一種血管內皮生長因子受體的ctl表位多肽及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽及其應用。該多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；或該多肽具有在SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列基礎上取代、缺失、置換、插入和/或添加一個至幾個氨基酸的衍生序列。本發明還提供一種疫苗，包括血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽和佐劑，所述佐劑為gp96蛋白。通過佐劑和血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽的配合具有提高免疫力，顯著提高治療腫瘤效果等優點。
【專利說明】
一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽 及其應用。
【背景技術】
[0002] 肺癌是目前國內乃至世界發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大 的惡性腫瘤之一。肺癌發病在我國惡性腫瘤中處于首位，長期吸煙的人群肺癌發病率高達 2/1000,隨著城市霧霾日益加重，肺癌發病已經并將繼續呈現高速增長。肺癌常用的治療方 法包括手術治療、化學治療、放射治療、革G向治療、免疫治療以及不同治療方法的聯合治療。 近年來，即使肺癌的治療方法不斷創新改進，但治療效果仍不能令人滿意，復發轉移幾率還 是較高。
[0003] 目前世界上傾向于將肺癌粗分為小細胞肺癌（SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，后 者包括除小細胞癌以外的其他上皮癌。小細胞肺癌的生物學行為與其他上皮性癌(鱗癌、腺 癌、腺鱗癌、大細胞癌）顯著不同，臨床上表現為高度惡性，早期即發生廣泛的遠處轉移，對 化學治療和放射治療較敏感，因而治療原則也不同于其他上皮癌。目前臨床上常見的肺癌 病人約80 %為包括鱗癌、腺癌等在內的非小細胞肺癌，這些病人確診時有85 %左右是中晚 期，約75%的晚期非小細胞肺癌病人失去了手術根治性治療機會、常規放化療的臨床效果 也不甚理想。
[0004] 分子靶向藥物治療是近年新興的一種治療手段，因其具有高度選擇性地殺死腫瘤 細胞而不殺傷或僅極少損傷正常細胞的特點，安全性和耐受性較好、毒付作用相對較小， 許多病人都視其為治療肺癌的一線生機。分子靶向是指在細胞分子水平上，針對已經明確 的致癌位點，來設計相應的治療藥物，藥物進入體內會特異地選擇致癌位點來相結合發生 作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞。1971年Folkman在《新 英格蘭醫學雜志》中首次提出"腫瘤生長依賴于血管生成"的概念。腫瘤一旦血管化，不僅生 長速度加快，而且容易發生轉移，如果得不到充足的供血，腫瘤將停止生長，因此針對腫瘤 血管生成為靶點的治療為腫瘤治療提供了有前景的新途徑。血管內皮生長因子(VEGF)屬血 小板源性生長因子家族的生長因子，刺激血管內皮細胞的有絲分裂和血管的新生。血管內 皮生長因子受體(VEGFR)在肺癌的發生、發展及預后方面起重要作用。大量研究結果表明 VEGF在許多癌癥組織中過量表達，包括肝癌、肺癌、乳腺癌等等。VEGF及其受體在腫瘤的生 長和轉移中起關鍵性作用，所以可以通過阻斷或干擾VEGF/VEGFR信號通路來控制腫瘤生 長。以VEGF/VEGFR為靶標的抗腫瘤藥物與傳統的腫瘤治療藥物相比有很大的優勢。在正常 的生理條件下，人血管生成只在創傷愈合和月經周期等生理活動中起作用，所以使用抗血 管生成藥物治療腫瘤，對人體毒性作用小;腫瘤的生長和迀移依賴于大量新生血管的生成， 以VEGF/VEGFR為靶點可以達到廣譜的抗腫瘤效果；與腫瘤細胞不同，血管內皮細胞具有遺 傳穩定性，所以被認為是理想的治療靶點，不易產生對血管生成藥物的抗性;而且內皮細胞 與血液直接接觸使藥物更加容易到達血管內皮細胞。貝伐珠單抗(Bevacizumab，Avastin) 是針對VEGF的單克隆抗體，是抗血管生成治療的代表藥物之一。貝伐單抗是重組的人源化 單克隆抗體，包含了人源抗體的結構區和可結合VEGF的鼠源單抗的互補決定區。通過體內、 體外檢測系統證實IgGl抗體能與人血管內皮生長因子(VEGF)結合并阻斷其生物活性。2004 年2月26日獲得Π )Α的批準，是美國第一個獲得批準上市的抑制腫瘤血管生成的藥。目前該 藥在大腸癌、肺小細胞癌、乳腺癌等腫瘤中取得了比較好的療效。
[0005] 由于VEGF可與細胞外基質結合并儲存起來，這樣使不同組織、時間的VEGF濃度不 一，中和VEGF比較困難。相反，VEGFR的數量有限且易被飽和，一些研究者認為抑制VEGFR比 阻斷VEGF能更有效地抑制VEGF信號傳到途徑。美國ImCl one公司研發了人緣化的抗VEGFR-2 的抗體MC-1C11，它能特異的與VEGFR-2結合。頂C-1C11在體外能抑制人上皮細胞的迀移與 增殖，在多種小鼠腫瘤實驗中表現出了顯著抑制血管生成的能力。ImClone公司還開發了另 一種抗VEGFR-2抗體的頂C-l 121B，它是完全人緣化的單克隆抗體，也能抑制VEGF對VEGFR-2 的激活，現已進入實體腫瘤的I期臨床試驗。
[0006] 盡管VEGF/VEGFR的靶向藥物能抑制腫瘤的生長和轉移，延長患者生命，但效果有 限。臨床試驗療效差可能還與治療腫瘤的時期選擇有關，抗血管生成藥物比較適合早期腫 瘤患者。晚期腫瘤血管不豐富，處于嚴重缺氧狀態，并有大量的壞死區域，這使得晚期腫瘤 依賴血管生成的程度低。此外，在抗體治療過程中還有許多不良反應如血壓升高、血栓形 成、出血、蛋白尿和胃腸穿孔等。在使用VEGF/VEGFR做為藥靶的抗腫瘤治療中，還易產生對 藥物的抗性。因此，有必要針對VEGF/VEGFR設計開發新的藥物。
[0007] 研究顯示，腫瘤特異性殺傷性T淋巴細胞(Cytolytic T lymph〇Cyte，CTL)在清除 腫瘤中起著至關重要的作用。大部分腫瘤患者T細胞反應低下，如何激活CTL免疫反應成為 焦點。而CTL表位在CTL活化過程中扮演著關鍵角色，是誘導特異性CTL克隆性增殖、分化和 發揮效應的最重要的激發因素，在機體免疫中發揮著重要的作用。
[0008] 熱休克蛋白（Heat shock protein,HSP)廣泛存在于各種生命體及各種細胞的亞 細胞結構中。熱休克蛋白作為分子伴侶在蛋白質的加工折疊過程中起著至關重要的作用， 比如防止蛋白聚集，誘導蛋白聚集體的溶解，幫助多肽的早期折疊，參與蛋白損傷的修復以 及損傷蛋白的降解等。根據分子量的大小，熱休克蛋白可以分為HSP 100、HSP90、HSP70、 HSP60、Calreticulin、HSP47、HSP40、Small HSPs(sHSPs)等家族。gp96(GRP94)為內質網 HSP90家族的代表，與細胞質HSP90高度同源。gp96能夠通過促進樹突狀細胞的成熟而增強 其抗原遞呈的能力，從而提高獲得性免疫應答的水平。其次，gp96通過抗原遞呈細胞上的受 體進入細胞內，將自身所攜帶的抗原肽交叉呈遞給MHC I類分子，激活CTL發揮細胞殺傷作 用。此外，gp96能有效激發天然免疫。gp96是來源于哺乳動物細胞的天然佐劑，可作用于APC 及T細胞等其它免疫細胞，促進DC成熟，刺激細胞產生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，從而增 強機體天然免疫反應。gp96作為強大的抗原遞呈"機器"能夠結合細胞內多種抗原肽，并將 其遞呈給T細胞，從而刺激機體產生強大的細胞免疫，殺死腫瘤細胞。已有實驗證實，從腫瘤 中獲得的gp96-抗原肽復合物能夠有效地刺激機體產生抗腫瘤免疫應答。由于胎盤中含有 大量的癌胚抗原，將胎盤中的gp96純化分離后免疫C57BL/6小鼠，也能取得良好的預防和治 療效果。
[0009]由于組織來源有限，從組織提取的熱休克蛋白gp96蛋白產量有限，難以工業化應 用，而且組織提取的gp96蛋白結合組織細胞內的抗原多肽，影響其與外源多肽的結合，從而 影響疫苗的療效。此外，受倫理道德因素的制約，從組織提取的gp96難以直接作為藥物推 廣。
【發明內容】
[0010] 本發明所要解決的技術問題是提供一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽以 及其在腫瘤治療中的應用。
[0011] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0012] 一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽，該多肽具有SEQ ID N0.3所示的氨基 酸序列;或
[0013] 該多肽具有在SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列基礎上取代、缺失、置換、插入和/或 添加一個至幾個氨基酸之后形成的衍生序列。
[0014]衍生序列與血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽相關。
[0015]得到的衍生序列的功能與SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的功能相近或一致，所 述功能主要指結合HLA-A2分子的能力、刺激特異性T細胞產生、抗腫瘤生長的能力等。
[0016] 對于衍生序列，如果在SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的基礎上增加或減少一個 氨基酸，得到的序列仍然不影響原多肽序列的功能，那么該衍生序列也在本發明的保護范 圍內。
[0017] 當某位(該多肽的第二位和最后一位除外）的氨基酸被其他同性質的氨基酸取代 后，例如親水氨基酸被親水氨基酸取代，疏水氨基酸被疏水氨基酸取代，得到的取代后的序 列仍然具有原多肽序列的功能，那么衍生后的氨基酸也在本發明的保護范圍內。
[0018] 在SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的基礎上，出于某種目的的需要（例如：為了便 于純化、表達、標記等操作)常常會添加一些標簽序列或限制性酶切位點以及保護堿基等。 所述標簽序列、限制性酶切位點以及保護堿基等均可以根據具體的使用情況進行具體選 擇，并無特殊限制。
[0019] 本發明所述的血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽具有水溶性好、與HLA-A2分 子結合能力強等優點。
[0020] 經試驗驗證，本發明所述的人表皮生長因子受體的CTL表位多肽的溶解度(溶劑可 以為任何水溶液，純水，生理鹽水或磷酸鹽緩沖液)可以至少達到20mg/mL，且不需要用有機 溶劑溶解。
[0021] 多肽在做為臨床藥物時，為保證具有足夠的效果，需要具備一定的溶解性，但現有 的多肽具有水溶性不好的問題，只能將多肽溶于極性溶劑(例如：油類化合物、乙醇等）。在 臨床藥物進行主管部門審批時，受極性溶劑的影響，審批周期長甚至不能通過審批，影響 多肽類藥物的進一步應用。一般情況，為了避免上述缺陷，通常采用多肽修飾的方法來改善 多肽的水溶性，但是存在實驗周期長、效果不理想等問題。
[0022] 本發明提供的人表皮生長因子受體的CTL表位多肽具有很好的水溶性，應用前景 好。
[0023]優選地，所述血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽為SEQ ID N0.3所示的氨基酸 序列。
[0024]本發明提供一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽的編碼基因，編碼上述的 血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽。
[0025] 本發明還提供一種重組載體，所述重組載體克隆、分泌和/或表達上述的血管內皮 生長因子受體的CTL表位多肽。
[0026] 所述重組載體可以根據實際的實際的需要選擇與蛋白表達或復制的調控元件或 者其他元件，例如：啟動子、終止子、多克隆位點、RBS序列、抗性基因以及其他具有生理性功
[0027] 本發明還提供一種轉化體，包括上述的重組載體。
[0028] 所述重組載體可以獨立復制也可以整合到細菌的染色體DNA中，隨染色體DNA的復 制而復制。
[0029] 例如，在本發明的一個實施例中，所述的轉化子為含有上述的重組載體的細胞。
[0030] 通過上述的重組載體以及轉化體，可以在體外表達多肽。
[0031] 本發明提供一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽在腫瘤治療中的應用。尤 其，適用于肺癌的治療。
[0032] 本發明提供一種疫苗，包括上述的血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽和佐劑。
[0033] 本發明所述血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽作為疫苗的活性組分，用于腫 瘤的治療中，具有水溶性強、治療效果好等優點。
[0034]進一步，所述佐劑包括gp96蛋白。
[0035]采用上述進一步方案的有益效果是:通過gp96蛋白與人表皮生長因子受體的CTL 表位多肽的聯合使用，具有抑制腫瘤生長的效果。
[0036] 進一步，所述gp96蛋白為采用昆蟲細胞表達系統表達分泌型的gp96蛋白。
[0037]采用上述進一步方案的有益效果是：
[0038]發明人在研究中，進行對于表達系統的選擇進行了篩選，例如:大腸表達系統和酵 母表達系統等。最終意外的發現了采用昆蟲細胞表達系統表達分泌型的gp96蛋白最合適。 [0039]發明采用昆蟲細胞表達系統表達分泌型的gp96蛋白，表達系統穩定，gp96蛋白的 表達量高，蛋白糖基化更接近于哺乳動物細胞，蛋白穩定，且從細胞上清中提取，純化簡單。 昆蟲細胞分泌表達的熱休克蛋白gp96不結合抗原多肽，因此可以更好地與外源多肽結合， 從而增強了其免疫學功能。
[0040] 進一步，所述gP96蛋白通過昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細胞分泌表達。
[0041] 采用上述進一步方案的有益效果是:采用昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細胞分泌表達 具有效率尚、易提純、活性好且安全性尚等優點。
[0042]進一步，所述gp96蛋白和血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽的質量比為1: (0.5-10)。優選地，所述p96蛋白和血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽的質量比為1: 2.5〇
[0043] 采用上述進一步方案的有益效果是：
[0044] 質量比設置為1:(0.5-10)有利于刺激特異性CTL產生，產生更好的抑制腫瘤的效 果，如果比例過高，容易導致抑制機體的免疫系統，產生免疫耐受問題，如果比例過低容易 導致沒有效果問題;發明人在研究中發現，當比例設置為1:2.5時，刺激特異性CTL產生的效 果更好。
[0045] 進一步，所述gp96蛋白包括SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列和/或所述gp96蛋白 的編碼基因包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
[0046]所述的gp96蛋白可以參照SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列進行人工合成或者從 已有的生物材料中進行擴增。
[0047]本發明提供一種gp96蛋白的制備方法，包括以下步驟：利用昆蟲細胞分泌表達 gp96蛋白，昆蟲細胞培養上清依次進行HiTrap Q HP陰離子交換柱和Superdex 200 10/300 GL分子篩層析得到的。
[0048] 采用上述進一步方案的有益效果是：純化簡便，特異性強，可以精確控制條件，并 可用于規模化工業生產，在保證蛋白純度的前提下，既節約了時間，又減少了蛋白的丟失。
[0049] 進一步，包括以下具體步驟：
[0050] 1)利用昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細胞分泌表達gp96蛋白：構建含有gp96蛋白的表 達載體和轉化子;所述轉化子為轉染有gp96蛋白的表達載體的細胞；
[0051 ] 2)將桿狀病毒侵染轉化子后，進行懸浮培養，培養溫度為27 °C，培養時的轉速為 100-120rpm/min，培養結束后，收集上清液；
[0052] 3)將上清液進行HiTrap-Q Sepharose離子交換層析，具體包括如下步驟：
[0053] (a)將步驟2)得到的上清液上樣于層析柱，流速為lmL/min;
[0054] (b)用5mL PBS緩沖液洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lmL/min，所述PBS緩沖液含有 20〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口!1為7.5;
[0055] (c)用10mL的PBS緩沖液洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lmL/min;所述roS緩沖液含 有30〇111]\1他(：1，？85緩沖液的口!1為7.5;
[0056] (d)用3mL的PBS緩沖液洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lmL/min，得到的洗脫液即為 含有gp96蛋白的提取物;所述PBS緩沖液含有600mM NaCl，PBS緩沖液的pH為7.5;
[0057] 4)將洗脫液進行Superdex 200 10/300 GL分子篩層析，具體包括如下步驟：
[0058] (a)將HiTrap-Q Sepharose離子交換層析所得gp96蛋白提取物通過50Kd超濾管濃 縮，用pH為7.5的PBS換液，濃縮終體積為lmL的濃縮液；
[0059] (b)通過上樣環將步驟(a)的濃縮液(含有gp96蛋白的1M1 PBS溶液）上樣于層析 柱，流速為〇. 25mL/min;
[0060] (C)用PBS緩沖液洗滌層析柱，流速為0 · 25mL/min，收取gp96蛋白；將收集的gp96蛋 白用pH為7.5的PBS緩沖液換液，濃縮，測定gp96蛋白濃度后分裝、於存。
[0061 ]采用上述進一步方案的有益效果是：
[0062] 步驟3)中步驟(b)中200mM NaCl可以將部分雜蛋白洗脫，提高gp96蛋白的純度； [0063] 步驟3)中步驟(c)中300mM NaCl既可以將雜蛋白洗脫，又能保證gp96仍然結合在 尚子柱上，有利于提尚gp96蛋白的純度和廣量；
[0064] 步驟3)中步驟(d)中600mM NaCl既可以將gp96蛋白完全洗脫，又能避免過高的鹽 濃度混入雜蛋白，有利于提尚gp96蛋白的純度和廣量；
[0065]步驟4)中步驟分子層析柱的使用可以提高gp96蛋白的純度。
【附圖說明】
[0066]圖1為多肽與T2細胞表面的HLA-A2分子結合能力的實驗結果。
[0067]圖2為多肽與HLA-A2分子以及β2πι分子構成復合物的體外重折疊(refolding)的實 驗結果。
[0068]圖3為多肽免疫HLA_2.1/Kb轉基因小鼠，其脾細胞中多肽特異性CTL免疫反應的 ELISP0T檢測結果。
[0069]圖4裸鼠接種肺癌患者原位腫瘤組織，轉輸經多肽免疫的HLA-2.1/Kb轉基因小鼠 的脾臟淋巴細胞后，與對照組相比，其腫瘤的生長情況。肺癌患者血液細胞HLA限制性經流 式細胞儀檢測為HLA-2陽性。
【具體實施方式】
[0070] 以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并 非用于限定本發明的范圍。
[0071] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試 驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗， 均設置三次重復實驗，結果取平均值。ATCC即美國模式培養物集存庫（American type culture collection)的簡寫，網址 http: //www.atcc.org/〇
[0072] PBS緩沖液：8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na2HP〇4 · 12H20、0.24g KH2PO4,加水至1L， 調pH7.4。
[0073] 通過在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Protein數 據庫中搜索人血管內皮生長因子受體蛋白的氨基酸序列(Accession:AAI31823.1)，如序列 表的SEQ ID NO. 1所示，以此作為合成VEGFR211-219多肽片段的序列來源。其核酸序列如序 列表的SEQ ID N0.2所示。
[0074] 實施例1、制備VEGFR衍生的九肽
[0075] 該衍生九肽為VEGFR211-219多肽片段，其氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，由氮末 端至碳末端方向的氨基酸序列為:Ser lie Met Tyr lie Val Val Val Val。
[0076] VEGFR211-219多肽片段由吉爾生化(上海)有限公司合成。
[0077]對照多肽：乙肝病毒HBC82-90肽來源于乙肝病毒核心蛋白，非腫瘤抗原，其氨基酸 序列如SEQ ID N0.4所示，由氮末端至碳末端方向的氨基酸序列為:Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn〇
[0078] 實施例2、實驗驗證VEGFR211-219多肽片段與HLA-A2分子的結合力
[0079]分別通過T2細胞結合實驗和體外重折疊實驗來檢測VEGFR211-219多肽片段與 HLA-A2分子的結合力。
[0080] -、T2細胞結合實驗檢測多肽與細胞表面的HLA-A2分子的結合能力
[0081 ] T2細胞表面表達HLA-A0201 (HLA-A0201也可以稱作HLA-A*0201，是HLA-A2分子的 一個分支），但其TAP基因缺陷，所以該細胞不能加工呈遞內源性的多肽，故其細胞表面的 HLA-A0201分子處于不穩定且低表達的狀態。當有HLA-A0201分子可結合的外源性抗原多肽 存在時，這些多肽與T2細胞表面的HLA-A0201分子結合，會大大增加其細胞表面的HLA-A0201穩定性，很大程度上提高細胞表達HLA-A0201強度，通過熒光標記的MHC抗體標記和流 式檢測即可鑒定，采用FI (fluorescence index，FI)值來說明多肽的結合力強弱。FI =(待 測多肽的平均熒光強度-不加多肽的平均熒光強度)/不加多肽的平均熒光強度，若FI 2 1， 則被認為是與HLA-A0201分子結合力高的多肽。具體操作步驟如下：
[0082] 取生長良好的細胞(來自ATCG?CRL-1992?)，用無血清的培養基洗1-2次，再用少 量無血清培養基懸起，細胞計數，接種到96孔板中，每個孔中接種2 X 105個細胞，加入終濃 度為100yg/mL待測多肽，lyg/mL人fen蛋白（購自sigma)，每個孔的體系為100yL，37°C培養 16-18小時。
[0083] 收集96孔板中的細胞，用PBS緩沖液洗1-2次，用HLA-A2特異性抗體BB7.2-FITC(購 自abeam公司，貨號為ab27728)標記細胞，4°C條件下反應30min。收集標記后的細胞，用PBS 緩沖液洗2次，用流式細胞儀測定樣品的熒光強度。用FI值來評判待測多肽的結合力強弱。 [0084] 上述中，實驗組加入的多肽為VEGFR211-219多肽片段;對照組加入的多肽為乙肝 病毒HBc82-90肽。
[0085] 實驗結果如圖1所示，實驗組(VEGFR211-219多肽片段）的熒光強度明顯比對照（乙 肝病毒HBc82-90肽）的熒光強度要強。VEGFR211-219多肽片段與對照組的FI值分別為10.5 與55.3，說明VEGFR211-219多肽片段與HLA-A2分子有很好的結合力，說明具有很好的免疫 學功能。
[0086] 二、體外重折疊(refolding)實驗檢測多肽與HLA-A0201分子的結合能力
[0087] 在refolding實驗中，如果多肽能與HLA-A0201分子結合，那么多肽、HLA-A0201以 及β2微球蛋白（&m)就能形成穩定的多肽-HLA-i32m三元復合物，在分子篩層析圖譜中出現多 肽-HLA-fem復合物蛋白峰。HLA-A2分子由重鏈和輕鏈組成，重鏈的編碼序列如SEQ ID N0.5 所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。輕鏈的編碼序列如SEQ ID NO.7所示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.8所示。
[0088] 1、構建HLA-A0201重鏈胞外區質粒
[0089] 將編碼HLA-A0201 重鏈胞外區的DNA(GENBANK ACCESSION N0.AY365426 自 5'末端 第73-897位核苷酸)導入pET-28a質粒，得到重鏈重組質粒，命名為HLA-A$0201-HC質粒。
[0090] 2、構建人表達質粒
[0091] 將編碼人β2Π?的DNA(GENBANK ACCESS ΙΟΝ Ν0·ΝΜ_004048自5'末端第 121-417位核 苷酸導入pET-28a質粒，得到輕鏈重組質粒，命名為質粒。
[0092] 3、原核提取HLA重鏈和輕鏈蛋白
[0093] 包涵體清洗液（washing buffer): 0 · 5 % (體積分數）Triton-100，50mM Tris pH 8.0,300mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT;
[0094] 包涵體重懸液（resuspension buffer): 50mM Tris pH 8 · 0，lOOmM NaCl，lOmM EDTA,l〇mM DTT；
[0095] 包涵體溶解液（dissolution Buffer): 6M Gua-HCl (或8M尿素），10 % (體積分數） 甘油，50mM Tris ρΗ8·0,100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT;
[0096] 復性液（refolding buffer): lOOmM Tris pH8·0，400mM L_Arg HC1，2mM EDTA， 5mM GSH(還原性谷胱甘肽，溶液預冷后加入），0.5mM GSSG(氧化性谷胱甘肽，溶液預冷后加 入），0.5mM PMSF〇
[0097] LB培養基:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加水定容至1L。
[0098] (1)將HLA-A0201-HC質粒與β2πι包涵體表達質粒分別轉入BL21(DE3)感受態細胞中 (購自天根生化科技公司，產品號CB10 5-0 2 )，從平板上挑取單克隆菌落接種到5mL的LB培養 基中，該LB培養基含100mg/mL氨芐霉素；，小量活化，培養10-12h。然后按照1 % (體積比）的 接種量接種到2L LB培養基中大量培養(溫度為37°C，轉速為200rpm)，培養至0D = 0.4-0.6， 在無菌條件下加入IPTG(終濃度為lmM)，37°C誘導4-6小時，收集菌體（4°C，7000rpm， lOmin)〇
[0099] (2)用PBS緩沖液將菌體重懸，在冰浴條件下進行超聲破碎（超聲6s，間隔12s，99 次，250W，多個循環），直至菌體懸液透明。收集超聲后的菌液（4°C條件下，12000rpm離心 20min)。沉淀中呈白色致密塊即為包涵體。
[0100] (3)用玻璃棒將包涵體上的菌體殘渣刮去，用washing buffer將包涵體懸起，用超 聲裂解方法進一步純化蛋白（超聲4s，間隙10s，40次，250w)，離心，收集沉淀（4°C條件下 12000rpm離心20min)。此步驟重復三次。再用resuspension buffer將包涵體沉淀懸起，并 超聲裂解一次，離心收集包涵體(4°C，12000rpm，20min)。注:每次超聲裂解離心過后，都需 要用玻璃棒將表面的菌體殘渣盡量刮去。
[0101] (4)離心收集的包涵體，將上清除去，倒置控干，稱重，按30mg的包涵體加入lmL dissolution buffer的比例加入dissolution buffer溶解，4°C攪拌溶解過夜。離心收集上 清(4°C條件下12000rpm離心20min)，將上清分裝后-20°C凍存。
[0102] 通過上述方法，分別獲得了 包涵體蛋白和重鏈包涵體蛋白。
[0103] 4、包涵體體外復性
[0104] (1)按配方配制refolding buffer(還原性谷胱甘肽及氧化性谷胱甘肽一定要溶 液預冷后再加入），將裝有refolding buffer的燒杯放置在磁力攪拌器上，轉子的攪拌速度 為Is轉子轉一圈較好。用lmL注射器的針頭替換5mL或10mL注射器的針頭，將替換組合后的 注射器固定在燒杯上，在注射器中加入溶解好的包涵體，使其能一滴一滴地慢速滴入 refolding buffer中。按最先輕鏈包涵體蛋白，其次多肽，再次重鏈包涵體蛋白的順序 加入，以重鏈包涵體蛋白：輕鏈β2Π?包涵體蛋白：多肽=1:1:3的摩爾比加入。重鏈包涵體蛋 白最好分3次加入，每次加入的時間間隔8-10h，多肽可以溶解在100-200微升二甲亞砜中一 次性注入。
[0105] 上述中，實驗組加入的多肽為VEGFR211-219多肽片段;對照組加入的多肽為乙肝 病毒HBc82-90肽。
[0106] (2)將復性結束后的復性液用濃縮杯進行濃縮，在加入濃縮杯之前12000rpm，4°C 離心20min，盡量去除沉淀以減小沉淀堵住濃縮膜的可能性，并換液到分子篩緩沖液(含有 20mM Tris，50mM NaCl，pH8.0)，當溶液體積最終小于50mL之后換到濃縮管繼續濃縮至5mL 以內，12000rpm，4°C條件下離心10min后取上清準備上樣。將準備好的復性濃縮液注入AKTA FPLC，根據Hiload 16/60 superdex 200(GE公司，貨號為17-1139-01)分子篩層析的結果檢 測復性效果。分子篩層析過程中，收集各個蛋白峰的樣品，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒 定。
[0107] 復性結果由圖2所示，VEGFR211-219多肽片段在目標位置10-15mL處出現了明顯 的復合物蛋白峰，而對照組的多肽則沒有蛋白復合物峰，說明VEGFR211-219多肽片段與 HLA-A0201分子具有多肽結合力。
[0108]通過T2細胞結合實驗和體外重折疊實驗，可以看出本發明所述的VEGFR211-219多 肽片段與HLA-A2分子具有很好的多肽結合力。
[0109]實施例3、昆蟲桿狀病毒表達系統表達熱休克蛋白gp96
[0110]實施例中，
[0111] pFastBacTM 1空載質粒購自普如汀生物技術（北京）有限公司，產品號 BioVectorl058 19-1〇
[0112] DHlOBac? E.coli(簡寫為DHlOBac)購自北京原平皓生物技術有限公司，產品號 CL108-01。
[0113] HiTrap-Q Sepharose:層析柱為HiTrap Q HP，購自GE公司，產品號 17-1153-01，層 析柱的內徑和柱長是0 · 7 X 2 · 5cm。
[0114] Superdex 200 10/300 GL:層析柱為Superdex 200 10/300 GL，購自GE公司，產品 號17-5175-01，層析柱的內徑和柱長是1.0 X 3.0cm。
[0115] 一、構建pFastBac? l_gp96質粒
[0116] l、gp96引物的設計與合成：以GenBank中人gp96基因的序列為模板，序列號為NM_ 003299,其基因序列如SEQ ID NO.9所示，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。在gp96 基因5 '端加入EcoRI酶切位點，3 '端加入Xba頂每切位點。用于PCR擴增的正向引物序列為： 5' -GGAATTCATGGGCAGCAGCCATCAT-3' ；反向引物序列為：5' -GCTCTAGACTATTACAATTCATCTTTT TC-3'，委托上海生工生物工程技術服務公司合成該引物，測序驗證引物的序列正確無誤。
[0117] 2、提取人肺癌細胞 A549(ATC〇Number:CCL-185?)的總 mRNA，反轉錄合成 cDNA。
[0118] 3、以步驟1的cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的基因。
[0119] 4、用EcoRI和Xbal雙酶切gp96的PCR產物，回收酶切產物。
[0120] 5、用EcoRI和Xbal雙酶切pFastBac? 1空載質粒，回收酶切產物。
[0121 ] 6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到連接產物。
[0122] 7、將連接產物轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞(購自北京原平皓生物技術有限 公司，產品號CL108-01)，通過挑取單克隆獲得重組大腸桿菌的質粒。用PCR驗證陽性克隆， 用于PCR驗證的pUC/M13正向引物序列為:5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'，反向引物序列 為:5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ' 1CR產生了 一個含有目的序列的4.7-5kb擴增子隨后 對其進行測序。測序結果驗證正確的為陽性重組質粒。該陽性重組質粒是能表達桿狀病毒 的質粒，在由DHlOBac自身含有的的輔助質粒的幫助下發生重組，重組后的質粒可以同時表 達桿狀病毒和目的蛋白，通過觀察病毒侵染情況可以部分反應目的蛋白的表達情況。
[0123] 二、利用昆蟲細胞表達gp96重組蛋白
[0124] 提取陽性重組質粒，利用Cellfectin II reagent(Life techno logies,貨號： 10362-100)將陽性重組質粒轉染到Sf9細胞中（Sf9細胞購自普如汀生物技術(北京)有限公 司，產品號NTCC411123)。將轉染陽性質粒的Sf9細胞培養72h，通過細胞病變情況表明含有 重組的一代桿狀病毒(命名為P1毒）已經釋放到培養基中，收取細胞上清獲得P1毒。加適量 P1毒到Sf9單層細胞中，控制細胞濃度達至IjlXlO6細胞/mL，加入的P1量(mL)=M0I(pfu/ cell) Xnumber of cells/titer of viral stock(pfu/mL),^ψΜΟΙ(multiplicity of infection)取0.05-0. l，titer of PI viral stock取lxl06-lxl07pfu/mL，之后在27°C條件 下培養72h，4000rpm離心5mi n，收取上清獲得二代毒(命名為P2毒）。將適量P2毒加到lOOmL Sf9的懸浮細胞中，控制細胞濃度達到1.6 X 106細胞/mL，27°C條件下100-120 rpm培養72h， 擴增獲得三代毒(命名為P3毒）。將P3毒進行western blotting雜交，結果表明蛋白已經在 Sf9細胞中表達。
[0125] 隨后，在新鮮的Sf 9細胞（1.5 X 106細胞/mL，300mL)中加入適量P3毒，27 °C條件下 100_120rpm，在Insect-XPRESS?Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine 培養基(Catalog N〇:12-730Q)中進行懸浮培養。感染72小時后，將懸浮液7000rpm離心20分 鐘得到清澈的上清液，經過〇.22mm濾膜濾過后，經過Hi Trap Q HP柱，Superdex 200 10/300 GL離子柱純化后得到較純的gp96。蛋白經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。將上述收集的穿 透用PBS緩沖液換液，濃縮，采用BCA法測定蛋白濃度，最后將蛋白分裝，貯存于-80°C。
[0126] 上述中，經過HiTrap Q HP柱，Superdex 200 10/300 GL離子柱純化的具體方法 為：
[0127] 1)將感染72小時后得到的上清液進行HiTrap-QSepharose離子交換層析，具體包 括如下步驟：
[0128] (a)將上清液上樣于層析柱，流速為lmL/min;
[0129] (b)用5mL PBS緩沖液洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lmL/min，所述PBS緩沖液含有 20〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口!1為7.5;
[0130] (c)用10mL的PBS緩沖液洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lmL/min;所述roS緩沖液含 有30〇111]\1他(：1，？85緩沖液的口!1為7.5;
[0131] (d)用3mL的PBS緩沖液洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lmL/min，得到的洗脫液即為 含有gp96蛋白的提取物;所述PBS緩沖液含有600mM NaCl，PBS緩沖液的pH為7.5;
[0132] 2)將洗脫液進行Superdex 200 10/300 GL分子篩層析，具體包括如下步驟：
[0133] (a)將HiTrap-Q Sepharose離子交換層析所得gp96蛋白提取物通過50Kd超濾管 濃縮，用pH為7.5的PBS換液，濃縮終體積為lmL的濃縮液，所述濃縮液含有gp96蛋白；
[0134] (b)通過上樣環將步驟(a)的濃縮液上樣于層析柱，流速為0.25mL/min;
[0135] (c)用PBS緩沖液洗滌層析柱，流速為0 · 25mL/min，收取gp96蛋白；將收集的gp96蛋 白用pH為7.5的PBS緩沖液換液，濃縮，測定gp96蛋白濃度后分裝、於存。
[0136] 實施例4、多肽刺激HLA-2. Ι/Kb轉基因鼠特異性CTL的產生
[0137] 利用實施例3中制備得到的昆蟲細胞表達的gp96蛋白進行動物免疫。
[0138] 實施例中用于動物免疫的多肽均購自吉爾生化（上海)有限公司，純度為95%以 上。
[0139] 上述中，實驗組加入的多肽為VEGFR211-219多肽片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示;對照組加入的多肽為乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0140] 一、分組免疫
[0141 ] HLA-A2 · Ι/Kb轉基因小鼠（購自Jackson laboratory)進行分組，每組10只，分別免 疫。
[0142] 第一次免疫多肽VEGFR211-219多肽片段(50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）；第 二次免疫多肽VEGFR211-219多肽片段(50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）；第三次免疫多 肽VEGFR211-219多肽片段（50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）。對照組免疫相同劑量的 gp96和乙肝病毒HBc82-90妝。
[0143] 進行蛋白免疫前，將用于免疫的gp96蛋白在組裝體系中進行組裝。組裝體系的溶 劑為水，溶質及其濃度如下:NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH2P〇4〇.24g/L，Na2HP〇4· 12H203.63g/ L;組裝條件為55 °C反應lOmin，之后室溫放置30分鐘。免疫方式為皮下注射，第一次免疫時 間為實驗第一周、第二次免疫時間為實驗第三周、第三次免疫時間為實驗第四周。
[0144] 二、免疫相關因子的分析
[0145] 取小鼠脾細胞進行ELISP0T分析。（ELISP0T檢測試劑盒購自BD公司，產品號 551083,操作方法見試劑盒產商說明書），實驗結果見圖3。與對照多肽幾乎沒有特異性IFN-γ分泌相比，實驗多肽組能引起很強的特異性IFN- γ分泌，說明VEGFR211 -219多肽可以在 小鼠體內激起較強的特異性Τ細胞免疫反應，有利于特異性殺傷腫瘤細胞。
[0146] 實施例5、多肽免疫的抗腫瘤效果
[0147]對10例肺癌患者進行鑒定。取病人血液并通過ΒΒ7.2單克隆抗體(購自Abeam，貨號 為ab27728)染色，流式檢測，分析其細胞表面HLA-A2分子的表達。選擇HLA-A2分子陽性表達 的患者進行追蹤。待患者術后，取部分腫瘤組織做石蠟切片，通過免疫組化檢測其VEGFR表 達水平。對VEGFR強陽性的患者腫瘤組織進行裸鼠移植實驗。
[0148] 本實施例中用于動物免疫的gp96是實施例3中制備得到的gp96蛋白。實施例中用 于動物免疫的多肽均購自吉爾生化(上海)有限公司，純度為95%以上，實驗組加入的多肽 為VEGFR211-219多肽片段，其氨基酸序列如SEQIDN0.3所示;對照組加入的多肽為乙肝病 毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。本實施例中用于轉輸的脾臟淋巴細胞來 源于實施例4中免疫后的小鼠。
[0149] 一、人腫瘤組織裸鼠移植
[0150] 取新鮮腫瘤組織置于無菌平皿內（平皿內放置少許生理鹽水或細胞培養液），將腫 瘤組織剪成2-3mm的小塊，接種于健康裸鼠前腋窩皮下。待移植的腫瘤生長至100-200mm 3 時，挑選腫瘤生長均勻的小鼠平均分成兩組，每組10只，轉輸脾臟淋巴細胞。
[0151]二、免疫小鼠脾臟淋巴細胞的分離
[0152] 無菌環境中取脾臟，將脾臟放于200目篩網上，在10mL無血清1640培養基中用玻璃 研磨棒研磨，將液體轉移到15mL離心管中，lOOOrpm離心10分鐘；棄上清，加入3mL紅細胞裂 解液于室溫裂解2-3分鐘，加入lOmLPBS終止反應，顛倒混勻，1500rpm離心10min;棄上清，用 10mL無血清1640培養基（購自Gibco，貨號為22400105)洗兩遍，lOOOrpm離心10分鐘；棄上 清，用5mL含10 % FBS (購自Hy c 1 one)的1640重懸，稀釋10倍計數。
[0153] 三、淋巴細胞轉輸
[0154] 分別將細胞計數，并用PBS緩沖液清洗一遍，并用PBS按lxl07/200yL濃度重懸；將 200μ1的細胞懸液慢速尾靜脈注射至移植腫瘤的裸鼠體內。
[0155] 四、抗腫瘤效果評價
[0156] 自初次轉輸開始，每隔三天測量一次小鼠腫瘤大小，腫瘤大小按照0.5 X長X寬X 寬算。
[0157] 實驗組與對照組之間的比較結果見圖4，與對照組相比，轉輸VEGFR211-219免疫小 鼠淋巴細胞的裸鼠腫瘤在轉輸一周后開始下降，第3周時，實驗組與對照組腫瘤大小對比如 下，實驗組VS對照組=236±23 VS464±37，Ρ<0.01。說明VEGFR211-219多肽具有顯著的抗 腫瘤能力。
[0158] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
[0159]
[0160]
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[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
【主權項】
1. 一種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽，其特征在于，該多肽具有SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列;或 該多肽具有在SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列基礎上取代、缺失、置換、插入和/或添加 一個至幾個氨基酸之后形成的衍生序列。2. -種血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽的編碼基因，其特征在于，編碼權利要求 1所述的血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽。3. -種重組載體，其特征在于，所述重組載體克隆、分泌和/或表達權利要求1所述的血 管內皮生長因子受體的CTL表位多肽。4. 一種轉化體，其特征在于，包括權利要求3所述的重組載體。5. -種權利要求1所述血管內皮生長因子受體的CTL表位多肽在腫瘤治療中的應用。6. -種疫苗，其特征在于，包括權利要求1所述的血管內皮生長因子受體的CTL表位多 肽和佐劑。7. 根據權利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述佐劑包括gp96蛋白。8. 根據權利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白為采用昆蟲細胞表達系統表 達分泌型的gp96蛋白。9. 根據權利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白通過昆蟲桿狀病毒感染的昆 蟲細胞分泌表達。10. 根據權利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白和血管內皮生長因子受體 的CTL表位多肽的質量比為1:(0.5-10)。11. 根據權利要求7-10任一項所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白包括SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列和/或所述gp96蛋白的編碼基因包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序 列。12. -種權利要求7-11任一項所述gp96蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 利用昆蟲細胞分泌表達gp96蛋白，昆蟲細胞培養上清依次進行HiTrap Q HP陰離子交換柱 和Superdex 200 10/300 GL分子篩層析得到的。13. 根據權利要求12所述一種gp96蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟： 1) 利用昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細胞分泌表達gp96蛋白：構建含有gp96蛋白的表達載 體和轉化子;所述轉化子為轉染有gp96蛋白的表達載體的細胞； 2) 將桿狀病毒侵染轉化子后，進行懸浮培養，培養溫度為27°C，培養時的轉速為100-120rpm/min，培養結束后，收集上清液； 3) 將上清液進行HiTrap-Q Sepharose離子交換層析，具體包括如下步驟： (a) 將步驟2)得到的上清液上樣于層析柱，流速為lmL/min; (b) 用5mL PBS緩沖液洗滌步驟（a)的層析柱，流速為lmL/min，所述PBS緩沖液含有 20〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口!1為7.5 ; (c) 用IOmL的PBS緩沖液洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lmL/min;所述PBS緩沖液含有 30〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口!1為7.5 ; (d) 用3mL的PBS緩沖液洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lmL/min，得到的洗脫液即為含有 gp96蛋白的提取物;所述PBS緩沖液含有600mMNaCl，PBS緩沖液的pH為7.5; 4) 將洗脫液進行Superdex 200 10/300GL分子篩層析，具體包括如下步驟： (a) 將HiTrap-Q Sepharose離子交換層析所得gp96蛋白提取物通過50Kd超濾管濃縮， 用pH為7.5的PBS換液，濃縮為終體積為ImL的濃縮液，所述濃縮液中含有gp96蛋白； (b) 通過上樣環將步驟(a)的濃縮液上樣于層析柱，流速為0.25mL/min; (c) 用PBS緩沖液洗滌層析柱，流速為0.25mL/min，收取gp96蛋白；將收集的gp96蛋白用 pH為7.5的PBS緩沖液換液，濃縮，測定gp96蛋白濃度后分裝、貯存。
【文檔編號】C12N15/12GK105906706SQ201610282345
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】孟頌東, 王剛, 李鑫
【申請人】和泓（廈門）生物技術有限公司