一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法
【專利摘要】本發明公開一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，是一種利用細胞培養反應器懸浮培養霍山石斛細胞來生產霍山石斛生物堿的方法。包括以下步驟：(1)單細胞制備(2)單細胞系培養(3)細胞群放大培養(4)提取霍山石斛生物堿：當細胞密度達到60000?80000個/ml收集霍山石斛細胞，降低培養溫度至7?10℃，繼續培養5?7天，提取霍山石斛生物堿。本發明能夠大幅度縮短細胞培養周期，提高霍山石斛生物堿產品收率，且工藝簡單、穩定，適合工業化生產。
【專利說明】
一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法
技術領域
[0001]本發明涉及霍山石斛技術領域，尤其涉及一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法。
【背景技術】
[0002]霍山石斛生物堿類是霍山石斛的主要成分之一，生物堿的藥理作用主要表現在抗腫瘤、對心血管、胃腸道抑制作用及止痛退熱等作用。隨著社會發展，人們對健康的關注越來越高，其需求量也會越來越大，但傳統霍山石斛生物堿類的提取方法是用霍山石斛的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產品已經不能滿足未來市場對霍山石斛精深加工的需求。
[0003]隨著植物細胞工程技術的發展，用細胞進行人工培養擴增提取植物的代謝產物，可以不受土地面積、氣候環境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業化生產。利用細胞工程技術生產石斛生物堿類的技術，在國內外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產過程中存在很多難題問題，如工藝復雜、生物量增速低、目標產物收率低、生產周期長等。關于利用氣升攪拌罐懸浮培養霍山石斛細胞生產霍山石斛生物堿的研究還沒有報道，因此開發一種高效生產霍山石斛中生物堿類天然產物的方法是十分有意義的。
【發明內容】
[0004]本發明針對現有技術的不足，提供一種工藝簡單、穩定，適合工業化生產懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法。
[0005]本發明通過以下技術手段去解決上述技術問題的:一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，包括以下步驟:
[0006](I)單細胞制備:取霍山石斛蒴果消毒后用固體培養基進行無菌播種，待萌發成原球莖后取出，采用酶解法分離制備單細胞，并離心過濾除雜，收集單細胞；
[0007](2)單細胞系培養:將收集到的單細胞接種到第一 MS液體培養基中培養；
[0008](3)細胞群放大培養:將培養好的單細胞系接種于第二 MS液體培養基中培養;所述第二 MS液體培養基中的P元素含量為MS液體培養基的2-3倍，所述第二 MS液體培養基中還添加有l-2mg//L的鍺元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值為5.8 土0.4。
[0009]使用本發明的第二MS液體培養基，相對于MS液體培養基能延長分批培養細胞生長時間2倍以上，提高細胞密度2倍以上。鍺元素、砸元素、酸水解酪蛋白能夠顯著增加霍山石斛懸浮細胞的鮮重、提高蛋白質和葉綠素的含量，使細胞抗氧化活性明顯升高。
[0010](4)提取霍山石斛生物堿:當細胞密度達到60000-80000個/ml，降低培養溫度至7-1O0C，繼續培養5-7天，采用離心收集霍山石斛細胞;再提取霍山石斛生物堿。
[0011 ]由于生物堿是次級代謝產物，與細胞生長不偶聯，降低培養溫度至該溫度范圍內，使細胞不增長，能促使生物堿產物的產生。
[0012]優選地，所述步驟(I)播種采用的培養基為適合蘭科植物生長的固體培養基。
[0013]優選地，所述固體培養基為1/2MS培養基。1/2MS培養基中大量元素減半，適合蘭科植物種子萌發。
[0014]優選地，所述步驟(2)中單細胞接種量為25 土 2g/L，光強度為2000-4000lux，色溫為4000-6000K，震蕩培養，溫度22 ± 2 °C，當細胞密度達到10000-20000個/mL，即可放大培養。該光強度范圍有助于細胞的形態建成和活力提升，過高則浪費，過低則達不到效果。該色溫為暖光，藍紫光較為均衡，有利于代謝產物的合成。該溫度范圍為霍山石斛生長和代謝最為均衡的溫度。該密度下，細胞的群體生長處于指對數時期，即活力最旺盛的時期。
[0015]優選地，所述步驟(3)中單細胞系接種量為30 土 2g/L，光強度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30 %。
[0016]優選地，所述第二MS液體培養基中還添加有0.1-2mg/L ΝΑΑ、0.l_2mg/L 6_BA、50_lOOmg/L果膠酶、10-50mg/L纖維素酶，pH值為5.8 ± 0.4。添加植物生長調節劑和生物酶制劑到培養基中，能激活細胞分裂生長，并防止細胞聚集結塊，保證營養和溶氧和二氧化碳供應均勾、充分。
[0017]優選地，所述鍺元素來源于GeO2或有機鍺。
[0018]優選地，所述砸元素來源于Na2SeO3或有機砸。
[0019]本發明的優點在于:本發明首先對霍山石斛種子無菌播種萌發形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細胞，進一步培養成單細胞系，最后進行細胞群放大培養，在放大培養中，添加植物生長調節劑和生物酶制劑到培養基中，能激活細胞分裂生長，并防止細胞聚集結塊，保證營養和溶氧和二氧化碳供應均勻、充分。本發明能夠大幅度縮短細胞培養周期，提高產品收率，且工藝簡單、穩定，適合工業化生產。
【具體實施方式】
[0020]本發明生物堿含量的檢測方法
[0021]1、對實施例提取的生物堿進行分析，具體分析方法如下。標準品配制:精密稱取石斛堿標準品1.0Omg置10mL量瓶中加氯仿至刻度。標準曲線的繪制:精密量取1.0，2.0，3.0，4.0,5.0mL分別置分液漏斗中，用氯仿準確稀釋至10.0mL，加入pH 4.5緩沖液5.0mL和0.04%溴甲酚綠溶液1.0mL，劇烈振搖3min，靜置30min，氯仿層經氯仿浸泡處理并干燥后的藥棉濾過，取續濾液5.0mLjJP0.0 lmolL—1氫氧化鈉無水乙醇液1.0mL搖勻，以氯仿10.0mL為空白，同法操作，于波長620nm處測得吸收度。由吸光度X對濃度Y(ug/ml)進行回歸計算，得到標準曲線方程:Υ = 0.6321X-0.0132，r = 0.99914。
[0022]2、樣品的測定:稱取本實驗制得的霍山石斛生物堿樣品50mg，稀釋至溶液吸光值在標準曲線范圍內(10-100倍)稀釋后，按上述方法進行測定。每個樣品測試10次，取線性范圍內的值求均值。
[0023]實施例1
[0024]本實施例公開一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，包括以下步驟:
[0025]1、培養階段
[0026](I)單細胞制備
[0027]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0028](2)單細胞系培養
[0029]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為23g/L，光強度為20001ux，色溫為4000K，震蕩培養，調pH值為5.4，溫度20°C，當細胞密度達到10000個/mL，即可放大培養；
[0030](3)細胞群放大培養:
[0031]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的2倍)+0.lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.lmg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節氨基嘌呤)+50mg/L中性果膠酶+10mg/L中性纖維素酶+lmg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.02mg/L砸元素(來源于Na2Se03)+0.1g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為28g/L，光強度為20001ux，色溫為4000K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.4;補料液為2倍濃度的第二 MS液體培養基;
[0032](4)當細胞密度達到60000個/ml，經測定每毫升培養液中細胞鮮重0.53g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量11.9mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.18mg/g，每克鮮細胞中SOD活性312U/g，降低培養溫度至70C，繼續培養5天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細胞，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0033]2、提取階段:
[0034](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0035](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0036](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0037](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.171 g，收率為0.34%。
[0038]本發明消毒具體采用的方式是75%酒精消毒Imin，0.1 ^HgCl2消毒15min，無菌水洗滌3次。以下實施例均采用該方法進行消毒。
[0039]本發明的酶解法分離采用的是現有技術，具體是在20uM蔗糖，1uM MgCl2,20uMpH 7.8Tris—HCL緩沖液中，使用果膠酶、纖維素酶對細胞團室溫處理4-8h。并在500rpm、1min條件下離心、清洗后收集單細胞。以下實施例均采用該方法進進行分離。
[0040]實施例2
[0041]1、培養階段
[0042](I)單細胞制備
[0043]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0044](2)單細胞系培養
[0045]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為25g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養，調pH值為5.8，溫度22 °C，當細胞密度達到15000個/mL，即可放大培養；
[0046](3)細胞群放大培養:
[0047]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的3倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ lmg/L 6_BA(6_Benzylaminopurine，6_節氛基嘌吟)+70mg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+70mg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+1.5mg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.05mg/L砸元素(來源于Na2Se03)+0.13g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001uX，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30 %，溶0)2在3 %，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補料液為2倍濃度的第二 MS液體培養基；
[0048](4)當細胞密度達到70000個/ml，測定每毫升培養液中細胞鮮重0.54g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.lmg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g,每克鮮細胞中SOD活性327U/g，降低培養溫度至80C，繼續培養6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細胞，經將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0049]2、提取階段:
[0050](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0051 ] (2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0052](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0053](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.257g，收率為0.51%。
[0054]實施例3
[0055]1、培養階段
[0056](I)單細胞制備
[0057]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0058](2)單細胞系培養
[0059]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為27g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，震蕩培養，調pH值為6.2，溫度24°C，當細胞密度達到20000個/mL，即可放大培養；
[0060](3)細胞群放大培養:
[0061]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的2倍)+ 2mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 2mg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-節氨基嘌呤) + 100mg/L中性果膠酶+50mg/L中性纖維素酶+2mg/L的鍺元素(來源于有機鍺)+0.lmg/L砸元素(來源于125603)+0.2g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為32g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在6.2;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養基；
[0062](4)當細胞密度達到80000個/ml，經測定每毫升培養液中細胞鮮重0.58g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.2mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細胞中SOD活性317U/g，降低培養溫度至10°C，繼續培養7天，采用100rpm低速離心，lOmin，收集霍山石斛細胞，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。細胞達到該密度后，就不能繼續增加了密度了，達到30L氣升式發酵罐的攪動極限。
[0063]2、提取階段:
[0064](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0065](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0066](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0067](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.232g，收率為0.46%。
[0068]實施例4
[0069]丨、培養階段
[0070](I)單細胞制備
[0071]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0072](2)單細胞系培養
[0073]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為24g/L，光強度為25001ux，色溫為4500K，震蕩培養，調pH值為5.6，溫度21°C，當細胞密度達到12000個/mL，即可放大培養；
[0074](3)細胞群放大培養:
[0075]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的2倍)+0.5mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.7mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+20mg/L中性纖維素酶+1.8mg/L的鍺元素(來源于有機鍺)+0.06mg/L砸元素(來源于有機砸)+0.16g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為29g/L，光強度為25001UX，色溫為4500K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30 %，溶⑶2在3 %，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.9;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養基；
[0076](4)當細胞密度達到80000個/ml，經測定每毫升培養液中細胞鮮重0.57g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.4mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.2 lmg/g，每克鮮細胞中SOD活性313U/g。降低培養溫度至90C，繼續培養6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細胞，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0077]2、提取階段:
[0078](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0079](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0080](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0081 ] (4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.18 2 g，收率為0.36%。
[0082]實施例5
[0083]丨、培養階段
[0084](I)單細胞制備
[0085]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0086](2)單細胞系培養
[0087]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為25g/L，光強度為30001ux，色溫為4400K，震蕩培養，調pH值為5.7，溫度22°C，當細胞密度達到18000個/mL，即可放大培養；
[0088](3)細胞群放大培養:
[0089]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的2倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.2mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節氨基嘌呤)+60mg/L中性果膠酶+25mg/L中性纖維素酶+1.8mg/L的鍺元素(來源于Ge02)+0.08mg/L砸元素(來源于有機砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為20001ux，色溫為5200K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養基；
[0090](4)當細胞密度達到60000個/ml，經測定每毫升培養液中細胞鮮重0.54g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.lmg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細胞中SOD活性324U/g ο降低培養溫度至7 0C，繼續培養5天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細胞，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0091]2、提取階段:
[0092](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0093](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0094](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0095](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.239g，收率為0.48%。
[0096]實施例6
[0097]1、培養階段
[0098](I)單細胞制備
[0099]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0100](2)單細胞系培養
[0101 ]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為26g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養，調pH值為6.1，溫度20°C，當細胞密度達到12000個/mL，即可放大培養；
[0102](3)細胞群放大培養:
[0103]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的3倍)+0.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.4mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節氨基嘌呤)+6 Omg/L中性果膠酶+30mg/L中性纖維素酶+2mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.05mg/L砸元素(來源于有機砸)+0.18g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;補料液為2倍濃度的第二MS液體培養基;
[0104](4)當細胞密度達到70000個/ml，經測定每毫升培養液中細胞鮮重0.56g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量11.9mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細胞中SOD活性332U/g，降低培養溫度至80C，繼續培養6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細胞，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0105]2、提取階段:
[0106](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0107](2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90%的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0108](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0109](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.171 g，收率為0.34%。
[0110]實施例7
[0111]1、培養階段
[0112](I)單細胞制備
[0113]取霍山石斛蒴果，按照組培技術要求消毒后進行無菌播種，播種培養基為固體I/2MS培養基，待萌發成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經低速離心機分離，收集沉淀下的細胞；
[0114](2)單細胞系培養
[0115]將收集到的單細胞接種到含有第一MS液體培養基的擋板搖瓶中，單細胞接種量為26g/L，光強度為40001ux，色溫為6000K，震蕩培養，調pH值為6.2，溫度23°C，當細胞密度達到13000個/mL，即可放大培養；
[0116](3)細胞群放大培養:
[0117]將培養好的單細胞系接種于含有第二MS(該MS液體培養基中的P元素為常規MS液體培養基的2倍)+ 1.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.8mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-節氨基嘌呤)+70mg/L中性果膠酶+35mg/L中性纖維素酶+1.6mg/L的鍺元素(來源于GeO2) +0.lmg/L砸元素(來源于有機砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液體培養基的30L氣升式攪拌發酵罐中，鮮細胞接種量為30g/L，光強度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶O2在30%，溶0)2在3%，調節補料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.6;補料液為2倍濃度的第二 MS液體培養基；
[0118](4)當細胞密度達到70000個/ml，經測定每毫升培養液中細胞鮮重0.56g/mL、每克鮮細胞中蛋白質含量12.2mg/g、每克鮮細胞中葉綠素含量0.19mg/g，每克鮮細胞中SOD活性331U/g，降低培養溫度至9 0C，繼續培養6天，采用100rpm低速離心，1min，收集霍山石斛細胞，將收集到的霍山石斛細胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0119]2、提取階段:
[0120](I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0121](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0122](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0123](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.223g，收率為
0.44%。
[0124]對比例I
[0125]選取播種生長8個月的霍山石斛組培苗，將組培苗洗凈瀝干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存備用。
[0126]I)脫脂:稱取過20目篩的干燥的霍山石斛粉末30g于潔凈燒瓶中，加入約50ml石油醚回流脫脂0.5h，抽濾；
[0127](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，過濾，濾渣再用90 %的乙醇浸提兩次，每次
0.5h，過濾，合并濾液，旋轉蒸發，回收乙醇；
[0128](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取兩次，合并萃取液后蒸餾回收氯仿得總石斛生物堿，為淺黃色粉末的粗石斛生物堿，重0.153g;
[0129](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物堿與甲醇的重量體積比g:ml為1:10)，超聲加速其溶解，超聲功率為300w，時間為15min，最終形成懸池液，將懸池液離心，離心轉速為5000r/min，15min，將離心之后的上清液倒入蒸發皿中，用恒溫水浴鍋使甲醇溶液蒸干，按生物堿含量的檢測方法得到精制霍山石斛生物堿中總生物堿的含量為0.19 6 g，收率為
0.39%。
[0130]通過上述的培養和提取，可以很清楚的判定本發明所述的細胞培養法在細胞培養后生產的霍山石斛生物堿在收率上可以接近甚至超過同期播種生長8個月的組培苗生產的霍山石斛生物堿。
[0131]本發明的方法不限制霍山石斛生物堿的生產，還適用于其他食用或藥用石斛屬植物生物堿的生產。本發明的第一 MS液體培養基為常規MS液體培養基或者P元素為常規MS液體培養基P元素2-3倍的培養基。
[0132]以上所述僅為本發明創造的較佳實施例而已，并不用以限制本發明創造，凡在本發明創造的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)單細胞制備:取霍山石斛蒴果消毒后用固體培養基進行無菌播種，待萌發成原球莖后取出，采用酶解法分離制備單細胞，并離心過濾除雜，收集單細胞； (2)單細胞系培養:將收集到的單細胞接種到第一MS液體培養基中培養； (3)細胞群放大培養:將培養好的單細胞系接種于第二MS液體培養基中培養;所述第二MS液體培養基中的磷兀素含量為MS液體培養基的2-3倍，所述第二 MS液體培養基中還添加有l-2mg/L的鍺元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值為5.8 土0.4； (4)提取霍山石斛生物堿:當細胞密度達到60000-80000個/ml，降低培養溫度至7-100C，繼續培養5-7天，采用離心收集霍山石斛細胞;再提取霍山石斛生物堿。2.根據權利要求1所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述步驟(I)播種采用的培養基為適合蘭科植物生長的固體培養基。3.根據權利要求2所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述固體培養基為1/2MS固體培養基。4.根據權利要求1所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述步驟(2)中單細胞接種量為25 土 2g/L，光強度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養，溫度22 ± 2 °C，當細胞密度達到10000-20000個/mL，即可放大培養。5.根據權利要求1所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述步驟(3)中單細胞系接種量為30±2g/L，光強度為2000-40001ux，色溫為4000-6000K，溫度22±2°C，氣升攪拌懸浮培養，調節通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%。6.根據權利要求1所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述第二液體MS培養基中還添加有0.1-2mg/L NAA,0.1 -2mg/L6_BA、50-100mg/L果膠酶、10-50mg/L 纖維素酶，pH 值為 5.8 ±0.4。7.根據權利要求1所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述鍺元素來源于GeO2或有機鍺。8.根據權利要求1所述的一種懸浮培養細胞生產霍山石斛生物堿的方法，其特征在于，所述砸元素來源于Na2SeO3或有機砸。
【文檔編號】C12N5/04GK105906641SQ201610353012
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】鄧輝, 陳乃富, 陳存武, 韓邦興, 何曉梅
【申請人】皖西學院