐菌液無菌轉入液體發酵培養基中，培養22～31小時，放罐，得到枯草芽胞桿菌高密度發酵液。本發明的目的是提供一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法，該方法生產的枯草芽胞桿菌活菌數多、芽孢形成率高、簡便經濟，適用于枯草芽胞桿菌的工業化規模發酵。
【專利說明】
一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法
技術領域
[0001]本發明涉及微生物發酵工程領域，特別涉及一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法。
【背景技術】
[0002]枯草芽胞桿菌是一類廣泛存在的可產生芽孢的革蘭氏陽性細菌，生長迅速，代謝旺盛，可產生脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等多種代謝產物，對人畜無害，不污染環境，在飼料、畜牧行業應用廣泛。有些枯草芽胞桿菌還具有纖維素和半纖維素水解活性，可有效降解農作物秸桿和畜禽糞便，是有機物料腐熟劑的重要菌種來源。隨著現代生活質量的提高和人們環保意識的增強，對綠色健康食品的需求越來越大，由于化學農藥和化學肥料大量使用所帶來的農藥殘留、環境污染等問題，使得生物防治在植物病害防控中的作用越來越突出。枯草芽胞桿菌可產生多種高效廣譜抗生素，是植物病害防治中使用最廣泛的微生物種群之一，與其他芽胞桿菌一起占據著全世界商業化應用的生物農藥市場的二分之一。
[0003]芽孢具有極強抗逆性、可抵抗高溫、干旱、紫外線和有機溶劑等多種不良環境，使之在后續加工機械化生產及高溫干燥的過程中，可以保證微生物制劑的活性，提高產品質量和貯存期。由于芽孢不是細菌生活史中不可缺少的部分，只是產芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆性休眠體，因此芽孢形成受很多因素影響，培養基所含碳源、氮源、無機鹽的種類和配比，發酵參數如pH、溫度、溶氧、發酵時間等都對芽孢形成具有重要作用，根據不同菌株，需要通過實驗尋求最佳的適宜于芽孢形成的培養基配方并制定合理有效的發酵生產工藝。
[0004]發酵液所含的有效活菌數是微生物制劑的重要生產指標，一方面關系到生產成本，另一方面也與制劑發揮功效直接相關。微生物制劑商業應用的關鍵在于目標微生物的高效生產，目前關于枯草芽胞桿菌發酵，大多是在實驗室搖瓶條件下進行，大規模工業化發酵生產研究較少，且存在有效菌數少或芽孢形成率低、發酵周期長、生產成本高等問題。
【發明內容】
[0005]本發明旨在解決上面描述的問題。本發明的目的是提供一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法，該方法生產的枯草芽胞桿菌活菌數多、芽孢形成率高、簡便經濟，適用于枯草芽胞桿菌的工業化規模發酵。
[0006]具體包括以下步驟:
[0007](I)取枯草芽胞桿菌菌落接入搖瓶培養，制成搖瓶種子液。
[0008](2)在種子發酵罐中配制種子發酵培養基，其中種子發酵培養基的初始的pH值為6.5?7.7。
[0009](3)將搖瓶種子液接入種子發酵培養基中發酵，其中，接種體積百分比為0.3?0.6%,發酵溫度為30?35°C，種子發酵罐轉速為180?200轉/分，通氣量為1: 0.3?1: 0.6，罐壓為0.02?0.081^?，培養8?13小時，得到種子罐菌液。
[0010](4)在液體發酵罐中配制液體發酵培養基，其中液體發酵培養基的初始的pH值為6.5?7.7。
[0011](5)將種子罐菌液無菌轉入液體發酵培養基中，其中，接種體積百分比為8?12%，發酵溫度為30?35°C，液體發酵罐轉速為150?175轉/分，通氣量為1:0.3?1:1.8，罐壓為0.02?0.08Mpa，培養22?31小時，放罐，得到枯草芽胞桿菌高密度發酵液。
[0012]其中，步驟(3)包括:
[0013]接種體積百分比為0.5%，發酵溫度為32°C，種子發酵罐轉速為200轉/分，通氣量為1:0.5，罐壓為0.03?0.06Mpa，培養9?12小時。
[0014]步驟(5)包括:
[0015]接種體積百分比為10%，發酵溫度為32?35°C，液體發酵罐轉速為170轉/分，通氣量為1: 0.5?1:1.5，罐壓為0.03?0.06Mpa，培養25?30小時。
[0016]其中，種子發酵培養基和液體發酵培養基的初始pH值均為6.8?7.5。
[0017]其中，種子發酵培養基和液體發酵培養基均包括以下組分和組分含量:葡萄糖0.8?1.0%，玉米粉0.8?1.2%，酵母粉0.3?0.5%，豆柏粉1.8?2.5% ,CaCO30.2?0.5 %，K2HPO40.I?0.3 % ,MgSO40.04?0.06 % ,MnSO40.02?0.03 %，泡敵0.05?0.I %，其余為水。
[0018]其中，葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆柏粉、CaC03、K2HP04、MgS04、MnS04的含量為質量百分含量，泡敵為體積百分含量。
[0019]其中，種子發酵罐為500L種子發酵罐，種子發酵培養基為300L，液體發酵罐為5000L液體發酵罐，液體發酵培養基為3000L。
[0020]其中，步驟(2)包括:
[0021]對種子發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的種子發酵培養基的初始PH值為6.5?7.7。
[0022]步驟(4)包括:
[0023]對液體發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的液體發酵培養基的初始PH值為6.5?7.7。
[0024]其中，步驟(I)包括:
[0025]用滅菌接種鏟鏟取枯草芽胞桿菌菌落，接入搖瓶中的NA液體培養基，34°C，180轉/分，震蕩培養10?14小時，生長至0D6QQ0.8?1.2，形成枯草芽胞桿菌搖瓶種子液。
[0026]NA液體培養基的pH值為7.0?7.2，NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水1L。
[0027]其中，步驟(I)之前還包括步驟:(11)將保存的枯草芽胞桿菌菌種進行活化。
[0028]其中，步驟(11)包括:從保存枯草芽胞桿菌菌種的斜面蘸取少許菌落劃線于NA固體平板，置于32°C培養箱培養30?48小時，至枯草芽胞桿菌長出形成菌落。
[0029]其中，NA固體平板的培養基的pH值為7.0?7.2，NA固體平板的培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，瓊脂粉20g，水1L。
[0030]接種比例、發酵pH值、發酵溫度、轉速、通氣量、罐壓以及培養時間都均與最終放罐后發酵液的含菌量相關。
[0031]其中，發酵溫度、培養時間、接種比例和發酵pH值，均是影響菌株生長的條件參數，他們的數值適宜，是提高含菌量的重要條件;而轉速和通氣量則通過溶氧量，間接影響菌株的發酵環境，通氣量和轉速過高，泡沫增多，容易產生逃液和物質揮發，導致發酵液減少，通氣量和轉速過低，則溶氧量不夠，因此，轉速和通氣量的取值是否合適，也影響最終發酵液的含菌量。
[0032]另外，對于有氧發酵，發酵過程中需要通過濾后的空氣，一般發酵罐維持一定的液位，液位上部空余部分保持一定的壓力，這個壓力即為罐壓。罐壓的目的包括:1.維持罐內正壓，避免外界空氣進入污染;2.—定的罐壓可以增加溶氧量，有效的溶氧可以提升好氧菌發酵的效率。但是罐壓增加，也相應提高ω2分壓，對有些微生物的正常生長可能產生不利影響，并且浪費空氣壓縮動力，因此罐壓也不能過大。罐壓一般控制在0.04?0.06MPa，具體情況要視培養情況和設備條件來定，適宜的罐壓，直接影響發酵液的發酵質量。
[0033]另外，各發酵參數以及培養基中各營養素的含量和配比，還影響最終生產的菌群中芽孢體的含量。芽孢體具有極強抗逆性，能夠保證芽胞桿菌在后續微生物制劑加工生產過程中，依然保持良好的活性，其含量是評判芽胞桿菌發酵的重要因素。
[0034]本發明所提供的枯草芽胞桿菌的工業發酵方法，通過控制各發酵參數和培養基的組成，具有以下有益效果:
[0035](I)本發明的發酵方法，以大量的實驗為基礎，通過設定適宜的發酵參數包括罐壓、轉速、通氣量、接種比例、發酵pH值、發酵溫度、培養時間等，使得最后制得的發酵液具有較高的含菌量，經過實驗證明，最后發酵液中枯草芽胞桿菌的含菌量可以達到1.04X 11t3?1.24 X 1010CFU/mL ο
[0036](2)本發明的發酵方法，通過配置合適的培養基以及發酵參數，使得最后制得的發酵液中枯草芽胞桿菌的芽孢含量達到9.2 X 19?1.12 X 1010CFU/mL，芽孢形成率為88.5 %?93.8%，為進一步制得高質量微生物制劑提供了優良原料基礎。
[0037](3)本發明的發酵原料易得，發酵條件和參數簡單易控制，設備常規，發酵周期短，25?30小時可停罐，符合工業化發酵生產要求，為可推廣的工業型發酵。
【具體實施方式】
[0038]為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例，對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。
[0039]本發明的基本思想是，利用種子發酵罐和液體發酵罐，并配合合適發酵參數，使得制得的發酵液含菌多、芽孢形成率高，并且由于設備常規、操作簡單等特點，該方法適合用于大規模工業發酵。
[0040]—種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法，以下步驟:
[0041 ] (I)取枯草芽胞桿菌菌落接入搖瓶培養，形成枯草芽胞桿菌搖瓶種子液。
[0042](2)配置種子發酵罐的種子發酵培養基，其中所述種子發酵培養基的初始的pH值為6.5?7.7。
[0043](3)將枯草芽胞桿菌搖瓶種子液接入種子發酵罐發酵，其中，接種體積百分比為0.3?0.6 %，發酵溫度為30?35 0C，種子發酵罐轉速為180?200轉/分，通氣量為1: 0.3?1:
0.6，罐壓為0.02?0.08Mpa，培養8?13小時，得到種子罐菌液。
[0044](4)配置液體發酵罐的液體發酵培養基，其中所述液體發酵培養基的初始的pH值為6.5?7.7。
[0045](5)將枯草芽胞桿菌種子罐菌液無菌轉入液體發酵罐，其中，接種體積百分為8?12%,發酵溫度為30?35 °C，液體發酵罐轉速為150?175轉/分，通氣量為1: 0.3?1: 1.8，罐壓為0.02?0.08Mpa，培養22?31小時，放罐得到枯草芽胞桿菌高密度發酵液。
[0046]步驟(3)具體包括:接種體積為0.5%,發酵培養基的初始pH值為6.8?7.5，發酵溫度為32 0C，200轉/分，通氣量為1:0.5，罐壓為0.03?0.06Mpa，培養9?12小時。步驟(5)包括:接種體積為10%，發酵培養基的初始PH值為6.5?7.7，發酵溫度為32?35°C，170轉/分，通氣量為1: 0.5?1: 1.5，罐壓為0.03?0.06Mpa，培養25?30小時。以上兩個步驟的具體操作細化，可進一步提高最終的菌株和芽孢的生成量。
[0047]種子發酵培養基和液體發酵培養基的初始pH值均為6.8?7.5，通過調整發酵培養基到合適的pH值，可以進一步提高發酵效果。
[0048]另外，種子發酵培養基和液體發酵培養基均包括以下組分和組分含量:葡萄糖0.8?1.0%，玉米粉0.8?1.2%，酵母粉0.3?0.5%，豆柏粉1.8?2.5% ,CaCO30.2?0.5 %，Κ2ΗΡ040.1?0.3%，MgSO40.04 ?0.06% ,MnSO40.02 ?0.03%，泡敵 0.05% ?0.1 %。其中葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆柏粉、CaCO3、K2HP04、MgS04、MnS04的組分含量為質量百分含量，泡敵為體積百分含量。
[0049]發酵培養基的各成分以及比例也是影響芽孢形成的重要因素。在其他條件保持最適的條件下，將種子發酵培養基和液體發酵培養基作以上成分配制時，本發明的發酵方法的芽孢的形成率可以達到90%以上。
[0050]在本發明的步驟(2)中，種子發酵罐為500L種子發酵罐，種子發酵培養基為300L;在本發明的步驟(3)中，液體發酵罐為5000L液體發酵罐，液體發酵培養基為3000L。
[0051]控制發酵罐裝液體積，使其與接種量、通風情況、罐壓相匹配，以獲得足夠的溶氧，可以降低從搖瓶到發酵罐放大培養時產生的延遲期，進而進一步控制整個工業發酵的周期。
[0052]步驟(I)具體可以包括:用滅菌接種鏟鏟取枯草芽胞桿菌菌落，接入搖瓶中的NA液體培養基，34°C，180轉/分震蕩培養1?14小時，生長至OD6qq0.8?1.2，形成枯草芽胞桿菌搖瓶種子液;NA液體培養基的pH值為7.0?7.2，NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，水1L。搖瓶為2000mL三角瓶，搖瓶內裝有500mLNA液體培養基。
[0053]步驟(I)為實驗室搖瓶培養階段，是整個工業發酵方法的基礎階段，通過對培養參數進行合理的配置，能夠保證放大培養前的種子液質量。
[0054]步驟(I)之前還包括步驟:(11)將保存的枯草芽胞桿菌菌種進行活化。
[0055]步驟(II)具體包括:步驟(I I)包括:從保存枯草芽胞桿菌菌種的斜面蘸取少許菌落劃線于NA固體平板，置于32°C培養箱培養30?48小時，至枯草芽胞桿菌長出形成菌落;其中，NA固體平板的培養基的pH值為7.0?7.2，NA固體平板的培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，瓊脂粉 20g，水 1L。
[0056]另外，步驟(2)和步驟(4)均包括滅菌程序。其中步驟(2)具體包括:對種子發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的種子發酵培養基的初始PH值為6.5?7.7。步驟(4)具體包括:對液體發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的液體發酵培養基的初始pH值為6.5?7.7。
[0057]此外，當種子發酵培養基和液體發酵培養基的初始pH值均為6.8?7.5時，步驟(2)具體可以包括，對種子發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的種子發酵培養基的初始PH值為6.8?7.5。步驟(4)具體包括:對液體發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的液體發酵培養基的初始pH值為6.8?7.5o
[0058]需要說明的是，本發明的工業發酵方法適用于枯草芽胞桿菌菌株B201，由國家微生物菌種保藏管理中心保存，保存序號是5786。
[0059]為進一步說明本發明的一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法并做進一步的解釋，下面將配合具體的實施例進行詳述。
[0060]實施例1發酵方法I
[0061](11)取無菌斜面保存的枯草芽胞桿菌B201劃線于NA固體平板，32°C靜止培養30小時，至清晰單菌落長出。嫩固體培養基按質量百分比包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，瓊脂2(^，水比，？!1為7.0。
[0062](I)將NA固體平板上長出的B201菌落接種于500mLNA液體種子培養基，置于2L三角瓶中，34°C，180轉/分震蕩培養10小時，測定OD6QQ為0.8，NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.0。
[0063](2)配制種子發酵罐的種子發酵培養基，其中種子發酵罐為500L，裝液量為300L，對種子發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118°C，滅菌時間為30min，滅菌后的種子發酵培養基的初始PH值為6.8。
[0064](3)將步驟(I)中的種子液接種于步驟(2)的種子發酵罐，種子發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HPO40.I % ,MgSO40.06 % ,MnSO40.02% ,泡敵(體積百分比)0.05%,余量為水，接種量為
0.3%,種子罐發酵條件為30 0C，200轉/分，通氣比1: 0.5，罐壓0.04Mpa，培養8小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌菌體生長良好。
[0065](4)配制液體發酵罐的液體發酵培養基，其中液體發酵罐為5000L，裝液量為3000L，對液體發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的液體發酵培養基的初始的pH值為7.2;
[0066](5)將步驟(3)中的發酵液全部轉入步驟(4)的液體發酵罐，液體發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HPO40.1 MgSO40.06% ,MnSO40.02%，泡敵(體積百分比)0.05%，余量為水。發酵罐發酵條件為30°C，150轉/分，通氣比O?8小時1:0.5，9?10小時1:0.8，11?12小時1:1.0，13?16小時1: 1.2，17?25小時1: 1.8，罐壓0.05Mpa，培養22小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌。
[0067]觀測結果:
[0068](I)菌體生長旺盛，16小時開始形成芽孢。
[0069](2)采用平板計數法，計算22小時放罐時活菌量和芽孢量，其中活菌量達到1.13 X1010CFU/mL，芽孢量1.06 X 1010CFU/mL，芽孢形成率為93.8 %。。
[0070]實施例2發酵方法2
[0071](11)取無菌斜面保存的枯草芽胞桿菌B201劃線于NA固體平板，32°C靜止培養48小時，至清晰單菌落長出。嫩固體培養基按質量百分比組成為:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，瓊脂2(^，水比，？!1值為7.2。
[0072](I)將NA固體平板上長出的B201菌落接種于500mLNA液體種子培養基，置于2L三角瓶中，34°C，180轉/分震蕩培養14小時，測定OD6qq為1.2，NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.2。
[0073](2)配制種子發酵罐的種子發酵培養基，其中種子發酵罐為500L，裝液量為300L，對種子發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的種子發酵培養基的初始PH值為7.5。
[0074](3)將步驟(I)中的種子液接種于步驟(2)的種子發酵罐，種子發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖0.8%，玉米粉0.8%，酵母粉0.5%，豆柏粉1.8%，CaC030.5%，K2HPO40.1 MgSO40.04% ,MnSO40.03 %，泡敵(體積百分比)0.1 %，余量為水。接種量為
0.6%,種子罐發酵條件為35 0C，280轉/分，通氣比1:0.6，罐壓0.05Mpa，培養13小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌菌體生長良好。
[0075](4)配制液體發酵罐的液體發酵培養基，其中液體發酵罐為5 O O O L，裝液量為3000L，對液體發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的液體發酵培養基的初始的pH值為6.8。
[0076](5)將步驟(3)中的發酵液全部轉入步驟(4)的液體發酵罐，液體發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖0.8%，玉米粉0.8%，酵母粉0.5%，豆柏粉1.8%，CaC030.5%，K2HPO40.1 % ,MgSO40.04% ,MnSO40.03%，泡敵(體積百分比)0.1 %，余量為水。發酵罐發酵條件為35°C，175轉/分，通氣比O?8小時1:0.5，9?10小時1:0.8，11?16小時1:1.0，17?22小時1:1.2，23?28小時1: 1.5，罐壓0.03?&，培養31小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌菌體。
[0077]觀測結果:
[0078](I)菌體生長旺盛，20小時開始形成芽孢。
[0079](2)采用平板計數法，計算31小時放罐時活菌量和芽孢量，其中活菌量為1.08 X1010CFU/mL，芽孢量9.8 X 109CFU/mL，芽孢形成率為90.7 %。
[0080]實施例3發酵方法3
[0081](11)取無菌斜面保存的枯草芽胞桿菌B201劃線于NA固體平板，32°C靜止培養40小時，至清晰單菌落長出。NA固體培養基按質量百分比組成包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，瓊脂 20g，水 lL，pH7.1。
[0082](I)將NA固體平板上長出的B201菌落接種于500mLNA液體種子培養基，置于2L三角瓶中，34°C，180轉/分震蕩培養12小時，測定OD6QQ為1.1，NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.1。
[0083](2)配制種子發酵罐的種子發酵培養基，其中種子發酵罐為500L，裝液量為300L，對種子發酵培養基進行滅菌，120°C滅菌30min，滅菌后初始pH6.5。
[0084](3)將步驟(I)中的種子液接種于步驟(2)的種子發酵罐，種子發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HPO40.2 % ,MgSO40.06 % ,MnSO40.02% ,泡敵(體積百分比)0.08%,余量為水。接種量為
0.5%,種子罐發酵條件為32 °C，200轉/分，通氣比1: 0.5，罐壓0.03Mpa，培養9小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌菌體生長良好。
[0085](4)配制液體發酵罐的液體發酵培養基，其中液體發酵罐為5000L，裝液量為3000L，對液體發酵培養基進行滅菌，118°C滅菌30min，滅菌后初始PH7.2。
[0086](5)將步驟(3)中的發酵液全部轉入步驟(4)的液體發酵罐，液體發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖1.0%，玉米粉1.2%，酵母粉0.3%，豆柏粉2.5%，CaC030.2%，K2HP040.3%,MgSO40.06%,MnSO40.02%,泡敵(體積百分比)0.08%，余量為水。發酵罐發酵條件為32°C，170轉/分，通氣比O?8小時1:0.5，9?10小時1:0.8，11?12小時1:1.0，13?16小時1: 1.2，17?25小時1: 1.5，罐壓0.03Mpa，培養25小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌。
[0087]觀測結果:
[0088](I)菌體生長旺盛，16小時開始形成芽孢。
[0089](2)采用平板計數法，計算25小時放罐時活菌量和芽孢量，其中活菌量為1.13 X110CFlVmL，芽孢量1.06 X 1010CFU/mL，芽孢形成率為93.8 %。
[0090]實施例4發酵方法4
[0091](11)取無菌斜面保存的枯草芽胞桿菌B201劃線于NA固體平板，32°C靜止培養36小時，至清晰單菌落長出。NA固體培養基按質量百分比組成包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，恥〇158，瓊脂2(^，水比，？!1值為7.1。
[0092](I)將NA固體平板上長出的B201菌落接種于500mLNA液體種子培養基，置于2L三角瓶中，34°C，180轉/分震蕩培養12小時，測定OD6qq為1.2，NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水lL，pH7.1。
[0093](2)配制種子發酵罐的種子發酵培養基，其中種子發酵罐為500L，裝液量為300L，121°C滅菌30min，滅菌后初始ρΗ7.7。
[0094](3)將步驟(I)中的種子液接種于步驟(2)的種子發酵罐，種子發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖0.9%，玉米粉1.0%，酵母粉0.4%，豆柏粉1.8%，CaC030.3%，K2HP040.2% ,MgSO40.05% ,MnSO40.03%，泡敵(體積百分比)0.08% ,余量為水。接種量為
0.5%,種子罐發酵條件為32 0C，200轉/分，通氣比1:0.5，罐壓0.06Mpa，培養12小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌菌體生長良好。
[0095](4)配制液體發酵罐的液體發酵培養基，其中液體發酵罐為5 O O O L，裝液量為3000L，對液體發酵培養基進行滅菌，118°C滅菌30min，滅菌后初始pH7.3。
[0096](5)將步驟(3)中的發酵液全部轉入步驟(4)的液體發酵罐，液體發酵培養基組成(質量百分比)為:葡萄糖0.9%，玉米粉1.0%，酵母粉0.4%，豆柏粉1.8%，CaC030.3%，K2HPO40.2 % ,MgSO40.05% ,MnSO40.03%,泡敵(體積百分比)0.08 %，余量為水。發酵罐發酵條件為35°C，170轉/分，通氣比O?10小時1:0.5，11?14小時1:0.8，15?18小時1:1.0，19?22小時1: 1.2，23?30小時1: 1.5，罐壓0.06Mpa，培養30小時，結晶紫染色觀察枯草芽胞桿菌。
[0097]觀測結果:
[0098](I)菌體生長旺盛，16小時開始形成芽孢。
[0099](2)采用平板計數法，計算30小時放罐時活菌量和芽孢量，其中活菌量達到1.04 X1010CFU/mL，芽孢量9.2 X 109CFU/mL，芽孢形成率為88.5 %。
[0100]綜上所述，本發明的枯草芽胞桿菌的工業發酵方法具有以下有益效果:
[0101](I)本發明的發酵方法，以大量的實驗為基礎，通過設定適宜的發酵罐的罐壓、轉速和通氣量以及發酵參數，使得最后制得的發酵液具有極高的含菌量，經過實驗證明，最后發酵液中枯草芽胞桿菌的活菌量可以達到1.04 X 1iq?1.24 X 101QCFU/mL。
[0102](2)本發明的發酵方法，通過配置合適的培養基以及發酵參數，使得最后制得的發酵液中枯草芽胞桿菌的芽孢含量達到9.2 X 19?1.12 X 1010CFU/mL，芽孢形成率為88.5 %?93.8%，為制得高質量微生物制劑提供了優良原料基礎。
[0103](3)本發明的發酵原料易得，發酵條件和參數簡單易控制，設備常規，發酵周期短，25?30小時可停罐，符合工業化發酵生產要求，為可推廣的工業型發酵。
[0104]最后應說明的是:在本文中，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包含一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設備中還存在另外的相同要素。
[0105]以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制。盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換;而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本明各實施例技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1.一種枯草芽胞桿菌的工業發酵方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取枯草芽胞桿菌菌落接入搖瓶培養，制成搖瓶種子液； (2)在種子發酵罐中配制種子發酵培養基，其中所述種子發酵培養基的初始的pH值為6.5?7.7; (3)將搖瓶種子液接入種子發酵培養基中發酵，其中，接種體積百分比為0.3?0.6%，發酵溫度為30?35°C，種子發酵罐轉速為180?200轉/分，通氣量為1: 0.3?1: 0.6，罐壓為0.02?0.08Mpa，培養8?13小時，得到種子罐菌液； (4)在液體發酵罐中配制液體發酵培養基，其中所述液體發酵培養基的初始的pH值為6.5?7.7; (5)將種子罐菌液無菌轉入液體發酵培養基中，其中，接種體積百分比為8?12%，發酵溫度為30?35°C，液體發酵罐轉速為150?175轉/分，通氣量為1:0.3?1: 1.8，罐壓為0.02?0.08Mpa，培養22?31小時，放罐，得到枯草芽胞桿菌高密度發酵液。2.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于，所述步驟(3)包括: 接種體積百分比為0.5%，發酵溫度為32°C，種子發酵罐轉速為200轉/分，通氣量為1:0.5,罐壓為0.03?0.06Mpa，培養9?12小時； 所述步驟(5)包括: 接種體積百分比為10%，發酵溫度為32?35°C，液體發酵罐轉速為170轉/分，通氣量為1: 0.5?1:1.5，罐壓為0.03?0.06Mpa，培養25?30小時。3.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于， 所述種子發酵培養基和所述液體發酵培養基的初始pH值均為6.8?7.5。4.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于， 所述種子發酵培養基和所述液體發酵培養基均包括以下組分和組分含量:葡萄糖0.8?1.0%，玉米粉0.8?1.2%，酵母粉0.3?0.5%，豆柏粉1.8?2.5% ,CaCO30.2?0.5 %，K2HPO40.I?0.3 % ,MgSO40.04?0.06 % ,MnSO40.02?0.03 %，泡敵0.05?0.I %，其余為水； 其中，葡萄糖、玉米粉、酵母粉、豆柏粉、CaC03、K2HP04、MgS04、MnS04的含量為質量百分含量，泡敵為體積百分含量。5.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于， 所述種子發酵罐為500L種子發酵罐，所述種子發酵培養基為300L，所述液體發酵罐為5000L液體發酵罐，所述液體發酵培養基為3000L。6.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于，所述步驟(2)包括: 對種子發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的種子發酵培養基的初始PH值為6.5?7.7。 所述步驟(4)包括: 對液體發酵培養基進行滅菌，滅菌溫度為118?121°C，滅菌時間為30min，滅菌后的液體發酵培養基的初始PH值為6.5?7.7。7.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于，所述步驟(I)包括: 用滅菌接種鏟鏟取枯草芽胞桿菌菌落，接入搖瓶中的NA液體培養基，34°C，180轉/分，震蕩培養10?14小時，生長至0D6QQ0.8?1.2，形成枯草芽胞桿菌搖瓶種子液； 所述NA液體培養基的pH值為7.0?7.2，所述NA液體培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaC15g，水1L。8.如權利要求1所述的工業發酵方法，其特征在于，所述步驟(I)之前還包括步驟: (11)將保存的枯草芽胞桿菌菌種進行活化。9.如權利要求8所述的工業發酵方法，其特征在于，所述步驟(11)包括: 從保存枯草芽胞桿菌菌種的斜面蘸取少許菌落劃線于NA固體平板，置于32°C培養箱培養30?48小時，至枯草芽胞桿菌長出形成菌落； 其中，所述NA固體平板的培養基的pH值為7.0?7.2，所述NA固體平板的培養基包括:牛肉膏3g，蛋白胨7g，NaCl 5g，瓊脂粉20g，水1L。
【文檔編號】C12R1/125GK105907661SQ201610218196
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月8日
【發明人】王 琦, 劉春紅, 李燕, 張麗霞
【申請人】中國農業大學