甲磺酸加貝酯的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用
【專利摘要】本發明公開了甲磺酸加貝酯的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用，本發明提供的甲磺酸加貝酯的藥物組合物中含有甲磺酸加貝酯和一種結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，甲磺酸加貝酯、化合物(Ⅰ)單獨作用時，可以降低短暫腦缺血再灌注引起的損傷；甲磺酸加貝酯和化合物(Ⅰ)聯合作用時，治療作用進一步提高，可以開發成治療短暫腦缺血再灌注損傷的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
甲磺酸加貝酯的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及甲磺酸加貝酯的新用途，具體涉及甲磺酸加貝酯 的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 甲磺酸加貝酯是一種非肽類蛋白的抑制劑，可抑制胰蛋白酶、激汰釋放酶、纖維蛋 白溶酶、凝血酶等蛋白酶的活性，從而制止這些酶所造成的病理生理變化。在動物實驗性急 性胰腺炎，可抑制活化的胰蛋白酶、減輕胰腺損傷，同時血清淀粉酶、脂肪酶活性和尿素氮 升高情況也明顯改善。用于急性輕型（水腫型）胰腺炎的治療，也可用于急性出血壞死型胰 腺炎的輔助治療。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種甲磺酸加貝酯的藥物組合物，該藥物組合物中含有甲 磺酸加貝酯和一種結構新穎的天然產物，甲磺酸加貝酯和該天然產物可以協同治療短暫腦 缺血再灌注損傷。
[0004] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0005] 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0006； -
· :?
[0007] -種甲磺酸加貝酯的藥物組合物，包括甲磺酸加貝酯、如權利要求1所述的化合物 (I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0009] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將金銀花粉碎，用65~75%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用20 %乙醇洗脫9個柱體積，再用65 %乙醇洗脫10個柱體積，收集65 %洗 脫液，減壓濃縮得65%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中65%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為12:1、7:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為58 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集11~15個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到 化合物(I)。
[0011] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用70%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備治療短暫腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
[0015] 上述甲磺酸加貝酯的藥物組合物在制備治療短暫腦缺血再灌注損傷的藥物中的 應用。
[0016] 本發明的優點:本發明提供的甲磺酸加貝酯的藥物組合物中含有甲磺酸加貝酯和 一種結構新穎的天然產物，甲磺酸加貝酯和該天然產物單獨作用時，對短暫腦缺血再灌注 損傷具有治療作用;二者聯合作用時，對短暫腦缺血再灌注損傷的治療效果進一步提高，可 以開發成治療短暫腦缺血再灌注損傷的藥物。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。
[0018] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0019] 分離方法：（a)將金銀花(2kg)粉碎，用70%乙醇熱回流提取（15LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用20%乙醇洗脫9個柱體積，再用65%乙醇洗脫 10個柱體積，收集65%洗脫液，減壓濃縮得65%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中65%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為65:1 (9個柱體積）、35:1 (10個柱體積）、15:1 (8 個柱體積)和7:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4 用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為12:1(6個柱體積）、7:1(7個柱體積)和1:1(6個柱 體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為58 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集11~15個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0020] 結構確證:冊431-]\^顯示[]\?^]+為111/2 245.1914，結合核磁特征可得分子式為 C15H260，不飽和度為3。核磁共振氫譜數據δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，600MHz): H-1 (1 · 92，m)，H-1 (2.17，m)，H-2(5.64，m)，Η-3(5·61，m)，H-6(1.46，m)，H-6(1.51，m)，H-7(1.29，m)，H-8 (1.32，m)，H-8(1.68，m)，H-9(1.35，m)，H-9(1.61，m)，H-10(1.26，m)，H-ll(1.42，m)，H-12 (0.85，d，J = 6.6)，H-13(0.86，d，J = 6.6)，H-14(1.16，s)，H-15(1.07，s);核磁共振碳譜數 據3。（？？111，0150-(16，15冊!^) :29.7(〇12，卜(：），131.1(〇1，2-〇，132.2(〇1，3-〇,91.5((：，4-C)，46.8(C，5-C)，34.1(CH2,6-C)，39.2(CH，7-C)，30.1(CH2,8-C)，29.3(CH2,9-C)，44.4(CH， 10-C)，32.7(CH，11-C)，19.3(CH3，12-C)，19.8(CH3，13-C)，22.4(CH3，14-C)，23.2(CH 3，15-〇。1!1-匪1?譜顯示四個甲基[3!10.85(3!1，(1，了 = 6.6抱，!1-12)，0.86(3!1，(1，了 = 6.6!^，!1-13)， 1.16(3!1，8，!1-14)和1.07(3!1，8，!1-15)]，以及兩個烯屬次甲基質子信號[5.64(1!1，111，!1-2)和 5.61(lH，m，H-3)L13C-NMR譜顯示15個共振碳信號，包括四個甲基，四個亞甲基，五個次甲基 (兩個烯屬次甲基）以及兩個季碳(一個含氧季碳）。通過HMBC譜中H-1與C-2、C-3和C-5，H-9 與 01、05、07、(：-8和(：-10，!1-12與(：-7、(：-11和(：-13，!1-13與(：-7、(：-11和(：-12，!1-14與(：-3、 C-4和C-5以及H-15與04、05、(：-6、(：-7和(：-10的相關性可以構建該化合物的結構，且該化 合物為倍半萜類化合物。ROESY譜中，H-14與H-15，H-15與Η-14、Η-9β和Η-8β的相關性表明H-14和Η-15為β構型。此外，Η-7與Η-6α和Η-8α，H-11與Η-8β，Η-12與Η-8β的交叉峰，而且沒有Η-7與Η-8β和Η-9β的相關性表明Η-7為α構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關 于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定， 理論值與實驗值基本一致。
[0021] 該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0022]
[0023] 實施例2:藥理作用
[0024] 本實施例采用阻斷小鼠雙側頸總動脈lOmin，再灌注15min，造成小鼠短暫性腦缺 血再灌注模型，觀察藥物改善腦缺血狀況和護腦作用的效果。
[0025] 1、材料與方法
[0026] 1.1動物
[0027] 昆明種小鼠，清潔級，雄性，體質量18~22g，河南省實驗動物中心提供。
[0028] 1.2試劑與樣品
[0029] 甲磺酸加貝酯購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實施例 1。華佗再造丸，廣州奇星藥業有限公司；氯化鈉注射液，鄭州化學藥業有限公司；水合氯醛， 上海山浦化工有限公司;ATP酶檢測試劑盒、乳酸(LD)檢測試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試 劑盒，南京建成生物工程研究所;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市福晨化學試劑廠。
[0030] 1.3儀器
[0031] UV-2000紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機， 上海安亭科學儀器廠；電子分析天平，奧豪斯(上海）公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋，北京 永光明醫療儀器廠;DY89-1型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技有限公司。
[0032] 1.4小鼠分組及模型制備
[0033]取小鼠60只，隨機取10只作為空白對照組，其余小鼠隨機分均分為5組，采用阻斷 小鼠雙側頸總動脈lOmin，再灌注15min，造短暫性腦缺血再灌注模型。造模型5組分為模型 對照組、陽性對照組(華佗再造丸2.67g/kg，用0.5 %CMC-Na配成0.134g/mL的混懸液）、甲磺 酸加貝酯組(80mg · kg<)、化合物（I)組(80mg · kg-1)、甲磺酸加貝酯與化合物（I)組合物組 【40mg · kg-1甲磺酸加貝酯+40mg · kg-1化合物（I)】。給藥組給藥容積為20mL/kg，灌胃給藥， 每天給藥1次，連續10 d。模型對照組和空白對照組均灌胃給藥0.5 % C M C - N a，給藥容積為 20mL/kg，每天給藥1次，連續1 Od。
[0034] 1.5凝血時間和腦勻漿中LD含量的測定
[0035] 于第10天給藥后lh(禁食不禁水12h)，造模小鼠以4%水合氯醛10mL/kg腹腔注射 麻醉(翻正反射消失），酒精消毒頸部，用手術刀作頸部正中切口，分離周圍肌肉，見到雙側 頸總動脈(CCA)，再用彎頭小鑷子剝離周圍神經，分離CCA，微動脈夾夾閉CCA阻斷血管血流， lOmin后取下微動脈夾，再灌注15min，造成小鼠短暫性腦缺血再灌注模型；空白組僅作假手 術處理，只分離CCA，不阻斷血流。再灌注15min后立即斷頭，用毛細血管法測定凝血時間。 [0036] 1 · 6小鼠腦勻衆ATP酶活力的測定
[0037] 再灌注15min后立即斷頭，立即在冰盤中分離腦，矢狀切取，用濾紙吸干凈附著的 血液，稱重，以腦組織(g):生理鹽水(mL) = 1:9的比例在盛有冰塊的玻璃勻漿機中勻漿，制 備10 %腦勾衆，低溫離心機3000r/min離心20min，取上清液于-20°C以下低溫保存，測定Na +-K+-ATPase的活力（單位為ymoL · mg-1 · h-工）。
[0038] 1.7統計學方法
[0039] 用SPSS13.0for windows統計軟件，計量資料以i±s表示，采用單因素方差分析， 然后用LSD檢驗進行兩兩比較。等級資料用Ridit分析。
[0040] 2、實驗結果
[0041] 2.1對短暫性腦缺血再灌注模型小鼠凝血時間和腦勻漿中LD含量的影響
[0042]與空白對照組比，模型對照組凝血時間顯著縮短(P〈0.01)，腦勻漿LD含量升高(P〈 0.05);與模型對照組比，甲磺酸加貝酯與化合物（I)組合物組和陽性對照組凝血時間顯著 延長(P〈0.01)、腦勻漿LD含量顯著降低(P〈0.01);與模型對照組比，甲磺酸加貝酯組、化合 物（I)組凝血時間延長(P〈〇.05)，腦勻漿LD含量降低(P〈0.05)。結果見表1。
[0043] 2.2對短暫性腦缺血再灌注模型小鼠腦勻衆ATP酶活力的影響
[0044]與空白對照組比，模型對照組小鼠腦勻漿中Na+-K+-ATPaSe活力顯著降低（P〈 0.01)，說明腦細胞能量代謝障礙;與模型對照組比，甲磺酸加貝酯與化合物（I)組合物組和 陽性對照組小鼠腦勻漿中Na+-K+-ATPa Se活力顯著升高(P〈0.01);與模型對照組比，甲磺酸 加貝酯組、化合物⑴組小鼠腦勻漿中Na+-K+-ATPa Se活力升高(P〈0.05)。結果見表1。
[0045] 表1對短暫性腦缺血再灌注模型小鼠凝血時間和腦勻漿中LD含量、ATP酶活力的 影響
[0046]
[0047] 缺血性腦血管病是危害人類生命與健康的常見病，具有高發病率、高致殘率、高死 亡率的特點，是由于腦部供血障礙引起腦組織相應區域缺血、低氧，造成腦組織損害所出現 的一系列生化代謝失常、生理功能喪失、病理形態改變等，是一種在腦組織上受到多層次、 多方面損害的疾病。臨床表現主要是腦組織缺血，進而導致腦髓神經受損，出現半身不遂、 言語謇澀或不語、口舌歪斜、偏身麻木等臨床癥狀，甚至出現神志障礙。當腦缺血發生時，腦 組織供血不足，能量合成物質供應缺乏，首先發生能量代謝障礙，糖無氧代謝產生LD增多， ATP耗竭，紅細胞膜ATP酶活性下降，凝血活性增強，可導致微血管閉塞，血流阻力增大，繼而 造成腦部微循環障礙，加重腦組織缺血缺氧。
[0048] 上述結果表明，甲磺酸加貝酯、化合物（I)單獨作用時，可以降低短暫腦缺血再灌 注引起的損傷；甲磺酸加貝酯和化合物（I)聯合作用時，治療作用進一步提高，可以開發成 治療短暫腦缺血再灌注損傷的藥物。
[0049] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種甲橫酸加貝醋的藥物組合物，其特征在于:包括甲橫酸加貝醋、如權利要求1所 述的化合物(I)和藥學上可W接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的甲橫酸加貝醋的藥物組合物，其特征在于:藥學上可W接受的 載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附 載體或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的甲橫酸加貝醋的藥物組合物，其特征在于：所述劑型包括片 劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將金 銀花粉碎，用65~75%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙 醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用20%乙醇洗脫9個柱體積，再用65%乙醇洗脫 10個柱體積，收集65 %洗脫液，減壓濃縮得65 %乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中65 %乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗 脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為12:1、7:1和 1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為58 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集11~15個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用70%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為DlOl型 大孔吸附樹脂。8. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲燒代 替乙酸乙醋進行萃取，得到二氯甲燒萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療短暫腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的甲橫酸加貝醋的藥物組合物在制備治療短暫腦缺血再灌 注損傷的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/045GK105906480SQ201610334012
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】王昌榮
【申請人】王昌榮