一種名和氏球腔菌菌株及其應用

一種名和氏球腔菌菌株及其應用
【專利摘要】一種名和氏球腔菌菌株及其應用。本發明提供一種新型的名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129保藏名稱為：Mycosphaerella nawae ZJLQ129，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國 武漢 武漢大學；保藏日期：2015年9月9日，保藏號：CCTCC NO：M2015517。本發明還提供該菌株的用途，該菌株能產生一種具有免疫抑制作用的次生代謝產物球腔菌素(?)mycousunine。CCTCC NO：M201551720150909
【專利說明】
一種名和氏球腔菌菌株及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物領域，具體地說是公開一種內生真菌名和氏球腔菌菌株 ZJLQ129,及其應用，以及名和氏球腔菌菌株ZJLQ129產生代謝產物二苯并呋喃類化合物球 腔菌素(-)mycousunine，該化合物具有免疫抑制作用。
【背景技術】
[0002] 植物內生真菌(Plantendophyticfungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部 階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌，被感染的宿主植物(至少是暫時)不表 現出外在癥狀，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直 接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。植物微生物系統中的內生真菌，廣泛存在于植物 組織內，不受外界環境的影響。植物內生真菌是植物微生物系統中的天然組成成分，在進化 過程中與植物寄主建立了和諧的共生關系，，其次生代謝產物十分豐富。植物內生真菌幾乎 存在于所有目前已研究過的植物中，分布廣，種類多。研究表明，感染內生菌的植物宿主往 往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動物危害等優勢，比未感染植株更具生存競爭力。在內 真生菌-植物宿主-食草動物生態系統中，植物內生真菌扮演著前所未知的重要生態學作 用。發揮這些作用的物質基礎是內生真菌產生的豐富多樣的次生代謝產物，它們具有多種 生物活性，在農業和（或）醫藥業中具有重要的應用潛力。近年來，隨著美國科學家 A.Stierle在太平洋短葉杉上發現了抗腫瘤藥物紫杉醇的產生菌，藥用植物和瀕危植物內 生真菌及其活性物質的研究成為了藥物開發的重要方向。我國植物資源十分豐富，對其內 生真菌的研究將有利于微生物藥物的開發和珍稀植物資源的保護。
[0003]植物內生真菌作為與植物共生的真菌，其在與植物共生的過程中，發展擁有與普 通致病菌不同的天然代謝產物。分離植物中存在的新的內生真菌，探索該菌的次生代謝產 物活性，并將其次生代謝產物純化制作成天然藥物，是一個新的開發方向。比如，來源于化 學或者天然植物或微生物中的免疫抑制劑，常用的主要有五類：（1)糖皮質激素類，如可的 松和強的松；（2)微生物代謝產物，如環孢菌素和藤霉素等；（3)抗代謝物，如硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤等；（4)多克隆和單克隆抗淋巴細胞抗體，如抗淋巴細胞球蛋白和0KT3等；（5)烷化 劑類，如環磷酰胺等。其中，微生物酵解作為主要合成方法，已有多種產品，如環孢菌素 CsA 類、他克莫司了3(^〇1丨111118 01(5〇6)、雷帕霉素1^口31117(^11(1^]\〇及其衍生物5〇2 1^〇、 Mizoribine(MZ)等。以環孢菌素為例，七十年代后期瑞士的Borel發現了一種從霉菌酵解產 物里提取的一種只含11個氨基酸的環形多肽，取名為環孢素(CsA)，可以有效地特異性抑制 淋巴細胞反應和增生。對T細胞，尤其是TH細胞有較好的選擇性抑制作用，而對其他的免疫 細胞的抑制作用則相對較弱，因此在抗器官移植排斥中取得了很好的療效;也用于自身免 疫病的治療，因此是一種具有很高臨床使用價值的免疫抑制劑。經10年的臨床試驗應用研 究證實其抗排斥反應作用較其他藥物強而且副作用小的多。故于八十年代末被批準正式注 冊投入市場應用。CsA近20年的臨床應用顯示了神奇的效果，使得除小腸移植外，肝、腎、心 及心/肺、胰移植的病人/移植物一年存活率達70-85%，而在此之前僅30-50% XsA相關性 神經毒性癥狀的發生率大約為10-28%，是影響患者預后的一種較為重要的因素。輕度以頭 痛、肢體震顫、感覺障礙等多見，中度以視力障礙為主。CsA相關神經毒性的重癥表現發生率 極低。
[0004] 植物內生真菌作為與植物共生的真菌，其在與植物共生的過程中，發展擁有與普 通致病菌不同的天然代謝產物。分離植物中存在的新的內生真菌，探索該菌的次生代謝產 物活性，是一個新的開發方向。

【發明內容】

[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種新型的名和氏球腔菌Mycosphaerel la nawae ZJLQ129及其用途，該菌株能產生一種具有免疫抑制作用的次生代謝產物球腔菌素 (-)mycousunine。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種名和氏球腔菌：保藏名稱為： Mycosphaerella nawae ZJLQ129,保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國武 漢武漢大學;保藏日期:2015年9月9日，保藏號:CCTCC N0:M2015517。
[0007] 本發明還同時提供了上述名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是:產生次生代謝產 物球腔菌素(-)mycousunine。優選的，該球腔菌素(-)mycousunine化合物具有免疫抑制活 性。更為優選的，在1(^1濃度球腔菌素(-)1^〇〇118111^116下，免疫抑制率達51.28%。
[0008]本發明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae Z幾 Q129CCTCC N0:M2015517)具有如下特性:PDA培養基上生長緩慢，20-25d菌落直徑為2-3cm，60-66d菌落 直徑為3-4cm，生長速率減小。PDA培養基上于25°C，12小時黑暗交替培養，菌落呈不規則形， 無氣生菌絲，菌絲初期為灰色，后期變為灰黑色，背面和正面均有皺折，菌落邊緣不整齊，無 色素分泌;子囊座為黑色，不產生孢子，菌絲有隔膜。
[0009]本發明的菌株是從植物菝葜中分離得到的，名和氏球腔菌菌株Z JLQ1 29 (即 Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCC N0:M2015517)，它屬于真菌界（Fungi)，雙核亞界 (Dikarya)，子囊菌門（Ascomycota)，盤菌亞門（Pezizomycotina)，子囊菌綱 (Ascomycetes)，盤菌目（Pezizales)，盤菌科(Pezizaceae)，球腔菌屬(Mycosphaerella)。 [0010]本發明中說指的免疫抑制：是指對于免疫應答的抑制作用，或者說是對機體的免 疫反應具有抑制作用。免疫抑制劑能抑制與免疫反應有關細胞(T細胞和B細胞等巨噬細胞） 的增殖和功能，能降低抗體免疫反應。在實驗過程中，免疫抑制作用可通過測定刀豆蛋白A 誘導的T細胞增殖的抑制率體現。
【附圖說明】
[0011 ]圖1為化合物⑴球腔菌素(-)myC〇usunine結構式。
【具體實施方式】
[0012] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0013] 實施例1、名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)Z幾 Q129的分離培養與鑒 定：
[0014] 在實驗室中按下列條件和步驟分離培養，即可獲得本發明所述的名和氏球腔菌菌 株ZJLQ129:
[0015] 1)從我國浙江龍泉自然保護區采集，將采集的拔葜葉子用濃度0.5% (w/v)的次氯 酸鈉進行表面消毒l〇min，然后無菌水漂洗后置于無菌濾紙上吸干水。菝葜，也稱金剛藤，百 合科菝葜屬，多年生藤本落葉攀附植物。生于山坡林下，分布于中國長江以南各地，攀援灌 木，葉薄革質或堅紙質，干后通常紅、褐色或近古銅色，圓形、卵形或其他形狀，長3-10厘米， 寬1.5-6(-10)厘米，下面通常淡綠色，較少蒼白色;葉柄長5-15毫米，約占全長的1/2-2/3具 寬0.5-1毫米(一側）的鞘，幾乎都有卷須，少有例外，脫落點位于靠近卷須處，根狀莖粗厚， 堅硬，為不規則的塊狀，粗2-3厘米。莖長1-3米，少數可達5米，疏生刺。
[0016] 2)用無菌刀片把表面消毒過的菝葜葉子切成lcm左右大小的組織片，將組織片移 接在含100μg/ml氨芐青霉素和鏈霉素的2%(w/v)水瓊脂平板上，光照培養箱中培養，培養 條件:25°C，16小時光照，8小時黑暗；
[0017] 3)待菌絲長出后，將單菌絲頂端移接到PDA固體培養基上培養，25 °C培養。連續純 化3次，獲得純培養。其中上述培養基或培養液的成分如下:PDA培養基：即馬鈴薯葡萄糖瓊 月旨(potato dextrose agar)去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水煮沸20min，以紗布濾去固體 殘渣，濾液加水補足至l〇〇〇mL，加入20g葡萄糖溶解，再加入15g溶化的瓊脂粉，分裝，121°C 滅菌20min備用。
[0018] 本發明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae Z幾 Q129CCTCC N0:M2015517)具有如下特性:PDA培養基上生長緩慢，20-25d菌落直徑為2-3cm，60-66d菌落 直徑為3-4cm，生長速率減小。PDA培養基上于25°C，12小時黑暗交替培養，菌落呈不規則形， 無氣生菌絲，菌絲初期為灰色，后期變為灰黑色，背面和正面均有皺折，菌落邊緣不整齊，無 色素分泌；子囊座為黑色，不產生孢子，菌絲有隔膜。名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即 Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCC N0:M2015517)，它屬于真菌界（Fungi)，雙核亞界 (Dikarya)，子囊菌門（Ascomycota)，盤菌亞門（Pezizomycotina)，子囊菌綱 (Ascomycetes)，盤菌目（Pezizales)，盤菌科(Pezizaceae)，球腔菌屬(Mycosphaerella)。
[0019] 4)菌種鑒定:將ZJLQ129進行beta-tubulin基因測序，并利用BLAST程序進行比對， 利用PAUP程序進行系統發育分析。
[0020]將菌株菌絲在液氮中研成粉末，取100mg粉末裝于1.5mL離心管中，采用DNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN)按廠商的程序提取基因組DNA。采用通用引物BT1(5'_ AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3，）和BT22(5 '-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3，）擴增beta-tubulin 基因，PCR體系：DNA模板（100ng/yL)5 · OyL，10 X PCR緩沖液（含25mmol/L MgCl2)5 · OyL， dNTPs(5mmol/L)1.0yL，引物（50yg/mL)各0.5yL，Taq DNA聚合酶（2U/yL)lyL，加水補足50μ L，混勻后在BI0RAD公司S1000型號的PCR儀上進行PCR反應，PCR反應條件:94°C3min;94°C 30s，53°C50s，72°C90s，35 個循環；72°C 10min。
[0021] PCR擴增產物用Axygen柱式DNA膠回收試劑盒進行純化。純化的ITS rDNA PCR擴增 產物分別用擴增引物對ITS1和ITS4測序，純化的beta-tubulin擴增產物測序。測序由上海 生工生物工程服務有限公司完成。測得的序列在GenBank上進行BLAST搜索。基于BLAST結 果，用軟件Clustal X 1.81將菌株ZJLQ129的序列與GenBank上球腔菌屬的相關序列進行比 對，然后進行系統發育分析。以上結果表明菌株ZJLQ1 29可以定名為名和氏球腔菌 Mycosphaerella nawae。
[0022]實施例2、球腔菌素(-)mycousunine的制備和結構鑒定
[0023] 1)名和氏球腔菌菌株(1}^〇8。1^6^113仙￥36)2幾(>)129發酵培養，依次進行以下 步驟：
[0024] 將ZJLQ129菌餅(直徑為0.5厘米)共10個接入500ml PDB中于25°C，200轉/小時搖 床上培養10天，培養液在無菌條件下粉碎，加入500ml PDB中培養，每瓶接入菌絲液25ml，共 接40瓶即20L，于室溫下靜置培養2周后過濾分別獲得發酵液與菌絲體。其中發酵液用乙酸 乙酯萃3次后萃取液濃縮得浸膏1.72g(A部分），菌絲體用丙酮浸泡過夜后濃縮至至小體積， 獲得浸膏1.76(B部分）。合并二部分得浸膏3.5g(C部分）。
[0025] 其中上述培養基或培養液的成分如下：
[0026] PDA培養基：即馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar)去皮馬鈴薯200g，切成 小塊，加水煮沸20min，以紗布濾去固體殘渣，濾液加水補足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解， 再加入15g溶化的瓊脂粉，分裝，121°C滅菌20min備用。
[0027] PDB培養液：即馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth):去皮馬鈴薯200g，切成小 塊，加水煮沸20min，以紗布濾去固體殘渣，濾液加水補足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，分 裝，121°C滅菌20min備用。
[0028] 2)化合物的制備：
[0029]取上述浸膏C 3.5g加15g硅膠拌樣，旋轉蒸發儀蒸干。另外，用200-300硅膠950克 干法裝柱，將拌樣后的樣品上樣后進行柱層析分離，依次用石油醚：乙酸乙酯4: l(v/v)，石 油醚：乙酸乙酯3:2(v/v)，石油醚：乙酸乙酯3:7(v/v)，乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇4:l(v/v) 分別進行梯度洗脫分離，每500ml接收1個流分，共接收31個流分，將接收的樣品進行硅膠薄 層層析，以茴香醛顯色劑顯色后，將Rf值為〇. 46且茴香醛噴霧顯色為藍色的流分合并，獲得 Fr8這一部分。茴香醛顯色劑的配方如下：茴香醛(對甲氧基苯甲醛）1:廣譜。配制方法：135 乙醇+5mL濃硫酸+1.5mL of冰醋酸+3.7mL茴香醛，劇烈攪拌，使混合均勻。茴香醛(對甲氧基 苯甲醛)2:砲稀，桉樹腦(cineoles)，withanolides，出油柑堿(acronycine)。配制方法:茴 香醛:HC104:丙酮：水（1:10:20 :80)<^8部分(1^值=0.46)共1.7(^采用凝膠柱層析分離純 化，以氯仿：甲醇l:l(v/V)為洗脫機洗脫反復分離，硅膠薄層層析檢測，以茴香醛顯色劑顯 色后，合并組分相同的流分，最終獲得純品300mg，記為化合物（1)。化合物（1)是從名和氏球 腔菌株ZJLQ129中分離獲得的代謝產物。
[0030] 3)化合物（1)球腔菌素(-)mycousunine的鑒定過程如下：
[0031]化合物（1)，見圖 1，黃色針晶，mp 86-89°C(Me0H);HRESIMS m/z:376.1158M+ (calcd for Ci9H2〇〇8 376.1158)? NMR(400MHz，CDCl3)，3.17(lH，d，J=18Hz，H-4a) ,3.31 (lH，d，J=18Hz，H-4b)，1.63(3H，s，H-10)，2.56(3H，s，H-12)，2.59(3H，s，H-14)，2.04(3H, s，H-15)，3.54(3H，s，H-16) .13C 匪R(100MHz，CDC13)197.7(sJ-C)，110.7(s，2-C) ,194.6 (s，3-C)，37.9(t，4-C)，51.3(q，4a-C)，156.6(s，5a-C)，101.8(s，6-C)，163.4(s，7-C)， 107.2(s,8-C),159.l(s,9-0,105.3(s,9a-C),59.8(s,9b-C),17.3(q,10-C),202.4(s,11-C)，27.4(9，12-〇,201.0(8，13-〇,31.2(9，14-〇,7.2(9，15-〇,51.3(9,016)。化合物（1) 的分子量與核磁共振氫譜與碳譜數據與松蘿酸很相似，說明該化合物為二苯并呋喃類化合 物。化合物1比松蘿酸多了一個甲氧基(SC 51.4JH3.56，s 3H)，一個ABq亞甲基0C 37.9，δ H 3.17d，J = 18.0jH 3.31d，J=18.0)，但少了一個苯環叔碳及對應氫質子信號（δ〇98·2，δ H 5.98，s 1H)，說明化合物1的4a位被甲氧基取代，而4號位為亞甲基，化合物（1)的1H NMR 及13C NMR與文獻中（-)-mycousnine的數據一致，因此將化合物（1)鑒定為(-)mycousnine， 中文名球腔菌素。
[0032]實施例3:化合物(1)球腔菌素(-)mycousnine的免疫抑制活性測定：
[0033] 經測定，該化合物（1)球腔菌素(-)mycousnine在ΙΟμΜ劑量下對刀豆蛋白A誘導的T 細胞增殖的抑制率是51.28%，表現為較明顯的免疫抑制活性。
[0034] 1、主要儀器:MC0-15AC型細胞培養箱，日本三洋公司；SpX-250B-Z生化培養箱，上 海博訊實業有限公司；1700型電子天平，德國Sartorius公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州 安泰空氣技術有限公司；LD5-2A型離心機，北京醫用離心機廠；1-13型離心機，德國SIGMA公 司;MH-1型微量振蕩器，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；synergy-2SLFPA全波長多 功能酶標儀，美國BioTek公司;XDS-1B型生物倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠。
[0035] 2、實驗動物來源:雌性SPF級C57BL/6小鼠，6周齡，18-22g，購于上海西普爾-必凱 實驗動物有限公司，實驗動物購得后飼養一周，適應環境后再進行實驗。實驗動物的處理程 序按照浙江省醫學科學院實驗動物福利倫理委員會的規定執行。
[0036] 3、試劑：RPMI 1640細胞培養液購于Thermo Fisher公司，臨用前加入100IU/ml青 霉素、l〇〇μg/ml鏈霉素和10%小牛血清配制成完全培養液;新生小牛血清購自杭州四季青 生物工程有限公司。刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)、噻挫藍（3-(4,5_ dimethylthiazol-2-yl )-3，5_dipenyltetrazolium bromid，MTT)、臺酸藍、二甲基亞諷溶 液(DMS0)購自Sigma公司；40μπι孔間細胞濾網購自Biologix公司；青霉素和鏈霉素溶液、 Hank's液購自江蘇碧云天生物技術研究所。
[0037] 4、供試品化合物（1)球腔菌素（-)myc〇uSnine配制：化合物（1)球腔菌素（-) mycousnine純度>99%。化合物（1)先以DMS0溶解為50mM濃度，-20°C冷凍保存。臨用前再采 用RPMI1640細胞培養液稀釋至相應濃度。稀釋液中DMS0的含量5 0.2%，對細胞的生物活性 沒有影響。
[0038] 5、單個脾細胞懸液制備：小鼠無菌取脾，研磨后，加適量Hank's液混懸，以40μπι孔 間細胞濾網濾過，1500rpm離心5分鐘，棄上清，加 Hank's液重復洗滌2次。收集脾細胞，加 RPMI1640完全培養液混懸制成單個脾細胞懸液。以0.4 %臺酚藍拒染法記數，活細胞數不少 于 95%。
[0039] 6、Con A誘導的T細胞增殖實驗測定:于96孔平底培養板中，每孔加100yL脾細胞懸 液（5X10 6cell/ml)，并加入50μ1 Con A溶液（2μg/ml)，最后加入不同濃度（0nM、16nM、 80ηΜ、400ηΜ、2μΜ和10μΜ)供試藥物球腔菌素(-)mycousnine的稀釋液50μ1，每個濃度重復4 孔，另設正常細胞對照孔。37°C，5%C0 2培養44小時后，各孔加入ΜΤΤ溶液(2mg/ml)50μ1，繼 續培養4h。離心（1800rpm，5min)，棄去各孔上清，分別加酸性DMS0溶液(4%1N HCl)150yl， 避光振蕩15min，測定0D 490nm，以Con Α作用孔(藥物濃度0)的增殖率計為100%，計算藥物 作用后的相對細胞增殖率。Μ T T是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)_ dimethylthiahiazo(-z_yl )_3，5_di-phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3_(4，5_ 二 甲基噻唑-2 )-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。MTT法的檢測 原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚 (Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMS0)能溶解細胞中的甲饋， 用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞 數成正比。根據測得的吸光度值(0D值），來判斷活細胞增殖數量，0D值越大，細胞活性越強， 增值率越高。如表一所示，左邊的劑量，數值為Blank的為空白背景組，0、16、80、400、2000和 10000 分別代表不同濃度 0碰、1611]\1、8011]\1、40011]\1、2以]\1和1(^]\1的球腔菌素（-)11^(3〇1181^116加 入，其中OnM球腔菌素(-)mycousnine作為對照組，在16nM濃度下，抑制率為17.95%;在8〇11]\1 濃度下，抑制率為12.82 % ;在400nM濃度下，抑制率為17.95 % ;在2μΜ濃度下，抑制率為 1 7.9 5 % ;在10 μ Μ濃度下，抑制率達5 1 . 2 8 %，表現出較好的免疫抑制活性。抑制率 (Inhibitory% )計算依據：（對照組0D值-實驗組0D值)/(對照組0D值-空白0D值）X 100%
[0040] 表一:Con A誘導的T細胞增殖實驗測定
[0041]
[0042]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種名和氏球腔菌菌株，其特征是：保藏名稱為:Mycosphaerella nawae ZJLQ129， 保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學;保藏日期:2015年9月9 日，保藏號：CCTCC N0:M2015517。2. 根據權利要求1所述的名和氏球腔菌菌株，其特征是:所述名和氏球腔菌菌株屬于真 菌界，雙核亞界，子囊菌門，盤菌亞門，子囊菌綱，盤菌目，盤菌科，球腔菌屬。3. 根據權利要求2所述的名和氏球腔菌菌株，其特征是:所述名和氏球腔菌菌株在PDA 培養基上生長緩慢，20-25d菌落直徑為2-3cm，60-66d菌落直徑為3-4cm; HM培養基上于25 °C，12小時黑暗交替培養，菌落呈不規則形，無氣生菌絲，菌絲初期為灰色，后期變為灰黑 色，背面和正面均有皺折，菌落邊緣不整齊，無色素分泌;子囊座為黑色，不產生孢子，菌絲 有隔膜。4. 權利要求1-3中任一名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是:所述名和氏球腔菌菌株產 生次生代謝產物球腔菌素。5. 根據權利要求4所述的名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是:所述的球腔菌素具有免 疫抑制活性。6. 根據權利要求5所述的名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是:所述的球腔菌素在ΙΟμΜ 濃度下免疫抑制率為51.28%。
【文檔編號】C12R1/645GK105907650SQ201610345842
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】章初龍, 林福呈, 馮曉曉, 王麗薇, 王國平
【申請人】浙江大學