一種cd19免疫原多肽及其用圖
【專利摘要】本發明公開了一種CD19免疫原多肽，屬于抗癌疫苗領域。具體涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原的優化多肽，增強T細胞免疫應答。該氨基酸序列為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。尤其在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫應答藥物中的應用，以及在制備用于CAR?T細胞免疫治療的應用。本發明的有益效果在于為全新的序列，可用于腫瘤免疫細胞技術中的免疫原，能（1）促進T細胞，（2）促進CD8+免疫應答，（3）能與T細胞表面的MHC有效的特異性結合，（4）促進T細胞與腫瘤細胞的結合，（5）在荷瘤小鼠體內，能抑制腫瘤的生長。作為細胞療法的靶標分子，應用于CAR?T等細胞療法。
【專利說明】
一種CD19免疫原多肽及其用途
技術領域
[0001] 本發明是有關抗癌疫苗領域。具體來說，本發明涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原 的優化多肽，增強T細胞免疫應答。
【背景技術】
[0002] B細胞淋巴瘤是B細胞發生的實體腫瘤通常發生于兒童和成年人，是一種攻擊免疫 系統中B細胞的癌癥類型。包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型眾多，經典霍奇金 淋巴瘤和結節性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤，現在被認為是起源于B細胞的腫瘤。彌漫性 大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)、小淋巴細胞淋巴瘤/慢性 淋巴細胞白血病、套細胞淋巴瘤(MCL)5種B細胞非霍奇金淋巴瘤最為常見，占非霍奇金淋巴 瘤的3/4』細胞淋巴瘤的預后和治療取決于淋巴瘤的具體類型以及分期分級。目前的治療 手段以化療為主，但化療對身體傷害很大，以后康復了身體抵抗力也會變得很差。
[0003] 研究人員發現B細胞淋巴瘤細胞表面受體CD19起著關鍵作用。CD19是一種B細胞特 異性轉膜糖蛋白，表達于B系細胞(不包括成熟漿細胞)及濾泡樹突狀細胞上，CD19是一種重 要的信號傳導分子，調節B淋巴細胞的生長激活和活化，在調節B淋巴細胞抗原受體或其他 表面受體的信號閾值中起重要作用，是與B淋巴細胞分化、活化、增殖及抗體產生有關的重 要膜抗原，是診斷B淋巴細胞系腫瘤的最好標志，如慢性淋巴細胞白血病(CLL)和急性淋巴 細胞白血病(ALL)。
[0004] 目前已經有腫瘤的臨床試驗測試對抗CD19受體的抗體。這種抗體不僅能殺死B淋 巴細胞系腫瘤，同時也能健康的B細胞，從而削弱免疫系統。研究人員希望能夠設計更有效 的治療方法，能選擇性地殺死腫瘤細胞，同時保留健康的B細胞，產生更安全、有效的臨床治 療效果。
[0005] 腫瘤細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免 疫抗癌的新型治療方法。它是運用生物技術和生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞進行 體外培養和擴增后回輸到病人體內的方法，來激發，增強機體自身免疫功能，從而達到治療 腫瘤的目的。腫瘤細胞免疫療法是繼手術、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術。
[0006] CD19可以作為腫瘤疫苗的特異性免疫原。然而，CD19由95KDa的蛋白，分子量較大， 較難得到純度高的⑶19。這樣，不僅會給后期的特異性T細胞免疫帶來困難，而且會導致患 者的自身免疫。因此，本發明提供了一種特異性強，純度較高的小分子多肽作為免疫原。
【發明內容】
[0007] 發明目的
[0008] 本發明提供一種CD19免疫原多肽，可用于腫瘤細胞免疫的免疫原，增強T細胞免疫 應答，具有分子量小、特異性免疫原性強的特點。
[0009] 技術方案
[0010] 本發明的技術方案在于提供一種C D 1 9免疫原多肽，序列為 DNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLK FLKLSLGLPGLGIHMRPLASW(SEQ ID N0:1)。該氨基酸序列 為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。尤其在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T 細胞免疫應答藥物中的應用，以及在制備用于CAR-T細胞免疫治療的應用。
[0011] 有益效果
[0012] 本發明的CD19免疫原多肽，為全新的序列，可用于腫瘤免疫細胞技術中的免疫原。 有益效果在于（1)促進Τ細胞，（2)促進CD8+免疫應答，（3)能與Τ細胞表面的MHC有效的特異 性結合，⑷促進Τ細胞與腫瘤細胞的結合，（5)在荷瘤小鼠體內，能抑制腫瘤的生長。作為細 胞療法的靶標分子，應用于CAR-Τ等細胞療法。
【具體實施方式】
[0013] 多肽由上海生工吉爾合成。
[0014] 實施例1
[0015] Τ淋巴細胞的增殖作用:無菌取小鼠脾臟，1640培養基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網過濾，制成單細胞懸液，離心（1000r/min，5min)，棄上清，TriS-NH4CL破解紅細 胞，冰水浴靜置3_5min，離心（1000r/min，5min)，棄上清，用無菌冷roS洗滌細胞兩次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培養液(5ml)懸浮細胞，細胞計數，調整細胞濃度為5 X106 個/ml，于96孔培養板中培養。
[0016] 實驗設空白對照組、模型組(刀豆蛋白A，sigma公司購買）、多肽各劑量(3、6、12mg/ ml)組。各組分別加入脾臟淋巴細胞懸液100μΙ/孔后，空白對照組加入1640培養液100μΙ，模 型組加入ConA(終濃度為5μg/ml)，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽基礎上加 ConA(終 濃度為Sμg/ml)。37 °C細胞培養箱靜止培養48h，培養結束后每孔加入20μ1 MTT，繼續培養 4h，最后棄掉每孔所有溶液，每孔加入100ylDMS0，震蕩，用酶標儀檢測570nm處0D值，每孔設 5個平行。
[0017]表1多肽對T淋巴細胞的增殖作用
[0018]
[0019] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0020]實驗結果見表1，與模型組比較，多肽能促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，在劑量為3 ~12mg/ml的范圍呈現很好的劑量依賴關系，以20mg/ml的增殖率最高，為153.6%。
[0021] 實施例2
[0022] CD19免疫原多肽的免疫原性測定:采用流式細胞技術測定免疫原多肽對CD8+T細 胞的影響。6_8w齡C57BL/6小鼠，小鼠隨機分成4組，每組10只。（1)空白組；（2)免疫原多肽低 劑量組；（3)免疫原多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。在試驗的第0、7、14天，分別進行免疫。 方案為:空白組加入相同體積的溶劑，實驗組多肽設3個劑量：l、2、4mg/Kg，在小鼠背部淋巴 結附近多點注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，將血離心后取血細胞層，用紅細胞裂 解液破解紅細胞，洗去裂解的紅細胞，再用熒光標記的單克隆抗CD8+-FITC(購自北京華泰 昕生物醫療技術有限公司)孵育、固定后，進行流式細胞技術測定，評價免疫原多肽對CD8+T 細胞的影響。
[0023]表2多肽對⑶8+T淋巴細胞的作用
[0024]
[0025] *P〈0 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0026]實驗結果見表2,與空白組比較，多肽能促進小鼠 CD8+T淋巴細胞，在劑量為1~ 4mg/Kg的范圍呈現很好的劑量依賴關系，以4mg/Kg的增殖率最高，為156.82%。
[0027] 實施例3
[0028] 應用競爭性受體-配體親和法測試多肽與MHC的結合能力：
[0029] 將多肽與HLA各型的結合能力由競爭性受體-配體親和法判斷。將固定濃度為50μ mo 1 /L的標記1251的多肽以及不同濃度（1 -50μπιο 1 /L)的多肽加入反應體系（磷酸鹽緩沖液 和MHC，所述的MHC試劑盒購自上海泛柯生物科技有限公司，試劑盒內有HLA-A1、Α2、A3、A11 和A24)，在反應體系中形成兩種復合物，即待測多肽MHC復合物和1251標記多肽復合物。待 測多肽與1251標記多肽競爭與MHC的結合。用超過濾(產品型號Microcon 30，Amicon公司） 分離游離多肽和多肽MHC復合物，然后測定多肽MHC復合物的1251放射量，將此放射量與沒 有競爭性抑制的多肽MHC復合物(沒有加待測多肽的樣本）的放射量比較，求待測多肽在抑 制50%標記多肽與腿(：結合時的濃度，8卩1050。由此得到，多肽對!11^-六1^2^3^11和八24的 IC50值分別為8.67、6.87、3.22、6.53和0.22以111〇1/1，均符合陽性多肽的標準（彡1(^111〇1/1)。 因此，多肽為具有有效結合能力的免疫原多肽。
[0030] 實施例4
[0031] CD19免疫原多肽的T細胞結合試驗:采用玫瑰花環試驗評價T細胞與人彌漫大B細 胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)活化B細胞（activated B-cell,ABC) 型細胞株〇CI_Ly3的結合能力。無菌取豚鼠胸腺，1640培養基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網過濾，制成單細胞懸液，離心1000轉/分，10分鐘，棄上清，以Hank's液調細胞濃度 為3 X 10%1。于96孔培養板中培養。
[0032] 實驗設空白對照組、多肽各劑量(3、6、12mg/ml)組。各組分別加入胸腺淋巴細胞懸 液?οομL/孔后，空白對照組加入1640培養液500μ1，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽。 37°C細胞培養箱，培養48h，培養結束后每孔中加入100μΙ/孔0CI-Ly3細胞(細胞濃度為IX 106/ml，含10 %胎牛血清），混勻，500轉/分，離心5分鐘。棄上清，加少量戊二醛，輕輕晃動， 使細胞懸浮，加甲紫染色，400倍顯微鏡觀察。凡結合3個以上腫瘤細胞的T淋巴細胞為花環 陽性細胞。記數100個T細胞中形成花環的淋巴細胞百分率，即為T細胞與0CI-Ly3細胞的結 合率。每孔設5個平行。
[0033] 實驗結果見表3，與空白組比較，CD19免疫原多肽可以顯著性增加 T細胞與0CI_Ly3 細胞的結合率(P〈〇.01)，低中高劑量組的結合率分別為34.35、45.30和54.72%。在劑量為3 ~12mg/ml的范圍呈現很好的劑量依賴關系。
[0034] 表3多肽對T細胞結合的影響
[0035]
[0036]
[0037] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 與空白組相比。
[0038] 實施例5
[0039] 用人彌漫性大B細胞淋巴瘤移植瘤模型檢測CD19免疫原多肽的體內活力。
[0040] 6-8齡SCID小鼠，小鼠隨機分成4組，雌雄各半，每組10只。（1)空白組；（2)多肽低劑 量組；（3)多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。建立人彌漫性大B細胞淋巴瘤移植瘤模型，在接 種腫瘤細胞后的第3、5、7天，分別進行免疫。方案為:空白組加入相同體積的溶劑，實驗組多 肽設3個劑量:1、2、4mg/Kg，在腫瘤周圍多點注射。21天后，觀察小鼠存活數量，計算存活率。 結果顯示，劑量l、2、4mg/Kg的多肽可有效地保護小鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達到 65·87、70·98 和82.98%。
【主權項】
1. 一種⑶19免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列為SEQ ID NO: 1。2. 根據權利要求1所述的多肽在用于治療腫瘤藥物中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述的多肽在制備用于腫瘤免疫細胞，增 強T細胞免疫應答藥物中的應用。4. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于:在制備用于CAR-T細胞免疫治療的應用。
【文檔編號】C07K14/705GK105906705SQ201610438413
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月19日
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司