一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應用
【專利摘要】本發明涉及一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應用，屬于基因工程技術領域。苦豆子水通道蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No.2，編碼苦豆子水通道蛋白的基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.1，所述苦豆子水通道蛋白在提高植物耐鹽性中的應用。本發明能提高轉基因植物的耐鹽性，對豐富抗性基因資源及培育耐鹽大豆品種具有重要意義。
【專利說明】
一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，涉及苦豆子水通道蛋白基因⑶S序列的應用。
【背景技術】
[0002] 土壤鹽漬化是目前制約農業生產的一個全球性問題，全球約有20%的耕地受到鹽 害威脅，43%的耕地為干旱、半干旱地區。鹽害嚴重影響植物的生長發育，造成作物減產，并 使生態環境日益惡化。在自然條件下，由于環境脅迫而嚴重影響了作物生長發育，其遺傳潛 力難以發揮，鹽漬不僅影響了作物的產量，而且限制了植物的廣泛分布，因此，提高作物的 耐鹽能力已成為抗逆育種急需解決的關鍵問題之一。隨著分子生物學的發展和轉基因技術 的成熟，利用轉基因技術提高植物的耐鹽堿性，已在鹽堿土壤改良方面得到廣泛的應用。同 時，以旱生、耐鹽堿植物為研究材料，從中分離克隆得到耐鹽堿性顯著的基因，是獲得抗性 基因資源的有效方法。
[0003] 苦豆子(Sophora alopecuroides.L)為豆科槐屬植物，別名、苦豆草、歐苦參等，為 多年生草本、根莖地下芽旱生耐鹽植物。其耐旱、耐鹽性顯著，是一個抗性基因豐富的基因 資源庫。因此，從苦豆子中篩選克隆鹽脅迫相關基因，分析其耐鹽性，闡明其相關功能，有助 于對抗鹽基因的進一步利用。
[0004] 水通道蛋白（aqUap〇rinS，AQPs)是一類能夠高效特異轉運水分子的膜結合蛋白， 在多種非生物脅迫下，如干旱、鹽堿、低溫等，植物都會出現細胞水分失衡。胞內缺水是脅迫 中常見的生理反應，AQPs對水分高效的跨膜轉運，能夠起到維持細胞滲透平衡，保持細胞水 分的作用。
[0005] 1988年由Agre等分離到了第一個AQP蛋白，而后在爪蟾卵母細胞表達系統中證明 了其介導水分運輸的功能。AQPs在不同的物種中的結構都比較保守。
[0006] 水通道蛋白中水孔的開閉是通過特異位點上氨基酸的磷酸化和質子化來調控的。 而AQPs水孔的開閉受多種胞外信號的調控，包括Ca 2+信號、PH、細胞滲透壓等。同時，AQPs還 可通過在細胞內膜系統上的重新定位來調控其導水率。對擬南芥的研究發現，AtPIP2;l在 外界鹽脅迫下可從細胞膜內化轉移到內質網膜上，使得根部的導水率下降，減少水分流失。
[0007] 鹽脅迫初期，植物首先出現的損害是滲透脅迫，此時植物吸水能力下降，體內水分 缺失，此時AQP基因通過降低表達量、AQP蛋白通過磷酸化關閉水孔以及質膜上的AQPs蛋白 內化來降低質膜的通透性，減少滲透失衡下水分的流失。
[0008] 在鹽害脅迫后期，由于細胞內的Na+和cr的積累，造成離子毒害。在對鹽生植物冰 花的研究發現，在鹽脅迫下，冰花葉肉細胞中會產生一種小液泡，其作用是區隔化Na+，液泡 膜上存在大量的AQPs，表明AQPs參與到Na+區隔化過程，進而維持細胞的離子平衡。
[0009] 鹽脅迫條件下，AQPs基因的表達受到ΑΒΑ的調控。對番茄噴施ΑΒΑ進行處理24h，其 根的導水率顯著升高，同時番茄根部的多個AQPs基因表達量顯著上升。
【發明內容】
[0010]本發明提供一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應用，能提高植物耐鹽性。 [0011]本發明苦豆子水通道蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No.2。
[0012] 本發明編碼苦豆子水通道蛋白的基因，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1。
[0013] 本發明所述苦豆子水通道蛋白在提高植物耐鹽性中的應用。
[0014] 我們利用苦豆子cDNA酵母表達文庫對苦豆子抗鹽相關基因進行篩選，得到了一鹽 脅迫相關基因，水通道蛋白基因，命名為SaAQP。
[0015] 在苦豆子中，到目前為止，關于SaAQP的作用還未見報道。
[0016] 利用任何一種能夠引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的SaAQP 編碼基因導入植物細胞，可獲得耐鹽性提高的轉基因細胞系及轉基因植株。使用本發明的 基因構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟 動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如 加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等）或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉 素、卡那霉素等）。攜帶有本發明SaAQP的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載 體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將 轉化的植物組織培育成植株。被轉化的宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本 發明的基因對提高植物耐鹽性，提別是培育耐鹽大豆品種具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1是SD/-Ura(含NaCl 0.68mol/l)篩選培養基菌落圖；
[0018] 圖2是酵母陽性克隆？0?檢測圖，]\1:200(^口1]^冰61'，1-6:酵母擴增結果；
[0019]圖3是SaAQP基因在苦豆子不同組織中的表達結果圖；
[0020]圖4是SaAQP基因在NaCl脅迫下的表達結果圖；
[0021] 圖5是SaAQP基因的農桿菌菌液PCR結果圖，]\1:200(^口1^11?^，1-5 :5340?基因；
[0022] 圖6A是大豆發狀根的誘導及⑶S檢測陰性對照圖；
[0023]圖6B是轉基因大豆發狀根的誘導及GUS檢測圖；
[0024]圖7是轉基因大豆發狀根中SaAQP基因的qRP-PCR檢測圖，1，2，3為3次重復，PCHF-1301為陰性對照；
[0025]圖8是帶子葉轉基因大豆發狀根耐鹽表型圖；
[0026]圖9是帶子葉轉基因大豆發狀根在不同濃度NaCl脅迫下發狀根的干重比較圖，*表 示達到0.05概率顯著水平；
[0027]圖10是離體轉基因大豆發狀根耐鹽表型圖，左邊:對照（空載），右邊:轉基因發狀 根；
[0028]圖11是離體轉基因大豆發狀根在不同濃度NaCl脅迫下的濕重比較圖，*表示達到 〇. 05概率顯著水平**表示達到0.01概率極顯著水平；
[0029]圖12是離體轉基因大豆發狀根在不同濃度NaCl脅迫下的存活數比較圖，*表示達 到0.05概率顯著水平；
[0030]圖13是轉SalAQP基因大豆發狀根復合體植株的耐鹽表型圖；
[0031]圖14是轉SaAQP基因大豆發狀根復合體植株在不同濃度NaCl脅迫下發狀根的濕重 比較，*表示達到0.05概率顯著水平。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1苦豆子SaAQP基因的篩選與克隆
[0033] 選取籽粒飽滿的苦豆子種子10g，加入5ml濃度98%的濃硫酸浸泡處理20min。洗凈 種子后播種于花土中盆栽。培養條件為：16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強30000勒克斯。 萌發四周后，分別將幼苗轉移至NaCl濃度為200mmol、Na2C03濃度為140mmol和PEG6000濃度 為8 %的hoagland營養液中分別處理3h，12h，24h，72h。取各處理下的苦豆子根部，分別提取 不同處理條件下苦豆子根的totalRNA。取上述提取的4個處理的苦豆子根部RNA，等質量混 合各組樣品用于cDNA文庫構建。提取構建完成的cDNA文庫質粒，將文庫質粒大規模轉化釀 酒酵母INVSC1感受態細胞構建苦豆子苗期酵母表達cDNA文庫。利用酵母植物抗逆基因篩選 體系篩選苦豆子抗鹽相關基因，篩選方法如下：
[0034]取適量文庫菌液（使克隆總數達文庫滴度的5-10倍），涂布SD/_Ura(含NaCl 0.68mol/l)篩選平板，30°C倒置培養2-4天至菌落出現，如圖1所示;保存篩選到的酵母菌 株，根據酵母表達載體序列設計引物，引物為：
[0035]
[0036] 按照表1反應和表2程序進行PCR檢測：
[0037] 表1PCR反應體系
[0038]
[00洲」 表2PCK捏序
[0040]
[0041] 如圖2所示;參照Sangon酵母質粒提取試劑盒的方法分別提取上述酵母菌液的質 粒，選取大于700的片段提取質粒，轉化Ecoli DH5a，保存菌液并進行測序，將測序后的序列 去除載體序列，淘汰小于50(^?的序列，利用1^81數據庫81&^(11^? :// blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi?PR0GRAM = b las tn&PAGE_TYPE = Blast Search & LINK_LOC = blasthome)進行序列比對分析，得到苦豆子水通道蛋白（SaAQP)基因。由753個 堿基對組成，讀碼框自5'端第1位到第753位堿基，編碼一個由250個氨基酸殘基組成的蛋白 質SaAQP蛋白具有膜內在蛋白（MIP)家族結構域，MIPs屬于水通道蛋白的一類蛋白，其N端之 后帶有六條跨膜螺旋，在質膜上具有選擇性輸水的作用。說明SaAQP也屬于MIP家族，與MIP 有相似的功能。
[0042] 實施例2苦豆子SaAQP基因的組織特異性表達
[0043] 對苦豆子進行NaCl鹽脅迫處理，處理方法同實施例1。處理時間分別為lh，2h，4h， 8h，12h，24h，48h。取各處理下苦豆子根部，同時取在hoagland營養液中培養的苦豆子的根、 莖、葉。參照sangon公司的柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取處理材料的總RNA，經1 %瓊 脂糖電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M_MLV(RNase H-)的 說明書進行。利用實時熒光定量PCR對SaAQP基因在苦豆子不同組織及不同鹽處理時間根中 的表達情況進行檢測。實驗操作按照sangong公司SGExcel FastSYBR Mixture(With R0X) 說明書在在實時熒光定量PCR儀ABI 7500中進行。以苦豆子Lectin為內參基因，引物如下：
[0044]
[0045] PCR反應體系及程序如表3:
[0046] 表3PCR反應體系和反應程序
[0047]
[0048]
[0049] 采用2_ΛΛετ法分析數據，確定基因的相對表達量。試驗共設3次技術重復，3次生物 學重復。
[0050] 結果（圖3)表明SaAQP基因在苦豆子的根、莖尖、葉片中均有表達，其中，根中的表 達量最高，其他組織表達量相對較低，SaAQP基因在莖尖中的表達量最低，絕大多數AQPs蛋 白都定位于植物根系的質膜上，故SaAQP基因在根中的表達量顯著高于其他組織。同時 SaAQP基因的表達水平在鹽處理lh就迅速上升，4h達到最大，之后迅速下降。（圖4)。這是由 于SaAQP基因的表達受ΑΒΑ的調控，在鹽脅迫條件下，植物根系能在很短的時間內產生大量 的ΑΒΑ，受ΑΒΑ調控的基因的表達量也隨之變化。
[0051 ]實施例3SaAQP在大豆中的表達及對耐鹽性的分析
[0052]構建植物表達載體pCHF-1301-SaAQP。采用發根農桿菌介導的大豆胚尖遺傳轉化 將植物表達載體pCHF-1301-SaAQP(圖5)轉化大豆吉林35,并對轉基因大豆發狀根進行⑶S 表達檢測，同時檢測陽性植株中目的基因表達量，并對轉基因大豆發狀根的耐鹽性進行分 析。具體方法及結果如下：
[0053] 3.1大豆發根的遺傳轉化及篩選 [0054] 1)植物材料的處理
[0055]選取飽滿、無病害的大豆吉林35種子，平放于培養皿中，將培養皿置于密閉的干燥 器中，并在干燥器中放入一加有96mlNaC10和4ml濃HC1的燒杯，Cl2滅菌14-hl6h。
[0056] 2)大豆種子發芽
[0057]取上述滅菌的大豆吉林35種子，接種于發芽培養基上，于16h光照，溫度26°C，濕度 65%，光強30000勒克斯的組培室發芽4-6天。
[0058] 3)侵染菌液的配制
[0059] i .從-80 °C冰箱中取出保存的發根農桿菌K599 (載體分別為pCHF-1301 -SaAQP和 pCHF-1301)，在YEP(含 1 OOμg/mlKan)固體平板上劃線，28 °C 培養24h;
[0060] ii.挑取平板上的單菌落，接種于50ml YEP(含100μg/mlKan)液體培養基中， 250rpm，28 °C 振蕩培養 8h-l Oh，使 0D6QQ = 0 · 8-1 · 0;
[0061 ] iii.取培養好的菌液5ml，加入到500ml YEP(含100μg/mlKan)液體培養基中， 250rpm，28 °C振蕩培養4h-6h，使OD600 = 0.6-0.8，該菌液為侵染菌液。
[0062] 4)大豆的侵染及發狀根的誘導
[0063] a大豆子葉節轉化
[0064] i.選取上述發芽良好的大豆吉林35種子，輕輕剝去種皮，切掉部分胚根，留取3-5mm下胚軸；
[0065] ii.沿下胚軸豎直從中間將兩片子葉切開，去掉子葉，用手術刀沿子葉節處平行劃 傷10次，然后將外植體置于上述侵染菌液中浸泡侵染30min;
[0066] iii.將外植體從侵染菌液中取出，內面向下平放于墊有濾紙的共培養培養基中， 于16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強30000勒克斯的組培室共培養4-5天。
[0067] iv.將共培養后的外植體用根誘導液體培養基清洗3-4次，再浸泡30min，然后用濾 紙吸取外植體表面液體，用手術刀去除芽，使外植體內面向上，傾斜45°斜插入根誘導固體 培養基中，于16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強30000勒克斯的組培室培養15天。
[0068] b大豆復合體植株轉化
[0069] i.選取上述發芽良好的大豆吉林35種子，輕輕剝去種皮，切掉部分胚根，留取3-5mm下胚軸；
[0070] ii.用手術刀在子葉下胚軸中間切十字2-3次，然后將外植體置于上述侵染菌液中 浸泡侵染30min;
[0071] iii.將外植體從侵染菌液中取出，內面向下平放于墊有濾紙的共培養培養基中， 于16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強30000勒克斯的組培室共培養4-5天。
[0072] iv.將共培養后的外植體用根誘導液體培養基清洗3-4次，再浸泡30min，然后用濾 紙吸取外植體表面液體，將外植體胚根向下，豎直插入到根誘導固體培養基中，于16h光照， 溫度26°C，濕度65%，光強30000勒克斯的組培室培養15天。
[0073] 3.2轉基因大豆發狀根GUS表達檢測
[0074] 隨機選取部分發狀根，用X-Gluc染色，37 °C黑暗染色12-14h，用70 %的乙醇脫色數 次，檢測GUS基因的表達。圖6A，圖6B為裝SaAQP基因的大豆發狀根的⑶S染色鑒定結果。結果 表明，SaAQP基因已在大豆發狀根中表達。
[0075] 3.3轉基因大豆發狀根的目的基因的表達檢測
[0076]選取上述GUS檢測為陽性的轉SaAQP基因外植體發狀根和轉化pCHF-1301的發狀 根，提取RNA，反轉錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測目的基因的表達量，內參為大豆β-actin，方 法參照實施例2。結果如圖7所示，與轉化pCHF-1301的對照相比，SaAQP在轉基因發狀根中表 達量均有顯著提高，說明SaAQP已成功轉入大豆中。
[0077] 3.4轉SaAQP基因大豆發狀根的耐鹽性分析
[0078] 1)帶子葉轉SaAQP基因大豆發狀根耐鹽性分析
[0079]發根農桿菌侵染后的大豆外植體于根誘導培養基上培養5-7天，將有發根跡象的 子帶葉外植體和對照轉移至含有不同濃度NaCl的固體MS (含16mg/L潮霉素)培養基中，培養 15天后進行統計。結果顯示，隨著NaCl濃度的增加，轉基因大豆發狀根的生長情況要優于對 照組，并且發狀根的干重也顯著高于對照；而當NaCl濃度達到達到200mmol/L時，轉SaAQP基 因的發狀根的生長受到抑制，難易誘導產生正常的發狀根，且外植體失綠變黃。見圖8和圖 9〇
[0080] 2)離體轉SaAQP基因大豆發狀根耐鹽性分析
[0081]將檢測為陽性的轉基因大豆發狀根培養于不同濃度NaCl的固體MS(含16mg/L潮霉 素)培養基中，處理15天后進行觀察統計。結果發現，在較低濃度(濃度在50mmol/L以下）的 NaCl處理時，轉SaAQP基因的發狀根的生長狀況于對照相比并無顯著差異，隨著NaCl濃度的 升高，轉基因發狀根的生長及濕重均明顯高于對照，見圖10;轉SaAQP基因的發狀根的濕重 增長最為顯著，濕重增量是對照的3倍，見圖11。而當NaCl濃度達到200mmol/L時，轉基因發 狀根與對照的生長均受到抑制，但轉基因發狀根的存活率均顯著高于對照，轉SaAQP基因的 發狀根存活率為38.4%，對照組的存活率為15.6%，見圖12。
[0082] 3)轉SaAQP基因大豆發狀根復合體植株的耐鹽性分析
[0083]將發根農桿菌侵染的整個大豆雙子葉外植體培養于不同濃度NaCl的固體MS(含 16mg/L潮霉素)培養基中，處理30天后進行觀察統計。當NaCl濃度為50、100、150mmol/L時， 轉SaAQP基因的發狀根植物復合體的長勢均好于對照，見圖13;在NaCl濃度為100、150mmo 1 / L脅迫條件下，SaAQP基因的發狀根植物復合體的濕重均顯著高于對照。見圖14。
[0084]我們對轉SaAQP基因的大豆發狀根進行鹽脅迫處理，分析其對大豆根系耐鹽的影 響，結果表明，SaAQP基因在發狀根中的過表達均使得轉基因大豆發狀根表現出了一定的耐 鹽性。對轉基因發狀根在不同濃度鹽脅迫條件下發狀根的生長狀態、存活率、增重等進行了 統計，結果顯示，在NaCl濃度為100、150mmol/L時，其生長狀態良好，耐鹽效果顯著;在NaCl 濃度為200mmol/L時，雖然其生長受到抑制，但存活率顯著高于對照。說明SaAQP和基因的過 表達均能不同程度的提高轉基因植物的耐鹽性。 序列表 <110，吉林大學 <120〉一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應用 <13Q> j1uwangqy-2016D1 <160> 2 <170> Patentln version 3：. 3 <21:〇> 1 <2U> 7.53 <212> DNA <213〉苦豆子永通道蛋白.基因 CDS. <400) 1 atgccgatca gaaacatcgc aatcggaagg cccgaagagg caattcaccc agacacgttg 60 aaggcaggtc tagctgagtt Gatttecacc c^teatctttg tcttcgctgg ctcaggctCG 120
[0085] ggcatcgctt acaacaagct caccgacgat gcccccgcca gccctgcagg actcatctcc 180 gcctcgattg cccatgcatt cgccetcttc gtcgccgtct ccgtcggtgc caacatctcc 240 ggtggccacg tcnnccccgc cgtcaretto ggagccttcc tcggcgggaa, catcarcttc 300 cttcgtggca tcgtttacat catcgttcag ctccttggct ccatcgtcgc ctccttgctc 360 ctcgagttcg tcaccggact tggxgttcca gcattcgggc tttctgctgg agttggtgtt 420 gggaacgcgt tggtgctgga gatcgtgatg actttcggtt tggtttacac agtttacgcc 480 aGagccg'ttg atcccaagaa gggtagttt.g ggaactattg GG〇c€atGgG tattggtttc 540 atcgttggtg ctaacatctt ggtgggtggg gctttcagtg gagcatccat gaacccagcc 600 gtgtctttcg gacctgctct tgtgagctgg acctgggcca accactggat ctactgggtt 660 gggcctctcg ttggtggtgg gcttgctggg cttgtctacg atcttctctt tatcaacaat 720 accoatgaac agctcececa gactgattac tag ?53 <210> 2 <21i> 250 <212> PRT <213〉苦豆子水通道蛋白 <400) 2 Met Pro lie Arg Asn lie Ala lie Gly Arg Pro Olu Glu ila lie His 1 .5 1.0 15 Pro Asp Thr Leu Lys Ala G]y Leu Ala Glu P：he lie Ser Thr Leu lie 20 25 30 Phe ￥al Pbe Ala Gly Ser Gly Ser Gly lie Ala, Tyr Asn Lys： Leu Thr 35 40 45 Asp Asp Ala Pro Ala Ser Pro Ala Gly Leu lie Ser Ala Ser lie Ala 50 55 60 His： Ala Phe Ala Leu Phe ￥al Ala Val Ser Val Gly Ala Asn lie Ser 65 70 75 80 Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Leu Gly Gly 85 90 95
[0086] Asn. .il.e Thr Phe Leu Arg Gly 丄le Val Tyr 丄丄e 丄ie 'Val _(Urt Le'u Leu 100 105 110 Gly Ser lie Val Ala Ser L@u Leu Leu Glu Phe ￥al Thr Gly Leu Gly 115 120 125 Val Pro Ala Phe Gly Lau Ser Ala Gly Val Gly: Val Gly Asn Ala Leu 130 135 110 Val Leu Glu lie Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Yal Tyr Ala 145 150 155 16:0 Thr Ala Val Asp Pro Lys Lys Gly Ser Leu Gly Thr He Ala Pro lie 1：65 170 175 Ala lie Gly Phe Ho Yal Gly Ala Asn lie Lgu fal Gly Gly Ala Phe 180 185 190 Ser Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Leu Val 195 2：Q0 205 ：Se；r Trp Thr Trp Ala Asn His Trp He Tyr Trp Val G1K Pro Leu Val 210 215 2：2D Gly Gly Gly Leu Ala Gly Leu: ￥al Tyr: Asp Leu: Leu Phe: I:l.e Asn. Asn [0087] 225 230 235 240 Thr His Glu Gin Leu Pro Gin Thr Asp： Tyr 245 250
【主權項】
1. 一種苦豆子水通道蛋白，其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID No.2。2. -種編碼苦豆子水通道蛋白的基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID No.1。3. 如權利要求1所述的苦豆子水通道蛋白在提高植物耐鹽性中的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK105906695SQ201610388727
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】王慶鈺, 郭文云, 劉雅婧, 王英, 李景文, 閆帆, 趙明珠, 尹智超, 王天亮, 申梓邑
【申請人】吉林大學