一種環磷腺苷的藥物組合物及其醫藥用圖
【專利摘要】本發明公開了一種環磷腺苷的藥物組合物及其醫藥用途，本發明提供的環磷腺苷的藥物組合物中含有環磷腺苷和一種從五味子的干燥果實中分離得到的結構新穎的天然產物化合物（Ⅰ），環磷腺苷和該天然產物化合物（Ⅰ）單獨作用時，對黑色素瘤的治療效果較弱；二者聯合作用時，對黑色素瘤的治療效果顯著提高，可以開發成治療黑色素瘤的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種環磷腺苷的藥物組合物及其醫藥用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及環磷腺苷的新用途，具體涉及一種環磷腺苷的藥 物組合物及其對黑色素瘤的治療作用。
【背景技術】
[0002] 為蛋白激酶致活劑，系核苷酸的衍生物。它是在人體內廣泛存在的一種具有生理 活性的重要物質，由三磷酸腺苷在腺苷環化酶催化下生成，能調節細胞的多種功能活動。作 為激素的第2信使，在細胞內發揮激素調節生理機能和物質代謝作用，能改變細胞膜的功 能，促使網織肌漿質內的鈣離子進入肌纖維，從而增強心肌收縮，并可促進呼吸鏈氧化酶的 活性，改善心肌缺氧，緩解冠心病癥狀及改善心電圖。
[0003] 環磷腺苷為參與調節細胞功能的第二信使物質，其作用非常廣泛，注射大劑量的 環磷腺苷，能使心肌收縮力增強，引起血壓升高，心輸出量增高。并能舒張平滑肌、擴張冠狀 動脈血管、改善肝功能、促進神經再生、抑制皮膚外層上皮細胞分裂及轉化異常細胞的功 能、促進呼吸鏈氧化酶的活性及改善心肌缺氧等。
[0004] 黑色素瘤，又稱惡性黑色素瘤，是來源于黑色素細胞的一類惡性腫瘤，常見于皮 膚，亦見于黏膜、眼脈絡膜等部位。黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的瘤種，容易出現 遠處轉移。早期診斷和治療因而顯得尤為重要。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種環磷腺苷的藥物組合物，該藥物組合物中含有環磷腺 苷和一種從草本中分離得到的結構新穎的天然產物，環磷腺苷和該天然產物可以協同治療 黑色素瘤。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的： 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0007] 一種環磷腺苷的藥物組合物，包括環磷腺苷、如上所述的化合物a)和藥學上可以 接受的載體。
[0008]如上所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將五味子的干燥果實 粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水 飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a) 中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫12個柱體 積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用 正相硅膠分離，依次用體積比為70:1、35:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個 組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~15個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0009] 進一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0010]進一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0011] 如上所述的化合物(I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應用。
[0012] 如上所述的環磷腺苷的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應用。
[0013]本發明的優點： 本發明提供的環磷腺苷的藥物組合物中含有環磷腺苷和一種從五味子中分離得到的 結構新穎的天然產物，環磷腺苷和該天然產物單獨作用時，對黑色素瘤的治療效果較弱;二 者聯合作用時，對黑色素瘤的治療效果顯著提高，可以開發成治療黑色素瘤的藥物。本發明 與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0015] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試 劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0016] 分離方法：（a)將五味子的干燥果實（5kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（20LX 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水飽 和的正丁醇(4LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為70 :1 (8個柱體積）、35 :1 (8個柱體積）、 15:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c) 中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1 (8個柱體積）、5:1 (10個柱體積)和2:1 (5個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷 鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~15個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (295mg，HPLC歸一化純度大于98%)。
[0017] 結構確證:黃色粉末;冊431-1^顯示[1+!1]+為111/2 395.1921，結合核磁特征可得 分子式為C23H26N2〇4，不飽和度為12。核磁共振氫譜數據δ Η(ppm，DMSO-?，500MHz ) : H-3 (4.13， d,/=4.9Hz),H-5a(3.12,dd,/=11.2,6.2Hz),H-5b(2.74,dd,/=11.2,4.0Hz),H-6(6.02,dd, /=6.2,4.0Hz),H-10(6.84,d,/=8.7Hz),H-ll(7.32,t,/=8.7Hz),H-12(7.13,d,/=8.7Hz), H-14a(2.23，m)，H-14b(l ·92，(Η，/=12·2,3·5Ηζ)，Η-15(3· 13，dtJ=12.2,4.2Hz)，H-17 (7.40,m),H-18(l.09,t,/=8.8Hz),H-19(3.76,q,/=8.8Hz,2H),H-21(5.62,s),9-0Me (3.81，8)，17-<116(3.84,8)，22-(116(3.62,8);核磁共振碳譜數據3。( ？?111，0150-辦，1251抱）： 164.2(C，2-C)，50.2(CH，3-C)，47.2(CH2,5-C)，124.3(CH，6-C)，130.7(C，7-C)，113.2(C，8-C)，159.3(C，9-C)，112.9(CH，10-C)，130.2(CH，11-C)，117.8(CH，12-C)，148.3(C，13-C)， 26.6(CH2，14-C)，31.3(CH，15-C)，110.3(C，16-C)，160.9(CH，17-C)，13.4(CH 3，18-C)，61.2 (CH2，19-C)，99.6(C，20-C)，135.2(CH，21-C)，168.1(C，22-C)，55.8(9-0Me)，61.3(17-OMehSOJUS-OMeXUV譜圖中的最大吸收帶222nm、347nm與394nm表明含有吲哚片段。氫譜 核磁數據表明：該結構中存在一組ABX偶合特征的質子信號δΗ6.84( lH，d J=8.7Hz，H-10)， 7.32(t，/=8.7Hz，H-l 1)與7.13(d，/=8.7Hz，H-l2)。此外，氫譜與碳譜核磁數據表明化合物 結構中含有一個甲氧基丙烯酸甲酯基片段，一個乙基片段，一個甲氧基苯片段，這些信息 提示該化合物可能是9-甲氧基-Corynanthe類單砲生物堿。HMBC譜中，Η2-19與C-20和C-21 的相關性表明乙基片段連接在C-20位上。在Corynanthe類單砲生物堿的生物合成途徑中H-15總是處在α位，據R0ESY譜分析，H-15與H_14b存在相關信號，說明H_14b也為α構型;此外， R0ESY中的Η-3與H-14a的相關信號歸屬了 Η-3為β構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜， 以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD 試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0018]
[0019]實施例2:對黑色素瘤的治療作用 一、材料和儀器 人Α375黑色素瘤細胞株由第三軍醫大學贈。化合物（I)自制，制備方法見實施例1， HPLC歸一化純度大于98%<^ΜΕΜ培養基、0.25%胰酶購自美國Gibco公司。MTT (3-(4,5-二 甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍）、DMS0(二甲基亞砜）、BrdU購自美 國Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠二抗購自美國Cell signaling公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0020]恒溫C02培養箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產品。超凈工作臺（中國 蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司）。電熱恒溫培養箱（中國 上海躍進醫療器械廠）。自動酶標儀（日本Wako公司）。紫外分光光度儀(美國Beckman公司）。 J6-HC高速離心機(美國Beckman公司）。低溫微量離心機(德國Eppendorf公司）。振蕩搖床 (美國Forma公司）。
[0021]二、試驗方法 1、細胞培養 1.1細胞復蘇 將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動使 其盡快融化(大約lmin)。然后吸出細胞懸液，加入到已加有2mL培養基的離心管中，輕輕吹 打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養基。用含有10%FBS和1%的青霉G/鏈霉素的 DMEM培養基8mL制成細胞懸液后，接種至10cm培養盤中。然后置于5% C02、37°C恒溫培養箱 中進行培養。
[0022] 1.2細胞傳代 顯微鏡下觀察細胞融合度達80%_90%時即可進行傳代。先用2mL PBS洗滌細胞2次，然后 加入0.25%的胰酶lmL。輕輕水平搖動培養盤，使消化液能覆蓋細胞的表面，然后置于37°C 溫箱中消化約lmin。置于顯微鏡下見細胞變圓回縮，然后迅速加入lmL含有FBS的培養基終 止消化。輕輕吹打至細胞分散均勻，然后根據細胞密度按照1:2或1:3傳代，重新接種于 新的培養盤中，置于5% C02、37°C恒溫培養箱中培養。
[0023] 1.3細胞凍存 取1盤處于對數生長期的細胞，胰酶消化并收集到離心管中，l〇〇〇r/min離心5min，棄 上清。然后加入lmL凍存液，輕輕吹散細胞制成細胞懸液，將細胞懸液加入到1.5mL的凍 存管中。在凍存管上標明細胞的名稱，保存時間，保存者的姓名。先將凍存管放入4°C冰箱， 放置約30min。接著置于-20°C冰箱，放置約2h。然后放于-80°C超低溫冰箱中放置過夜。第 二天將凍存的細胞置于液氮罐中長期保存。
[0024] 2、細胞計數法繪制細胞生長曲線 (1) 取對數生長期A375黑色素瘤細胞，計數，調整細胞密度為2 X 104/mL。 (2) 將細胞懸液接種于12孔板中，1.5mL/孔。 (3) 12h后，待細胞貼壁，換lmL無血清DMEM培養基，并分別用5ymol/L環磷腺苷、5μπιο1/ L化合物（I)、2.5ymol/L環磷腺苷與2.5ymol/L化合物（I)組合物、DMS0【對于DMS0稀釋的藥 物，控制DMS0濃度在1/1000以下，確保對細胞無害】處理，每組細胞設3個平行孔，置于5% C02、37。。恒溫培養箱中進行培養。
[0025] (4)分別于0h、24h、48h、72h終止培養，收集各組細胞，加0.25%胰蛋白酶消化，離 心，重懸。
[0026] (5 )細胞計數：吸取細胞混懸液1 OyL，加入等體積的臺酚藍區分活細胞，吸取1 OyL 混合液輕輕加入細胞計數板凹槽中，保證無空隙和氣泡。倒置顯微鏡下，計數周邊四個大方 格內的細胞數，代入公式:原細胞混懸液濃度(細胞數/mL)=(4個大方格的細胞數/4) X104 X稀釋倍數。
[0027] (6)計算活細胞數目，繪制細胞生長曲線。 3、MTT法檢測細胞增殖 (1)取對數生長期的A375細胞，消化，離心，重懸，計數，調整細胞懸液中細胞的密度 為 2X104/mL。
[0028] (2)將各組細胞懸液接種于96孔培養板中，200yL每孔，每組細胞3個平行孔，同時 設空白對照孔（只加入培養基）。
[0029] (3)12h待細胞貼壁后，換200yL無血清DMEM培養基，并分別用5ymol/L環磷腺 苷、5μηιο 1/L化合物（I)、2.5μηιο 1/L環磷腺苷與2.5μηιο 1/L化合物（I)組合物、DMS0處理。 [0030] (4)分別于0、1、2、3、4天終止培養。
[0031] (5)向每孔加入濃度為5mg/mL的四甲基偶氮唑藍(MTT)20yL繼續培養細胞4h。
[0032] (6)吸棄各小孔內的培養基，加入200yL DMS0,在微振蕩器上振蕩lOmin，使結晶 物充分溶解。
[0033] (7)以空白對照孔調零，采用自動酶標儀測定各孔570 nm處的吸光光度值(0D 值），以對應的0D值表示細胞增殖能力，各組取3個平行孔的平均值，以時間為橫軸，以各 吸光度值為縱軸繪制細胞生長曲線。
[0034] 4、統計分析 應用SPSS 18.0統計分析軟件，采用兩獨立樣本t檢驗及單因素方差分析進行數據 分析，數據用Z ±S表示，P〈0.05為有統計學意義。
[0035]三、結果及結論 1、 細胞形態觀察及計數結果 細胞形態觀察及計數顯示，環磷腺苷與化合物（I)組合物處理A375細胞48h、72h后，活 細胞數顯著降低，抑制效果顯著優于環磷腺苷或化合物（I)單獨作用48h或72h，差異具有統 計學意義(P<〇.〇5)。
[0036] 結果見表1。
[0037] 表1對A375細胞增殖的影響(細胞計數法，單位：Xl04/mL) (Z土S，n=3)
2、 MTT法實驗結果 MTT結果顯示，環磷腺苷或化合物（I)單獨作用、環磷腺苷與化合物（I)組合物組合作用 均能抑制A375細胞增殖，且環磷腺苷與化合物（I)組合作用時的抑制效果顯著優于環磷腺 苷或化合物(I)單獨作用的抑制效果(P<〇.05)。
[0038] 結果見表2。
[0039] 表2對A375細胞增殖的抑制(MTT法，0D570) (Z土 S，n=3)
結論:環磷腺苷與化合物（I)的組合物可以顯著抑制A375細胞的增殖，其抑制作用顯著 高于環磷腺苷或化合物（I)單獨對A375細胞的抑制。環磷腺苷與化合物（I)之間存在協同作 用。
[0040]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種環稱腺巧的藥物組合物，其特征在于：包括環憐腺巧、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可W接受的載體。3. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將五 味子的干燥果實粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙 醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙 醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為70:1、35:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯 度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1、5:1 和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~15個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，用80%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為DlOl型 大孔吸附樹脂。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應用。7. 權利要求2所述的環憐腺巧的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105906626SQ201610321228
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】徐珍
【申請人】蘇州畢諾佳醫藥技術有限公司