核酸探針和檢測基因組片段的方法

核酸探針和檢測基因組片段的方法
【專利摘要】本文尤其提供一種處理核酸樣本的方法。在一些實施方案中，所述方法包括：a)使包含靶片段的樣本與核酸探針雜交，所述核酸探針包含：i.頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和所述尾部序列在第一寡核苷酸分子的末端處；以及ii.夾板序列，所述夾板序列依次包含：與所述頭部序列互補的上游側翼序列、與所述靶片段互補的靶標互補序列以及與所述尾部序列互補的下游側翼序列；從而產生雜交產物，其中所述靶片段的末端可連接地鄰近所述第一寡核苷酸分子中的頭部序列和尾部序列的末端；以及b)將所述靶片段的末端連接至所述第一寡核苷酸分子的頭部序列和尾部序列的末端，從而產生包含所述靶片段以及所述頭部序列和尾部序列的環狀產物。還提供用于進行所述方法的探針和試劑盒。
【專利說明】核酸探針和檢測基因組片段的方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請要求2013年12月2日提交的英國申請號1321191.7的權益，所述申請以引用 的方式并入本文。 發明領域
[0003] 本公開涉及用于檢測生物樣本中的特定核酸序列的探針，尤其是用于在并行檢測 多個特定序列的多重方法中使用的探針，并且涉及其中這類探針用于檢測核酸的片段的方 法。具體地說，本公開涉及靶向來自特定染色體的DNA片段以供下游分析。
[0004] 背景
[0005] 人單倍體基因組包含包裝在23條染色體中的30億個堿基對，并且二倍體基因組具 有在23對染色體中的60億個堿基對。現代測序技術的快速性和便利性使得許多診斷問題能 夠使用個體的整個基因組或樣本中的DNA的總量的高通量測序來研究。然而，對于許多DNA 診斷應用來說，僅需要研究基因組的子組，從而集中于已知與所研究的特定病癥相關的一 個或多個區域。
[0006] 已描述了用于在分析之前降低基因組的復雜性的許多技術。在僅需要分析基因組 的單個短區的情況下，這可使用直接PCR來使用任一側上的已知區域的引物擴增序列來進 行。然而，當希望擴增基因組樣本的許多區域以供分析時，擴增假象可作為在同一反應混合 物中一起執行多個不同擴增的結果出現。
[0007] W02003/044216(Parallele Bioscience，Inc.)和US20090004701Al(Malek Faham)描述了一種多重擴增靶核酸的方法，其中常見寡核苷酸引物被連接至單鏈核酸片段 內部的位點。共同引發位點被附加至多個不同靶序列中的每個以允許其化學計量擴增。
[0008] W02005/111236(01ink AB)也描述了一種通過擴增特定靶序列鑒別人基因組中的 序列的方法。所述方法涉及將基因組樣本片段化成具有至少一個確定的末端序列的片段。 使全部包含引物對基序的選擇子構建體(selector construct)與所述片段相接觸。在連接 之后，使用對與選擇子共有的引物對基序具有特異性的引物對并行擴增所選擇的靶序列。 在TO2005/111236中描述的選擇子構建體具有與短寡核苷酸雜交的長寡核苷酸，每個選擇 子構建體具有與含有靶序列的片段的限定末端序列互補的一個或兩個突出末端。使所述選 擇子與靶片段接觸導致所述靶片段在一個或多個選擇子的突出末端之間的雜交。在具有兩 個突出末端的單個選擇子的情況下，這種雜交產生環化構建體。在各自具有一個突出端的 一對選擇子的情況下，這形成線性構建體。含有靶片段的選擇子構建體的連接和測序允許 測定靶序列。因為選擇子構建體僅與含有靶序列的片段的末端部分雜交(或與一個末端部 分和一個內部部分雜交），因此所述方法允許選擇在非雜交部分中不同的靶序列，以使得每 個選擇子分子能夠與多種不同的靶序列雜交。然后通過對構建體進行擴增和測序來確定精 確靶標的身份。W02005/111236提議在分析遺傳變異性的方法中使用選擇子或使用選擇子 用于DNA拷貝數測量。
[0009] GB2492042描述了選擇子方法的一種變化形式，其中使片段與包含選擇子寡核苷 酸和至少一個載體寡核苷酸的部分雙鏈探針相接觸。選擇子寡核苷酸包含對靶片段具有特 異性的兩個非相鄰區以及包含載體寡核苷酸的至少兩個結合位點的非靶標特異性區域。載 體寡核苷酸不與靶序列互補，并且包含與選擇子寡核苷酸上的載體結合位點互補的核苷酸 序列。載體寡核苷酸還包含用于檢測/富集的元件。在所述方法中，將探針寡核苷酸的互補 部分與靶片段雜交，隨后連接載體寡核苷酸和靶標以產生探針-靶標片段雜合體，然后檢測 所述雜合體。
[0010] 選擇子技術的開發在W02011/009941(01ink Genomics AB)中進行了描述，其描述 將經消化基的因組DNA的片段的一端連接至探針。與涉及結合至靶片段的兩個區域并且其 中待分離的序列通常由已知序列的兩個區域結合的先前選擇子探針相比，W02011/009941 中的探針被描述用于在僅存在序列的一個已知區域的情況下使用。W02011/009941中的探 針的一些實施方案包含用于固定至固相的元件。靶核酸片段與探針的連接引起靶片段的穩 定捕獲并且允許使用高度嚴格的洗滌步驟來除去未連接片段，從而產生高特異性。
[0011] 還已知的是鎖式探針(padlock probe)。鎖式探針是具有在末端處的靶互補序列 和在末端之間的非靶互補序列的線性寡核苷酸。當與正確靶DNA序列雜交時，所述探針的兩 個末端頭尾在一起并且可通過DNA連接酶連接。連接由連接接合點處的錯配抑制，因此鎖式 探針的成功連接取決于與靶序列的高度特異性雜交，從而允許所述探針區分高度相似的靶 序列并且選擇性地鎖住其精確靶標。由于雙鏈DNA的螺旋性質，所述環化探針分子鏈接至靶 DNA 鏈。
[0012] 已知使用滾環復制擴增鏈接的鎖式探針，也稱為滾環擴增。滾環復制在US 5,854， 033(Lizardi)中進行了描述。滾環復制是使用鏈置換DNA聚合酶擴增環狀核酸分子，從而產 生含有擴增序列的串聯重復序列的大DNA分子。DNA聚合酶催化在所需情況下進行的持續滾 環聚合反應中的引物延伸和鏈置換。它產生高于單個PCR復制循環和其他擴增技術多個數 量級的環化探針序列的擴增，其中每個循環限于靶序列的拷貝數目的加倍。可使用鏈置換 反應的級聯來獲得另外擴增。
[0013] Fredriksson等人（Nucleic Acids Res · 35(7): e47 2007)描述"基因收集器 (Gene-Collector)"，一種用于使用含有與所需PCR產物的同源引物末端序列互補的相鄰序 列的收集器探針多重擴增核酸的方法，以使得收集器探針與PCR產物的結合使PCR產物的末 端在一起以形成DNA環。然后使用滾環擴增進行通用擴增以產生靶序列的多聯體的最終產 物。此方法允許選擇性地檢測多重PCR反應中的正確擴增子，因為正確擴增子的末端序列是 同源引物對并且通過收集器探針環化，而組合來自一對的引物與來自引另一對的PCR假象 未環化。
[0014] 發明概述
[0015] 本公開提供用于分析核酸片段如片段化的基因組DNA的改進的方法和探針。本發 明的一些實施方案涉及探針以及其在針對靶單鏈核酸片段的存在測試樣本的方法中的用 途。本發明的一些實施方案涉及探針，所述探針包含
[0016] 靶向寡核苷酸，其含有為靶片段的互補序列的靶標互補序列和與所述靶標互補序 列相鄰的側翼序列，以及
[0017] 具有游離5'或3'端的寡核苷酸序列，
[0018] 其中所述片段與所述探針之間的雜交使靶片段模板化以用于連接至寡核苷酸序 列的游離5'或3'端。
[0019] 本發明的一些實施方案還涉及沿單鏈核酸片段的長度雜交且連接至所述片段的 各端的探針。所述探針包含具有游離5'端的寡核苷酸序列和具有游離3'端的寡核苷酸序 列，用于連接至所述靶片段的各端。然后檢測連接產物，從而允許所述限定核酸片段的高度 特異性靶向和檢測。
[0020] 根據本發明的一些實施方案的方法可包括將DNA消化成具有限定序列的片段，使 所得DNA片段變性為單鏈片段(靶標)并且將所述靶標與如本文所述的探針混合。所述靶標 與所述探針的雜交產生用于連接的模板以將所述靶標特異性地連接至對應探針以產生環 狀或線性連接產物。所述連接產物然后可例如通過外切核酸酶或固相化學來富集，且任選 地通過滾環擴增、PCR或其他DNA擴增方法來擴增。
[0021 ]本發明的一些實施方案的關鍵優點在于并行分析大量DNA片段。大量DNA片段可被 特異性地靶向且選擇用于下游分析。這特別適用于母體血流中的無細胞胎兒DNA的無創產 前檢查(NIPT)，其中對數千個染色體特異性DNA片段進行計數產生非常精確的定量。
[0022] -方面，提供一種針對靶核酸的存在測試樣本的方法。所述方法通常涉及產生限 定靶核酸片段，使所述樣本與沿所述靶片段的長度雜交且在所述片段的3 '和5 '端中提供可 連接的接合點的探針相接觸，將所述靶片段在所述3 '和5 '端處連接至所述探針，并且然后 檢測通過雙重連接事件形成的新的核酸分子。
[0023] -方面提供一種針對靶核酸的存在測試樣本的方法，所述方法包括：
[0024] (i)提供片段化核酸的樣本
[0025] (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈
[0026] (iii)使所述樣本與核酸探針相接觸，所述核酸探針包含
[0027]靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0028] 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾部序 列分別與所述上游側翼序列和下游側翼序列互補，
[0029] (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜 交，并且所述靶片段(如果存在)與所述靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的末端定位 成與所述頭部序列的5 '端和所述尾部序列的3 '端并置
[0030] (v)提供用于連接的條件，以使得如果存在靶片段，則將所述靶片段的3'端連接至 所述頭部序列的5'端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的5'端連接至所述尾部序 列的3 '端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述產物包含核酸的連續鏈， 所述核酸包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段，以及
[0031] (vi)檢測是否存在所述雙重連接的產物，
[0032] 其中檢測到所述雙重連接的產物指示所述樣本中所述靶片段的存在。
[0033]與大多數其他DNA選擇和檢測方法相比，本發明方法在整個核酸片段是預先限定 或預先確定一一即在所述靶片段的序列提前已知時是特別有用的。在本發明方法的一些實 施方式中，所述靶片段是核酸的特異性片段化的產物，而不是如可通過物理方式如剪切或 超聲處理產生的隨機片段化的產物。核酸的特異性片段化可使用限制酶、PCR或其他序列定 向片段末端限定來實現。
[0034] 希望靶向寡核苷酸接觸整個靶片段以確保精確靶序列的特異性結合。這與早期方 法形成對比，在所述早期方法中，探針被設計成與所述片段的一個端或多個端雜交和/或與 內部區域雜交而不沿靶片段的長度結合。確實，與靶片段的有限的結合是許多早期探針中 的有意設計特征，因為它允許在片段的序列僅部分已知時靶向且檢測所述片段。通過特異 性地靶向已知序列的片段一一受制于由群體中的不同等位基因產生的輕微序列變異性的 可能性，在適用的情況下一一本發明方法的探針和方法可允許以非常低的假陽性結果風險 精確結合和檢測所需靶片段。
[0035] 所述靶片段的雙重連接可進一步有助于所述方法的高特異性。所述探針變得在各 端連接至靶序列，即連接至核酸的單鏈片段的5'端和3'端。因此，通過片段化特異性產生的 靶標的末端可通過與頭部序列和尾部序列的序列特異性連接來特異性地檢測。所述連接的 序列特異性性質通過對靶片段與以及頭部序列和尾部序列與靶向寡核苷酸的雜交的要求 且通過受堿基對錯配抑制的DNA連接酶的靈敏度實現。靶片段與靶向寡核苷酸的雜交有助 于結合的特異性，但與相對于在靶片段的3'端和5'端處的錯配提供最高選擇性的連接反應 相比，所述雜交通過在靶標的中心部分中的內部錯配而最大程度地去穩定化。
[0036] 所述靶向寡核苷酸用于模板化所述靶片段與所述頭部序列和尾部序列的連接。所 述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜交，從而在所述頭部序列的5'端與所述尾部序列 的3'端之間限定空位。所述靶片段與靶標互補序列在所述空位中雜交，從而將所述靶片段 的末端定位成與所述頭部序列的5'端和所述尾部序列的3'端并置。優選地，所述靶片段以 及所述頭部序列和尾部序列與探針退火產生兩個完全匹配的可連接的接合點。所述雙重連 接的產物然后是包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段的核酸的連續鏈。
[0037] 涵蓋所述探針的多種可能的設計。例如，用于連接至靶片段的5'端和3'端可由兩 個單獨主鏈寡核苷酸上的頭部序列和尾部序列提供，或由在形成環狀以將靶片段定位在5' 端與3'端之間的單一主鏈寡核苷酸的相應末端處的頭部序列和尾部序列提供。
[0038] 在第一種情況(兩個單獨的主鏈寡核苷酸)下，所述靶片段與所述兩個主鏈寡核苷 酸的連接產生包含在所述頭部序列與尾部序列之間的靶片段的核酸的線性鏈。
[0039] 在第二種情況(單一環狀主鏈寡核苷酸)下，所述靶片段的連接產生包含在所述頭 部序列與尾部序列之間的靶序列的核酸的環。
[0040] 在其他型式中，頭部序列和尾部序列中的一個或兩個可被提供在所述靶向寡核苷 酸本身上，以使得所述靶向寡核苷酸在退火條件下形成環狀結構。取決于設計，在這類情況 下所述雙重連接的產物可以是線性或環狀核酸分子。
[0041] 所述產物的檢測依賴于所述靶片段與所述頭部序列和尾部序列的成功連接以形 成核酸的連續鏈。一般而言，使用需要兩種連接事件都發生以便產生信號的方法來檢測所 述雙重連接的產物。例如，檢測可包括跨兩個連接接合點擴增(例如，通過PCR或，對于探針 的環化實施方案，滾環復制)或捕獲在一端處的連續核酸鏈且檢測其另一端。所述靶片段與 所述探針通過連接的共價連接形成強鍵，因此嚴格的洗滌可用于去除未連接的核酸，其中 所述頭部序列和尾部序列未共價連接，所述序列與靶向寡核苷酸的相互雜交通過洗滌破 壞。
[0042] 所述方法和所述探針的這些特征實現靶片段的高特異性選擇。當所述方法被應用 于并行多重檢測多個靶片段時，靶核酸的非常精確的檢測和定量是可能的。由于其高特異 性，本發明的方法可特別適合于小樣本中的診斷用途和/或用于檢測相對量的不同靶核酸 的非常小的差異，例如用于診斷來自母體血液的樣本的胎兒染色體的非整倍性，或用于檢 測來自患者的正常組織的樣本中的痕量腫瘤DNA的存在或檢測來自感染劑的核酸片段。
[0043] 具有高特異性靶片段識別使能夠使用相對高的探針濃度而不產生假陽性信號，從 而提高產率和反應效率。這可在診斷應用中具有高度重要性，在所述診斷應用中，低變異性 為重要的，且例如NIPT中通過分析無細胞的DNA、檢測無細胞的循環癌癥DNA以及檢測來自 感染劑的DNA，祀標可能以低數目存在。本發明方法的一些實施方案實現短DNA片段的高特 異性分析，其在用于分析血液或福爾馬林固定的石蠟包埋的DNA中的片段化DNA樣無細胞的 DNA的應用中具有重要性。
[0044] 參考圖3和圖4,本文尤其提供一種處理核酸樣本的方法。在一些實施方案中，所述 方法可包括:a)使包含靶片段（"DNA靶標"）的樣本(例如，已用限制酶消化的樣本)與包含以 下的核酸探針雜交：i.頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾部序列在第一寡核苷 酸分子的末端處；以及ii.夾板序列(其中術語"夾板序列"意圖指寡核苷酸中當與兩種或更 多種其他多核苷酸雜交時充當"夾板"以將所述多核苷酸定位成彼此相鄰以使得它們可被 連接在一起的序列，如在圖3和4中所示）。如在圖3和圖4中所示，在此方法中使用的夾板序 列(在一些情況下其被稱為"靶向寡核苷酸"）包含與頭部序列互補的上游側翼序列；與靶片 段互補的靶標互補序列；以及與尾部序列互補的下游側翼序列。此雜交步驟產生雜交產物， 其中靶片段的末端可連接地鄰近第一寡核苷酸分子中的頭部序列和尾部序列的末端，其中 術語"可連接地鄰近"在可連接地彼此鄰近的兩個序列的背景下意指在兩種寡核苷酸之間 不存在插入核苷酸并且它們可使用連接酶連接至彼此。所述方法的下一步驟包括b)將所述 靶片段的末端連接至所述第一寡核苷酸分子的頭部序列和尾部序列的末端，從而產生包含 所述靶片段以及所述頭部序列和尾部序列的環狀產物。所述連接步驟在圖1中示出（如在圖 3和4中所示，雖然所述方法可以多種不同的方式實施，并且如此在所述方法的第一步驟中 使用的核酸探針可由一種或兩種寡核苷酸組成）。
[0045] 環化產物提供對于檢測的顯著優點，因為它們可通過滾環擴增(RCA)進行擴增。 RCA在單個分子中產生數百或數千個環化產物的拷貝，從而有效地擴增環化產物并且使其 使用例如與所述產物中的基序雜交的標記的寡核苷酸相對易于檢測。
[0046] 如在圖1中所示，所述方法還可包括使用與核酸探針中的序列(例如，頭部序列、尾 部序列或其之間的序列）雜交的引物通過滾環擴增來擴增所述環狀產物。在這些實施方案 中，所述方法還可包括定量所產生的滾環擴增產物的數目，從而提供所述樣本中的所述靶 片段的量的估計。在這些實施方案中，所述產物可使用與環狀產物中某處的序列互補的引 物通過滾環擴增進行擴增以產生多種RCA產物，例如，對應于單一、"克隆的"片段的產物。滾 環擴增產物的數目可通過例如以下方式來估計:將RCA產物分布在支持體(載玻片）的表面 上，使用標記的寡核苷酸(例如，熒光標記的寡核苷酸）雜交RCA產物且然后通過顯微鏡(例 如熒光顯微鏡)對所述支持體的區域中的離散信號的數目進行計數。標記可在所述產物已 被分布在所述支持體上之前或之后進行，并且因為每種RCA產物包含相同序列的數千個拷 貝，所以應當存在標記的寡核苷酸的數千個結合位點，從而增加信號。在多重實施方案(例 如，其中對對應于兩條不同染色體的RCA產物進行計數）中，對應于一條染色體的RCA產物可 用一種熒光團標記，并且對應于另一條染色體的RCA產物可用不同的熒光團標記，從而允許 單獨地對不同的RCA產物進行計數。
[0047] 定量來自單獨RCA產物的信號是有意義的，因為在許多應用（例如，通過分析無細 胞的DNA進行的無創產前診斷）中，對應于特定染色體(例如，染色體21)的片段的數目需要 非常準確地且無偏地測定。典型分析方法使用PCR，PCR如所熟知的是非常偏倚性的程序，在 于一些序列比其他序列以更高效率地擴增。這使得基于PCR的策略對于許多診斷工作來說 是不實際的。
[0048] 在替代實施方案中且如圖1中所示，靶片段可通過PCR擴增且定量。如將是清楚的， 被添加至靶片段和/或PCR引物的側翼序列可與在例如Illumina的可逆終止子方法、Roche 的焦磷酸測序方法（454)、Life Technologies的通過連接測序（SOLiD平臺）或Life Technologies的Ion Torrent平臺中使用相容。這類方法的實例描述于以下參考文獻中： Margulies等人（Nature 2005 437:376-80) ;Ronaghi等人（Analytical Biochemistry 1996 242:84-9);Shendure(Science 2005 309:1728);Imelfort等人（Brief Bioinform· 2009 10:609-18) ;Fox等人（Methods Mol Biol .2009;553:79-108) ;Appleby等 人(Methods Mol Biol .2009; 513:19-39)以及Morozova(Genomics. 2008 92:255-64)，所述 參考文獻以引用的方式并入以用于所述方法和所述方法的具體步驟，包括所述步驟中的每 個的所有起始產物、試劑和最終產物的一般性描述。在這些實施方案中，可對環狀產物進行 擴增和測序，并且樣本中的片段的豐度可通過對對應于所述片段的序列讀段(read)的數目 進行計數來估計。
[0049] 在某些實施方案中且如圖3中所示，夾板序列可在與頭部序列和尾部序列不同的 分子中，即"第二"寡核苷酸分子。如此，在所述方法開始時使用的核酸探針可由兩種寡核苷 酸（"主鏈"和"祀向"寡核苷酸，如圖3中所示)組成。
[0050] 在其他實施方案中且如圖4中所示，夾板序列可在與頭部序列和尾部序列相同的 分子中，即在"第一"寡核苷酸分子中。如此，在所述方法開始時使用的核酸探針可由單一寡 核苷酸組成。
[0051] 靶標互補序列可具有任何長度，這取決于核酸探針中的靶標互補序列的長度。在 一些實施方案中，靶標互補序列的長度是10至100個核苷酸，例如，10至50或10至30個核苷 酸。如以下所指出，靶標互補序列包含與靶片段的一個或多個錯配(例如，1、2、3、4、5或6個 或更多個，達10個或更多個），并且在某些情況下，靶標互補序列的反向互補序列可與所述 靶片段至少80 %、至少90 %或至少95 %相同。
[0052] 取決于設計，側翼序列可具有任何長度。在一些實施方案中，側翼序列的長度是10 與40個核苷酸，例如，10與30個核苷酸。
[0053]在一些實施方案中，所述樣本可包含基因組DNA，例如，來自實際上任何生物體的 基因組DNA的片段，所述生物體包括但不限于植物、動物(例如，爬行動物、哺乳動物、昆蟲、 蠕蟲、魚類等）、組織樣本、細菌、真菌(例如，酵母）、噬菌體、病毒、尸體組織、考古/古老樣本 等。在某些實施方案中，用于所述方法中的基因組DNA可源自哺乳動物，其中在某些實施方 案中所述哺乳動物是人。在示例性實施方案中，基因組樣本可包含來自哺乳動物細胞的基 因組DNA，所述哺乳動物如人、小鼠、大鼠或猴細胞。所述樣本可由培養的細胞或臨床樣本的 細胞制成，例如法醫樣本的組織活檢、刮擦或灌洗或細胞（即，在犯罪現場收集的樣本的細 胞）。在具體實施方案中，核酸樣本可從生物樣本如細胞、組織、體液和糞便獲得。目標體液 包括但不限于，血液、血清、血漿、唾液、粘液、痰、腦脊髓液、胸膜液、淚液、乳管液、淋巴液、 痰液、腦脊髓液、滑膜液、尿液、羊水以及精液。在具體實施方案中，樣本可從受試者，例如人 獲得。在一些實施方案中，所分析的樣本可以是從血液，例如從妊娠女性的血液獲得的無細 胞DNA的樣本。在某些實施方案中，基因組DNA可在片段化之前例如使用全基因組擴增方法 進行擴增。
[0054] 在夾板序列在第二寡核苷酸分子(如圖3中示出）的實施方案中，所述第二寡核苷 酸可另外包含可用于富集環狀產物的捕獲部分。在這些實施方案中，所述方法可包括:c)通 過結合所述捕獲部分將環狀產物固定至固相；以及d)洗滌所述固相以除去未連接的核酸和 其他反應組分;從而富集所述環狀產物。例如，第二寡核苷酸可包含生物素部分，例如生物 素或生物素類似物如脫硫生物素、氧化生物素、2 亞氨基生物素、二氨基生物素、生物素亞 砜、生物胞素等，有或無接頭，例如，一LC-生物素 、一LC-LC-生物素 、一SLC-生物素或一 PEGn-生物素，其中η是3-12,并且環狀產物可使用偶聯至鏈霉親和素的基質來富集。生物素 結合鏈霉親和素的親和力是至少10- 8Μ。
[0055] 對于無創產前檢查實施方案中，靶片段可來自人染色體21、13或18。
[0056] 在一些實施方案中，所述方法包括使樣本與一組至少50(例如，至少100、至少200、 至少500、至少1，000、至少2，000或至少5，000)個所述探針雜交，其中所述探針靶向在同一 染色體(例如，人染色體21、13或18)上的不同片段，并且其中所述方法產生包含靶片段的多 種環狀產物。所產生的環狀產物的數量可通過例如使用RCA擴增它們且對RCA產物的數量進 行計數來進行定量，如上所述。
[0057]在一些實施方案中，所述方法包括使所述樣本與所述組核酸探針中的第一組和第 二組雜交，其中所述第一和第二組探針分別靶向所述樣本中的第一染色體和所述樣本中的 第二染色體（即，與片段雜交且連接以產生環狀產物，如上所述）；通過滾環擴增(RCA)擴增 所述環狀產物且比較對應于所述第一染色體的RCA產物的數量與對應于所述第一染色體的 RCA產物的數量，從而提供來自所述樣本中的染色體的DNA的相對量的估計。
[0058]在一些實施方案中，所述方法包括使所述樣本與所述組核酸探針中的第一組和第 二組雜交，其中所述第一和第二組探針分別靶向所述樣本中的染色體的第一區和第二區 (即，與片段雜交且連接以產生環狀產物，如上所述）；通過滾環擴增(RCA)擴增所述環狀產 物且比較對應于所述第一染色體區的RCA產物的數量與對應于所述第二染色體區的RCA產 物的數量，從而提供來自所述樣本中的染色體區的DNA的相對量的估計。例如，此實施方案 可用于鑒別例如缺失或復制。
[0059]本文還提供組合物，所述組合物包含核酸探針，所述核酸探針包含:i.頭部序列和 尾部序列，其中所述頭部序列和尾部序列是在第一寡核苷酸分子的相對端處；以及ii .夾板 序列，所述夾板序列依次包含:與所述頭部序列互補的上游側翼序列，與人基因組中的靶片 段互補的靶標互補序列以及與所述尾部序列互補的下游側翼序列;其中所述探針被設計成 使得當所述第一寡核苷酸、所述夾板序列以及所述靶片段彼此雜交時，所述靶片段的末端 可連接地鄰近所述第一寡核苷酸分子中的頭部序列和尾部序列的末端。在某些實施方案 中，所述組合物可包含第一組至少50(例如，至少100、至少200、至少500、至少1，000、至少2， 000或至少5,000)個核酸探針，其中所述探針的靶標互補序列與第一人染色體(例如，染色 體是21、13或18)的不同靶片段互補。
[0060] 在某些實施方案中，所述組合物可包含第二組至少50(例如，至少100、至少200、至 少500、至少1，000、至少2，000或至少5，000)個所述核酸探針，其中所述第二組探針中所述 探針的靶標互補序列與第二人染色體的不同靶片段互補。在一些實施方案中，第一人染色 體可以是染色體21并且第二人染色體可以是染色體13或18。在一些情況下，第二人染色體 不是染色體21、13或18。
[0061 ] 附圖簡述
[0062]熟練技術人員將理解，以下所述附圖僅出于說明目的。這些附圖并非意圖以任何 方式來限制本教導的范圍。
[0063]圖1示意性地示出主題方法的一個實施方案，其中形成環狀DNA分子且通過RCA或 PCR擴增所述環狀DNA分子。
[0064] 圖2示意性地示出主題方法的一個實施方案，其中形成線性連接產物且用固相試 劑富集所述線性連接產物。
[0065] 圖3示出包含結合至其靶片段的環化主鏈寡核苷酸的探針。所述探針以兩種型式， A和B示出。
[0066] 圖4示出具有結合的靶片段的環化單一寡核苷酸探針。
[0067] 圖5示出由靶向寡核苷酸和環狀主鏈寡核苷酸組成的具有結合的靶片段的環化雙 環探針。
[0068] 圖6示出由靶向寡核苷酸和線性主鏈寡核苷酸組成的具有結合的靶片段的線性環 狀探針。
[0069] 圖7示出包含兩種主鏈寡核苷酸的具有結合的靶片段的線性探針。
[0070] 圖8是示出本文所述的方法的特異性的凝膠的圖像。
[0071 ]圖9是示出本文所述的方法的精確度的圖。
[0072]圖10圖A示出載玻片的表面上的標記的RCA產物的圖像；圖B示出來自不同染色體 的片段的比率可通過對單獨RCA產物進行計數來準確地測定的方式。
[0073] 詳述 [0074]靶核酸片段
[0075] 由探針結合的靶片段是核酸的單鏈片段。在一些實施方案中，本發明的方法結合 序列為預先限定的靶片段。包含末端的整個片段的序列可以是已知的。預先限定序列的已 知片段可通過核酸的特異性而不是隨機片段化產生。特異性片段化方法包括用限制酶消 化、PCR(例如，多重PCR)以及其他序列定向片段末端限定方法，包括其他酶、核酶或這類技 術的組合。
[0076] 片段化的一種方法是用限制性內切核酸酶或兩種或更多種限制性內切核酸酶的 組合消化。因此，片段化核酸的樣本可以是限制酶消化產物并且靶片段可以是限制片段。
[0077] 多種特異性核酸裂解酶是已知的并且任何合適的酶可用于本發明中，包括在特定 核酸序列內的預先限定的位置處裂解的酶，或在特定核酸識別序列之后或之前裂解的內切 核苷酸以及切口酶。催化核酸如核酶也可用于DNA片段化。所述酶可裂解雙鏈核酸以產生平 末端或粘性末端，或可裂解核酸的單鏈。各種類型的限制酶是已知的，包括I型、II型、III 型、IV型以及V型。合適的酶或酶的組合可根據需要被選擇用于所述方法中。例如，樣本中的 核酸(例如1 Ong的DNA)可在對應相容的限制酶緩沖液中用限制酶(例如，1U)消化。所述反應 可在合適的條件下孵育(例如，37°C持續1小時），接著進行酶失活(例如在80°C下持續20分 鐘）。
[0078] 提供片段化核酸的另一種方便的方法是使用引物用于擴增來自所述核酸的特異 性線性序列。可使用多重PCR，用多個特異性引物對處理核酸以擴增多個特異性片段。在這 種情況下，靶片段的末端對應于所述對引物的序列。
[0079] 對于許多診斷和其他應用，樣本是片段化染色體（例如，人染色體或微生物染色 體)的樣本。靶片段可以是對生物體的基因組的一條染色體特異的基因組片段。換言之，靶 片段可僅在基因組的一條染色體中找到，而未在所述基因組的其他染色體中找到。通常，所 述方法將用于人基因組的分析，在所述情況下，靶片段可以是對一條人染色體特異的片段， 即在該染色體中發現而未在其他人染色體中發現的片段。例如，所述片段可以是對染色體 21特異的。
[0080] 靶片段可對染色體的一個基因座是特異的。因此，它可在所述染色體基因座中發 現，而未在同一染色體的其他基因座或同一基因組的其他染色體中發現。例如，所述片段可 對人染色體的一個基因座是特異的。
[0081 ]樣本中給定種類的核酸可涵蓋一些可變性，例如樣本可包含不同個體的染色體， 如從含有母體DNA和胎兒DNA的母體血液獲得的核酸。在此目標種類可以是特定染色體，但 方便的是檢測所述染色體的所有拷貝，無論是胎兒還是母體來源的。因此，目標種類可以是 一條染色體或染色體基因座，并且靶序列在所述染色體或染色體基因座的母體和胎兒拷貝 兩者中在所述染色體或基因座中發現。
[0082] 核酸的樣本可以任何合適的方式提供，例如作為來自患者的生物組織或流體的樣 本。樣本可以是血液樣本、全血、血漿或血清、組織樣本，例如福爾馬林固定的石蠟包埋的組 織樣本，或者可以是從血液或組織中提取的核酸的樣本。
[0083] 樣本可以是包含核酸的任何樣本。包含在樣本中的核酸可以是DNA和/或RNA。所述 樣本可以是復雜的，例如全基因組DNA或來自全生物體、組織或細胞群體或其級分的cDNA。 在此方面，它可以是例如核酸分離程序的直接產物或細胞溶解程序的直接產物，或者它可 進一步以某種方式分級分離或純化，例如它可包含已部分或完全以某種方式分離或以任何 方式處理的核酸(例如RNA)以產生cDNA。樣本可來自任何真核或原核或病毒來源，例如可以 是微生物(例如細菌或真菌）、植物或動物。優選地，樣本為人來源，例如，人基因組DNA。所述 樣本可以是來自動物的組織或血液樣本，其中待檢測的核酸是微生物的，例如細菌的、病毒 的或真菌的。對于與無創產前診斷相關的方法，樣本源自孕婦的血液并且包含胎兒DNA。在 其他實例中，待檢測或定量的核酸是腫瘤相關的DNA。
[0084] 通常，所述方法可在體外對樣本進行。因此，所述方法通常不包括對人或動物身體 體內進行的診斷或通過手術或療法進行的人或動物身體的治療方法。盡管如此，體外診斷 方法的結果仍可用于告知患者的后續治療。
[0085] 使靶核酸變性
[0086]探針通過單鏈片段與靶向寡核苷酸的靶標互補序列之間的雜交識別并結合呈單 鏈形式的靶核酸。因此，如果樣本中的靶片段不再是單鏈的，則應提供變性條件以使單鏈靶 片段與其互補核酸鏈分尚。
[0087] 所述變性條件可以是足夠高的溫度以便使所述靶片段與其互補序列分離。變性條 件可在95°C下孵育合適的時間，例如10分鐘。或者可進行化學變性。
[0088] 互補性
[0089] -種針對靶片段的存在測試樣本的方法可包括使所述樣本與核酸探針相接觸，其 中所述探針包含
[0090] 靶向寡核苷酸，其含有為靶片段的互補序列的靶標互補序列和與所述靶標互補序 列相鄰的側翼序列，以及
[0091] 具有游離的5'或3'端的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸序列與所述側翼序列互 補。
[0092] 探針的合適濃度可基于樣本中的一個或多個靶片段的濃度(或預期濃度)來測定。 如在實施例中所說明，探針可以10pM/探針的濃度添加至樣本。在使樣本與多個探針(例如 一組探針）相接觸的情況下，單獨探針的濃度可以是10pM。優選地，探針以超過待檢測或定 量的目標核酸物種的預期濃度使用。使用過量探針應確保識別存在于樣本中的靶序列的所 有拷貝。這使檢測的靈敏度最大化。此外，在方法涉及定量的情況下，應確保連接產物或來 自一組探針的累積信號的檢測與樣本中的靶序列的量成比例。
[0093]在退火條件下，靶片段(如果存在)與靶向鏈的靶標互補序列雜交并且寡核苷酸序 列與側翼序列雜交，以使得寡核苷酸序列的游離5'或3'端分別與靶片段的3'或5'端并置。 因此，靶向寡核苷酸使靶片段模板化以用于連接至寡核苷酸序列。在雙重連接事件中，靶片 段的3'端可被連接至頭部序列的5'端，并且靶片段的5'端可被連接至尾部序列的3'端。 [0094]在根據本發明的探針中，如果靶標互補序列是靶片段的精確互補序列，以使得在 它們之間存在完美雜交，則實現對靶片段的最大特異性。然而，這不是在所有情況下必需 的，并且可接受較小程度的錯配，例如在希望檢測片段，而不管存在于樣本中的精確等位基 因的情況下以允許檢測表現出等位基因變異的片段。或者，多個探針可被設計用于變體序 列。這能夠實現不同等位基因或突變的檢測和區分。根據本發明的探針最有利地用于多重 方法中，其中大量不同的探針包括于反應中。在所述多個探針內，設想大多數探針將對于其 靶片段具有完美互補性，但一些探針可以少量錯配結合靶標。
[0095]優選地，靶標互補序列與靶片段具有少于5個堿基對錯配。在靶片段與靶標互補序 列之間可任選地存在一個、兩個、三個或四個堿基對錯配。錯配可以是對應堿基從一個序列 缺失的點，以使得互補序列在所述錯配點處形成環，或可在非互補核苷酸存在于一個序列 中并且因此不與在另一序列的對應位置處的堿基配對的情況下發生。在存在不正確的堿基 配對（即A或T與C或G的配對)的情況下，氫鍵合不會在兩個鏈的堿基之間發生，但是雜交仍 將在靶片段與靶向寡核苷酸的靶標互補序列之間發生，這是由于與錯配相鄰的核苷酸之間 的堿基配對。錯配可以是搖擺堿基(wobble base)。搖擺堿基通常將對應于靶標互補序列中 與靶片段中的已知遺傳變異的位置配對的位置。所述探針可通過在搖擺堿基位置的特異性 合成循環期間添加一個或數個二脫氧核苷酸來合成。傳統寡核苷酸合成通常是這種情況。 或者，可產生多個單獨的探針，每個探針用于每個遺傳變體。如果使用基于微陣列的合成來 合成探針，則通常是這種情況。搖擺堿基可對應于密碼子之間的單個核苷酸差異，其中不同 的密碼子編碼同一氨基酸。
[0096] 一般而言，相較于較短的靶標互補序列，用于雜交較長靶片段的較長靶標互補序 列可容許更多量的錯配。靶標互補序列可例如與靶片段具有至多1/8、1/9或1/10堿基對錯 配。任何這類錯配應被限制于靶標互補序列和靶片段的內部區域，以使得它們不會抑制通 過例如限制酶消化進行的連接或序列特異性靶標片段化。因此，優選地在靶片段的各端處 的末端6至8個核苷酸、優選地末端10個核苷酸中在靶片段與靶標互補序列之間存在完美互 補性。
[0097] 一般而言，靶片段與靶標互補序列具有相同長度。靶片段的全長因此被靶標互補 序列結合。靶片段與靶向寡核苷酸的雜交表示兩種核酸分子之間的單一結合事件，從而與 結合靶分子的兩端或結合靶標的兩個不相鄰區域的探針形成對比。
[0098]靶標互補序列可具有至少10個核苷酸，例如至少15個核苷酸的長度。它可達20、 25、30、35或40個核苷酸長。優選的范圍包括10-20個核苷酸、10-30個核苷酸以及10-40個核 苷酸。這類相對短的靶標互補序列適合用于結合對應較短片段。所述短序列有助于雙重連 接反應的特異性，因為DNA連接酶是對堿基對錯配敏感的，并且將優先地連接完全匹配的序 列。在錯配存在于結合至雙鏈序列的DNA連接酶的足跡中的情況下，所述序列可能未連接， 這提供另外的校對步驟，從而確保在檢測靶片段方面優先于不同但類似序列的片段的高特 異性。DNA連接酶通常在切口的每側上具有6至8個堿基的足跡。因此，如果片段是20個堿基， 則所述堿基中的12至16個將被連接酶特異性覆蓋。
[0099]所述探針雜交將尤其區別雜交的序列的中心部分中的錯配，而連接將區分在靶片 段的末端處的錯配。這一起產生高特異性片段檢測。
[0100]靶向寡核苷酸比靶片段長，因為它包括側翼序列以及靶標互補序列，并且它還可 包含一個或多個定制序列。定制序列不與探針的其他區域或靶片段互補一一換言之在退火 條件下它不與探針的其他區域(定制序列外部)或靶片段雜交。上游側翼區域是靶向寡核苷 酸中的靶標互補序列的上游或5'。下游側翼區域是靶向寡核苷酸中的靶標互補序列的下游 或3'。因此，靶標互補序列在靶向寡核苷酸內部，并且不包含靶向寡核苷酸的末端，因為它 由上游和下游側翼序列側接。
[0101] 由靶片段與靶標互補序列的雜交產生的雙鏈序列可被視為雜合雙鏈序列，因為它 是靶標與探針的雜合體。通常，雙鏈序列采用雙重螺旋構象，其中靶片段是一條鏈并且靶向 寡核苷酸是雙螺旋的另一條鏈。雜合雙鏈序列由靶向寡核苷酸的上游和下游側翼序列側 接，其進而與頭部序列和尾部序列雜交以產生雙鏈序列。再次，這些通常采用雙鏈核酸的正 常雙螺旋構象。
[0102] 上游和下游側翼序列優選地彼此不同，即優選地具有不同序列。優選頭部序列與 上游側翼序列互補，但不與下游側翼序列互補，并且尾部序列與下游側翼序列互補，但不與 上游側翼序列互補。這確保頭部序列和尾部序列僅分別與上游和下游側翼序列雜交。
[0103] 頭部序列通常將是與上游側翼序列相同長度。尾部序列通常將是與下游側翼序列 相同長度。
[0104] 側翼序列的正常長度在10與40個核苷酸之間，例如10-20或10-30核苷酸。側翼序 列可以是與彼此相同的長度。一個或兩個側翼序列可以是與靶標互補序列相同長度。上游 和/或下游側翼序列因此可具有至少10個核苷酸，例如至少15個核苷酸的長度。它可達20、 25、30、35或40個核苷酸長。
[0105]優選地，頭部序列是上游序列的互補序列。優選地，尾部序列是下游序列的互補序 列。序列的優選匹配對于探針的最佳結合來說是合乎需要的，以使得頭部序列和尾部序列 被正確定位以用于連接至靶片段。然而，任選地，在頭部序列與上游側翼序列之間和/或在 尾部序列與下游側翼序列之間可存在一個、兩個、三個或四個堿基對錯配。優選地，存在少 于5個堿基對錯配。
[0106] 不同于靶標互補序列，所述探針通常應不與靶片段或可存在于樣本中的其他核酸 互補。這將避免探針與除靶標以外的核酸的不想要的雜交。因此，如果探針是用于結合人基 因組DNA的片段，則所述探針可被設計為使得除靶標互補序列以外的序列不與人基因組DNA 互補，以使得所述探針僅與靶片段雜交并且不與樣本中的其他核酸雜交。
[0107] 退火和連接
[0108] 靶片段在高特異性反應中在兩端處連接。因為靶片段通常是核酸的特異性片段化 的產物，所以這些末端通常將具有特定預先確定的序列。在連接步驟中，這些末端分別通過 與頭部序列和尾部序列的序列依賴性連接來特異性地檢測。優選地，靶片段與探針的結合 產生兩個完全匹配的可連接的接合點，一個在靶片段的3'端與頭部序列的5'端之間，并且 一個在靶片段的5 '端與尾部序列的3 '端之間。
[0109] 核酸的5'端連接至核酸的3'端可在兩端與互補序列的相鄰核苷酸堿基配對時發 生。相應末端核苷酸與相鄰核苷酸的堿基配對形成在兩端之間含有切口的核酸鏈。兩端的 連接可通過DNA連接酶催化。提供用于連接的條件因此通常將包括提供DNA連接酶和反應條 件，在所述反應條件下DNA連接酶連接兩端以形成連續核酸鏈，從而閉合切口。多種連接酶 是可商購的，如Ampligase(Epicentre)，對于其適合的條件是添加1U酶并且在連接酶緩沖 液中在55°C下孵育1小時。
[0110]靶向寡核苷酸使靶片段模板化用于連接至頭部序列和尾部序列，這是由于側翼序 列之間的靶標互補序列的位置所致。在退火條件下在靶片段存在下，所述頭部序列和尾部 序列與所述側翼序列雜交，從而在所述頭部序列的5'端與所述尾部序列的3'端之間限定空 位。靶片段與靶標互補序列在所述空位中雜交。因此，頭部序列和尾部序列以及靶片段與靶 向寡核苷酸雜交將靶片段的3'端定位成與頭部序列的5'端并置，并且將靶片段的5'端定位 成與尾部序列的3'端并置。
[0111] 將兩端定位成并置提供用于DNA連接酶的底物以將所述末端連接在一起。優選頭 部序列的5'端和祀片段的3'端與祀向寡核苷酸的相鄰核苷酸雜交，并且尾部序列的3'端和 靶片段的5'端與靶向寡核苷酸的相鄰核苷酸雜交。因此，上游側翼序列可緊鄰靶標互補序 列，不具有插入核苷酸。類似地，下游側翼序列可緊鄰靶標互補序列，不具有插入核苷酸。相 鄰的3 '端和5 '端可通過DNA連接酶直接連接，從而密封它們之間的切口以形成連續核酸鏈。
[0112] 雙重連接的產物，即將頭部序列和尾部序列連接至靶片段的產物是核酸的連續 鏈。在它不包含切口或空位的意義上它是連續的，因此所述鏈中的所有核苷酸被共價連接。
[0113] 所述探針可被設計為使得包含頭部序列和尾部序列和靶片段的核酸的連續鏈是 核酸的環。術語環在此是指不具有游離端的為閉合環的鏈的拓撲結構。
[0114] 在退火條件下在靶片段存在下，所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜交， 從而在所述頭部序列的5'端與所述尾部序列的3'端之間限定空位。所述靶片段與靶標互補 序列在所述空位中雜交，從而將所述靶片段的末端定位成與所述頭部序列的5 '端和所述尾 部序列的3'端并置，并且完成包含靶片段以及頭部序列和尾部序列的核酸的環。
[0115] 形成環的核酸分子的末端并置。所述末端的連接產生包含至少所述頭部序列和尾 部序列以及所述靶片段的核酸的連續環狀鏈。
[0116] 形成核酸的環的探針包含其中頭部序列和尾部序列被提供在單個核酸分子上的 探針。例如，除了靶向寡核苷酸之外，所述探針可包含分別在其5'端、3'端具有頭部序列和 尾部序列的主鏈寡核苷酸，其中所述主鏈寡核苷酸的頭部序列和尾部序列在退火條件下反 式結合至靶向寡核苷酸的側翼序列。所述主鏈寡核苷酸可包含在頭部序列與尾部序列之間 的定制序列。圖3示出這類探針的實施方案。或者，所述主鏈寡核苷酸的頭部序列和尾部序 列可以是相鄰的，在它們之間不具有定制序列。
[0117] 在另一個實例中，所述頭部序列和尾部序列可在靶向寡核苷酸的末端處并且在退 火條件下順式結合至側翼序列。所述靶向寡核苷酸可包含在靶向寡核苷酸與頭部和/或尾 部序列之間的定制序列。圖4示出這種探針的實施方案。
[0118] 形成核酸的環的探針還包括其中頭部序列和尾部序列被提供在不同核酸分子上 的探針。在這類情況下，在退火條件下形成的核酸的環將包含至少三個核酸分子一一靶片 段、頭部序列和尾部序列。所述核酸分子的末端將全部并置，如先前所指出。在這類情況下 需要多于兩種連接反應來形成核酸的連續環狀鏈。一個實例是其中尾部序列是靶向寡核苷 酸的3 '端，并且所述探針包含具有在其5 '端的頭部序列的主鏈寡核苷酸。在退火條件下，尾 部序列順式結合至靶向寡核苷酸的下游側翼序列，并且主鏈寡核苷酸的頭部序列反式結合 至靶向寡核苷酸的上游側翼序列。順式結合意指結合發生在同一核酸分子上，即核酸的單 鏈形成三維結構，其中不同區域被帶至一起且雜交。反式結合意指結合在不同核酸分子之 間發生。任選地，主鏈寡核苷酸包含一對反向重復序列，所述反向重復序列在退火條件下形 成發夾結構，從而將主鏈寡核苷酸的3'端定位成與靶向寡核苷酸的5'端并置。在兩端之間 存在切口。這種類型的探針在圖5中示出。當提供用于連接的條件時，靶向寡核苷酸的5'端 被連接至主鏈寡核苷酸的3'端。雙重連接的產物是包含靶向寡核苷酸、靶片段和主鏈寡核 苷酸的核酸的環。或者，在靶向寡核苷酸的5'端與主鏈寡核苷酸的3'端之間存在空位的情 況下，圖5中所示的探針將不通過連接環化一一而是包含頭部序列和尾部序列以及靶片段 的核酸的連續鏈是核酸的線性鏈。
[0119] 所述探針或者可以相反取向布置，以使得頭部序列在靶向寡核苷酸的5'端，并且 所述探針包含具有在其3 '端的尾部序列的主鏈寡核苷酸。在這種情況下，在退火條件下，頭 部序列順式結合至靶向寡核苷酸的上游側翼序列，并且主鏈寡核苷酸的尾部序列反式結合 至靶向寡核苷酸的下游側翼序列。再次，主鏈寡核苷酸可包含一對反向重復序列，所述反向 重復序列在退火條件下形成發夾結構，以將主鏈寡核苷酸的5'端定位成與靶向寡核苷酸的 3'端并置。所述靶向寡核苷酸的3'端然后連接至所述主鏈寡核苷酸的5'端，以使得雙重連 接的產物是包含靶向寡核苷酸、靶片段和主鏈寡核苷酸的核酸的環。或者，如上所述，所述 退火可將主鏈寡核苷酸的5 '端定位在祀向寡核苷酸的3 '端附近，但通過一個或多個核苷酸 的空位隔開。連接的產物然后將是包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段的核酸的 連續線性鏈。
[0120] 所述主鏈寡核苷酸可包含在反向重復序列之間的定制序列，以使得在退火條件下 主鏈寡核苷酸形成發夾環，如圖5中所示。
[0121] 如所指出，探針可被設計為使得包含頭部序列和尾部序列以及靶片段的核酸的連 續鏈是核酸的線性鏈。在退火條件下在靶片段存在下，所述頭部序列和尾部序列與所述側 翼序列雜交，從而在所述頭部序列的5'端與所述尾部序列的3'端之間限定空位。所述靶片 段與靶標互補序列在所述空位中雜交，從而將所述靶片段的末端定位成與所述頭部序列的 5'端和所述尾部序列的3'端并置，并且完成包含靶片段以及頭部序列和尾部序列的核酸的 鏈。形成所述鏈的核酸分子的末端并置。術語并置已在其他地方進行了討論。在待連接的兩 端之間存在切口。所述末端的連接產生包含至少所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段 的核酸的連續鏈。
[0122] 所述探針可包含具有在其3'端的尾部序列的靶向寡核苷酸以及具有在其5'端的 頭部序列的線性主鏈寡核苷酸。在退火條件下，尾部序列順式結合至靶向寡核苷酸的下游 側翼序列，并且主鏈寡核苷酸的頭部序列反式結合至靶向寡核苷酸的上游側翼序列。靶向 寡核苷酸可包含在下游側翼序列與尾部序列之間的定制序列，以使得在退火條件下所述靶 向寡核苷酸形成發夾環。在退火條件下形成的核酸的線性鏈包含主鏈寡核苷酸、靶片段以 及靶向寡核苷酸。圖6示出這種布置。
[0123] 所述探針可相等地以反向取向布置，其中頭部序列在靶向寡核苷酸的5'端，并且 所述探針包含具有在其3'端的尾部序列的主鏈寡核苷酸。在這種情況下，頭部序列順式結 合至靶向寡核苷酸的上游側翼序列，并且主鏈寡核苷酸的尾部序列反式結合至靶向寡核苷 酸的下游側翼序列。
[0124] 形成作為連接的產物的線性核酸鏈的探針的另一種形式是包含在單獨主鏈寡核 苷酸上的頭部序列和尾部序列的探針。這種探針可包含含有具有游離5'端的頭部序列的主 鏈寡核苷酸；以及含有具有游離3'端的尾部序列的主鏈寡核苷酸，其中在退火條件下所述 頭部序列和尾部序列反式結合至靶向寡核苷酸的側翼序列。一種或兩種主鏈寡核苷酸還可 包含定制序列。圖7示出這種類型的探針。
[0125] 優選地，所述探針的呈其未連接形式的寡核苷酸是線性的。因此，優選地，所述靶 向寡核苷酸是線性核酸分子。對于包含一種或多種主鏈寡核苷酸的探針，這些還優選地是 線性的。這允許連接的探針與未連接的探針之間的方便區分，其中DNA的環僅作為所述探針 的環化實施方案的成功連接的結果形成。線性核酸分子未通過滾環復制擴增。
[0126] 檢測
[0127] 在提供在其下靶片段(如果存在)連接至探針的條件之后，進行檢測步驟以確定這 種結合是否已經發生。這指示靶片段是否存在于樣本中。因此，產物的檢測依賴于所述靶片 段與所述頭部序列和尾部序列的成功連接以形成核酸的連續鏈。檢測步驟因此通常涉及檢 測需要兩個連接接合點的存在的信號。例如，檢測可包括跨兩個連接接合點擴增(例如，通 過PCR或，用于探針的環化實施方案，滾環復制）或捕獲在一端處的連續核酸鏈且檢測其另 一端。
[0128] 任選地，方法可包括在檢測之前富集雙重連接的產物。產物可通過擴增和/或通過 固相化學富集。環狀核酸產物可通過用外切核酸酶(例如，λ外切核酸酶)處理樣本以消化線 性核酸產物來選擇性地富集。一般來說，外切核酸酶降解可用于在連接產物被保護免于外 切核酸酶降解時富集連接產物。外切核酸酶然后應在涉及聚合的任何后續步驟之前，例如 在滾環擴增之前失活(例如通過熱量）。如在實施例1中所示，可添加1U外切核酸酶以除去未 反應的探針和片段。適合的條件是在對應外切核酸酶緩沖液中在37°C下孵育1小時，接著在 80 °C下酶失活20分鐘。在使用捕獲/檢測方法的情況下，連接產物可通過經由捕獲部分捕獲 固相上的產物來富集。如在實施例2中所示，含有線性連接產物的溶液可與10ml M-280鏈霉 親和素涂覆的磁珠（Invitrogen)在200ml最終體積中的Tris-HCl(pH 7.5)、3.5mM EDTA和 0.07 % Tween-20中混合，并且在室溫下孵育15分鐘。在孵育之后，使用環形磁鐵收集珠粒， 并且除去上清液。富集連接產物的其他方式包括特異性地大小選擇連接產物。
[0129] 用于檢測雙重連接的產物的方便的方式是提供用于擴增的條件且針對擴增產物 的存在進行測試。幾種擴增方法是可能的，如NASPA、LAMP、T7擴增、PCR或在連續鏈是環的情 況下滾環復制。檢測雙重連接的產物的步驟可包括提供用于跨核酸的連續鏈的第一和第二 連接接合點擴增的條件，并且檢測是否存在擴增產物。連接產物可通過克隆擴增進行擴增。 適合的擴增技術包括滾環擴增（參見下文）、橋式PCR(Adessi C等人，Nucleic Acids 1^8.2000年10月15日；28(20)士87)、乳液？0?(乳液中的數字？0?由0代3811^11等人，？『〇〇 Natl Acad Sci U S A.2003年7月22日；100(15):8817-22.Epub 2003年7月 11 日描述）以及 數字卩0?(￥(^618七6111&燈似161?仰。恥七1厶。&(13(^1]3厶.1999年8月3日 ；96(16):9236-41)。凝膠中的克隆局部擴增由 Mitra&Church, Nucleic Acids Res. 1999 年 12 月 15 日；27 (24):e34 描述。
[0130] 在雙重連接的產物是核酸的環的情況下，用于檢測產物的方便的方式是提供用于 滾環復制的條件以及檢測是否存在滾環復制的產物。滾環復制的產物依賴于雙重連接以提 供用于擴增的核酸的環。滾環復制描述于1^ 5,854,033(1^231(1;〇和？;^6&乂11，？1'〇〇他1:1 Acad Sci U S A.1995May 9;92(10) :4641-5中。滾環復制是使用鏈置換DNA聚合酶擴增環 狀核酸分子，從而產生含有擴增序列的串聯重復序列的大DNA分子。DNA聚合酶催化在所需 情況下進行的持續滾環聚合反應中的引物延伸和鏈置換。它產生高于單個PCR復制循環和 其他擴增技術多個數量級的環化探針序列的擴增，其中每個循環限于靶序列的拷貝數目的 加倍。可使用鏈置換反應的級聯來獲得另外擴增。滾環復制可以是超支化滾環復制。超支化 RCA由Lizardi等人，Nat Genet. 1998年7月；19(3) :225-32描述。用于滾環復制的條件在實 施例中說明，例如與1U的phi29聚合酶(New England Biolabs)孵育可添加在對應phi29緩 沖液和核苷酸(dNTPs)在37 °C下持續1小時。
[0131] 在滾環復制之后，擴增的探針序列可使用用于核酸的任何常規檢測系統如檢測熒 光標記、酶聯檢測系統、抗體介導的標記檢測和放射性標記的檢測來檢測和定量。優選地， 滾環擴增產物通過標記的檢測寡核苷酸與RCA產物中的基序，例如探針的定制序列中的基 序的雜交來檢測。因為擴增產物與樣本中存在的靶序列的量成正比，所以定量測量可靠地 表示樣本中靶序列的量。這種方法的主要優點是，連接步驟可被操縱以獲得等位基因區別， 所述DNA復制步驟是恒溫的，并且信號是嚴格定量的，因為擴增反應是線性的并且由高度加 工酶催化。在多重測定中，用于DNA聚合酶反應的引物寡核苷酸可以是對于所有探針相同 的。
[0132] 對于其中頭部序列和尾部序列在單獨核酸分子探針上的探針，可方便地使用捕 獲/檢測方法。雙重連接的產物包含在單個核酸分子中的頭部序列和尾部序列(連續鏈），而 未連接的探針沒有。因此，雙重連接的產物可通過以下方式來特異性地檢測:捕獲含有頭部 序列的核酸分子，洗滌以除去未連接的探針核酸，然后檢測捕獲的級分中尾部序列的存在。 或者，雙重連接的產物可通過以下方式來特異性地檢測:捕獲含有尾部序列的核酸分子，洗 滌以除去未連接的探針核酸，然后檢測捕獲的級分中頭部序列的存在。檢測對連接的探針 具有特異性，因為未連接的探針的頭部序列和尾部序列僅通過核酸之間的雜交連接，并且 通過洗滌而分離，而連接的探針含有連續核酸鏈中的（即，共價連接的）頭部序列和尾部序 列。
[0133] 探針可進行修飾以攜帶捕獲部分。捕獲部分可允許附著至固體基質如珠粒。合適 的捕獲部分是生物素，其與鏈霉新核素配對，從而允許待在用鏈霉親和素涂覆的固體基質 上分離修飾的探針核酸。其中探針包含含有頭部或尾部序列的主鏈寡核苷酸，以及分別含 有尾部或頭部的單獨核酸(靶向寡核苷酸或第二主鏈寡核苷酸），這些核酸分子中的任一者 可攜帶捕獲部分，例如可生物素化。可能方便的是在組合探針與樣本之前提供具有捕獲部 分的探針。或者，捕獲部分可在連接步驟之后引入。
[0134] 在探針中的一種核酸分子攜帶捕獲部分的情況下，另一種核酸分子可攜帶標記。 有可能使用核酸序列本身作為標記，例如以特異性地檢測頭部序列(其中尾部被捕獲)或尾 部序列(其中頭部被捕獲)的存在或檢測為待檢測的核酸分子獨有的定制序列。互補寡核苷 酸可用于檢測。或者，核酸可攜帶異源標記如熒光團。異源標記不是核酸本身的一部分。可 使用的其他標記包括量子點、生物發光、產生信號的酶級聯像酪酰胺信號放大以及放射性 部分。所述方法然后可包括檢測標記的存在，例如，分別檢測熒光、檢測量子點、檢測生物發 光、檢測由酶產生的信號或檢測放射性。
[0135] 作為一個實例，檢測是否存在雙重連接的產物的步驟可包括經由捕獲部分將探針 的主鏈寡核苷酸捕獲在基質上，洗滌所述基質以除去未連接的探針并且保留包含所述基質 和捕獲的主鏈寡核苷酸的捕獲部分以及針對所捕獲級分中雙重連接的產物的存在進行測 試。其中，雙重連接的產物攜帶標記，這可包括針對所捕獲級分中標記的存在進行測試。所 述捕獲部分可以是對鏈霉親和素基質具有親和力的生物素分子。其他適合的親和標簽包括 對固定的金屬離子具有親和力的聚組氨酸標簽，如可用于含組氨酸序列（例如，主鏈寡核苷 酸)的純化的鈷、鎳、銅。捕獲部分因此可以是待捕獲的序列的一部分，例如His標簽序列，或 者它可以是不是核酸本身的一部分的異源部分。
[0136] 合適的固體基質是珠粒(例如磁珠）以有助于使用磁鐵富集所捕獲的產物。所述基 質可用捕獲部分的結合成員涂覆，例如可用生物素化的探針一起使用的鏈霉親和素涂覆的 磁珠。
[0137] 本發明方法的一些實施方案的優點在于，它不依賴于核酸測序，也不依賴于PCR， 這將導致偏倚性結果，因為一些序列比其他序列更有效地擴增。但任選地，檢測可包括通過 對產物進行測序驗證所連接的片段的身份的步驟。本發明的優點之一是，通過在雙重連接 的產物中并入實際靶片段，可對產物進行測序以確認所述探針與正確的靶標反應。這是相 較于基于雙重連接如US20130172212(Ariosa)的其他方法的優點。
[0138] 多重反應
[0139] 多個不同的靶核酸片段可使用多個探針并行檢測。例如，片段化染色體的樣本可 與用于結合染色體的多個片段的一組探針相接觸，其中所述組中的每個探針用于結合對所 述染色體特異的不同靶片段。所述探針可共有共同定制序列，所述定制序列可用作條形碼 以鑒別特異性地結合所述染色體的探針。多重反應可包括多重靶向寡核苷酸和一個共同主 鏈寡核苷酸，但還包括幾組靶向寡核苷酸，其中每個子組與單獨的主鏈寡核苷酸雜交。
[0140] 多個探針可用于提供可檢測的信號，其中信號的幅值與識別其靶片段的探針的數 目成比例。來自所述多個探針的單獨信號被轉換成單個累積可檢測信號，從而通過多重探 測擴增單獨信號。十個或更多個探針產生十倍或更多的信號放大。所產生的信號取決于在 靶標識別時正確地反應的探針，從而使用序列特異性雜交和連接來產生雙重連接的特異性 產物，從所述產物獲得信號。
[0141] 識別其靶片段的每個探針產生連接產物，并且由每個探針雜交產生的連接產物可 以是單獨可檢測的，以使得單獨信號可從每個獲得。然而，本發明的優良特征是這些單獨信 號不需要單獨地檢測，而是被合并成累積信號并且檢測所述累積信號。累積信號是單獨信 號的組合，并且因此可用于檢測和/或定量連接產物，從而表示所研究的核酸種類的存在或 量。相較于涉及測序和微陣列的方法，本發明方法的一些實施方式允許探針信號的早期合 并，其中單獨信號跨一個區域針對多個探針產生，并且然后所述信號在分析中合以表示一 個區域。所述信號可在檢測之前合并，以使得單獨信號不單獨映射或查詢。這實現更簡單的 讀出格式。
[0142] 單獨信號可從作為探針每個靶片段雜交的結果形成的雙重連接的每種產物獲得。 因此，例如，在一組探針包含識別樣本中的目標物種的10個靶片段的10個不同探針的情況 下，將存在包含連接接合點的10種連接產物，并且可檢測累積信號，所述累積信號是來自10 種連接產物的單獨信號的組合。當然，在此實例中，分子探針、靶片段和連接產物的實際數 目可高于10,因為通常將存在樣本中的每個靶片段的多個拷貝并且所述樣本將與每個探針 的多個拷貝相接觸。
[0143] 通過多重反應信號放大的方法可用于檢測樣本中的目標核酸種類，例如其中一個 核酸種類是復雜核酸樣本中的次要或痕量組分。通過多重反應擴增實現可靠檢測。這可用 于例如出于診斷目的檢測樣本(如患者樣本）中的微生物核酸。樣本可用對多種種類的微生 物核酸具有特異性的探針進行探測以檢測且鑒別存在的那些。這適用于檢測傳染性疾病的 媒介物，如細菌、病毒和真菌。可檢測特異性核酸轉錄物。通過多重反應擴增也可用于定量 核酸種類。通過探測兩種或更多種類的核酸一一一個或多個目標種類和一個或多個參考核 酸種類一一所述方法實現樣本中的兩種種類的相對量的定量。當應用于染色體或染色體基 因座的檢測或定量，例如用于染色體拷貝數檢測時所述方法是特別有用的。特定值的一種 應用是使用所述方法用于鑒定染色體缺陷，包括用于診斷癌癥和先天性非整倍體。具體地 描述用于無創產前診斷(NIPT)的用途。
[0144] 樣本中的核酸的種類可通過使樣本與根據本發明的一組探針相接觸來檢測，其中 每個探針特異性地識別待檢測的核酸種類中的不同靶序列。靶序列對應于所述核酸種類的 靶片段。通過每個探針識別每個靶序列產生如本文所述的雙重連接的產物。然后能夠檢測 累積信號，這是來自所述產物的信號的組合。信號的檢測指示所述樣本中所述核酸種類的 存在。所述核酸種類可通過定量累積信號以測定信號水平來進行定量，其中所述信號水平 與所述樣本中核酸種類的量成比例，并且由此測定所述樣本中的核酸種類的量。可通過使 樣本與第一組探針和第二組探針相接觸來相對于第二或參考核酸種類定量第一核酸種類， 其中所述第一組探針各自特異性地識別所述第一核酸種類內的不同靶序列，并且其中所述 第二組探針各自特異性地識別所述第二或參考核酸種類內的不同靶序列。檢測第一和第二 累積信號，所述第一累積信號是來自由識別其靶序列的第一組探針產生的產物的單獨信號 的組合，并且第二累積信號是來自由識別其靶序列的第二組探針產生的產物的單獨信號的 組合。對所述第一和第二信號進行定量以分別測定第一和第二信號水平，這些與所述樣本 中的第一和第二核酸種類的量成比例。所述樣本中的第一和第二核酸種類的相對量因此可 通過比較第一和第二信號水平來確定。
[0145] 例如，累積信號可以是識別其靶序列的探針的克隆擴增和/或標記的產物(例如滾 環擴增的產物）的總結列舉，或從所有產物發出的熒光信號，其中每種產物發射熒光信號。 為了定量多個核酸種類的相對量，不同的信號用于每個種類，例如一組探針的產物可發射 相較于另一組探針的產物不同的熒光波長或光譜。
[0146] 樣本中的核酸種類可在一種方法中進行檢測，所述方法包括
[0147] 使所述樣本與一組探針相接觸，其中每個探針特異性地識別所述待檢測的核酸種 類內的不同靶序列，
[0148] 提供變性條件，在所述條件下所述核酸種類中的靶序列為單鏈，
[0149] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下所述探針雜交至其靶序列并且產生連 接產物，以及
[0150]檢測累積信號，所述累積信號是來自所有連接產物的單獨信號的組合，
[0151]其中所述信號的檢測指示所述樣本中所述核酸種類的存在。
[0152] 所述樣本、靶核酸、方法步驟(例如，變性、退火、連接）以及探針的細節在本文其他 地方描述。所述方法可包括：
[0153] (i)提供樣本，其中所述核酸種類被片段化成靶片段，
[0154] (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈
[0155] (iii)使所述樣本與一組探針相接觸，其中每個探針特異性地識別所述待檢測的 核酸種類內的不同靶序列，其中所述靶序列是所述靶片段的序列，并且其中每個探針包含
[0156] 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0157] 分別具有游離的5'末端和3'末端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾 部序列分別與所述上游側翼序列和下游側翼序列互補，
[0158] (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜 交，并且靶片段(如果存在)與所述探針的靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的末端定 位成與所述頭部序列的5 '端和所述尾部序列的3 '端并置
[0159] (v)提供用于連接的條件，以使得如果存在靶片段，則將所述靶片段的3'端連接至 所述頭部序列的5'端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的5'端連接至所述尾部序 列的3 '端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述產物包含核酸的連續鏈， 所述核酸包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段，以及
[0160] (vi)檢測累積信號，所述累積信號是來自所有產物的單獨信號的組合，
[0161]其中所述信號的檢測指示所述樣本中所述核酸種類的存在。
[0162] 所述核酸種類可通過一種方法來定量，所述方法包括
[0163] (i)提供樣本，其中所述核酸種類被片段化成靶片段
[0164] (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈
[0165] (iii)使所述樣本與一組探針相接觸，其中每個探針特異性地識別所述待定量的 核酸種類內的不同靶片段，其中每個探針包含
[0166] 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0167] 分別具有游離的5'末端和3'末端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾 部序列分別與所述上游側翼序列和下游側翼序列互補，
[0168] (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜 交，并且靶片段(如果存在)與所述探針的靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的末端定 位成與所述頭部序列的5 '端和所述尾部序列的3 '端并置
[0169] (v)提供用于連接的條件，以使得如果存在靶片段，則將所述靶片段的3'端連接至 所述頭部序列的5'端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的5'端連接至所述尾部序 列的3 '端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述產物包含核酸的連續鏈， 所述核酸包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段，
[0170] (vi)檢測累積信號，所述累積信號是來自所有連接產物的單獨信號的組合，以及
[0171] (vii)定量所述累積信號以測定信號水平，其中所述信號水平與所述樣本中的所 述核酸種類的量成比例，以及
[0172] 由此測定所述樣本中的所述核酸種類的量。
[0173] 所述方法可用于相對于樣本中的第二核酸種類定量第一核酸種類。所述方法可包 括：
[0174] (i)提供樣本，其中所述第一和第二核酸種類被片段化成靶片段
[0175] (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈
[0176] (iii)使所述樣本與第一組探針和第二組探針相接觸，其中所述第一組探針特異 性地識別所述第一核酸種類的不同靶片段，并且其中所述第二組探針特異性地識別所述第 二核酸種類的不同靶片段，其中每個探針包含
[0177] 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0178] 分別具有游離的5'末端和3'末端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾 部序列分別與所述上游側翼序列和下游側翼序列互補，
[0179] (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜 交，并且靶片段(如果存在)與所述探針的靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的末端定 位成與所述頭部序列的5 '端和所述尾部序列的3 '端并置
[0180] (v)提供用于連接的條件，以使得如果存在靶片段，則將所述靶片段的3'端連接至 所述頭部序列的5'端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的5'端連接至所述尾部序 列的3 '端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述產物包含核酸的連續鏈， 所述核酸包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段，
[0181] (vi)檢測第一累積信號，所述第一累積信號是來自由所述第一組探針產生的連接 產物的單獨信號的組合;并且定量所述第一累積信號以測定第一信號水平，其中所述第一 信號水平與所述樣本中的所述第一核酸種類的量成比例，
[0182] (vii)檢測第二累積信號，所述第二累積信號是來自由所述第二組探針產生的連 接產物的單獨信號的組合;并且定量所述第二累積信號以測定第二信號水平，其中所述第 二信號水平與所述樣本中的所述第二核酸種類的量成比例，以及
[0183] (viii)比較所述第一和第二信號水平，從而測定所述樣本中的第一和第二核酸種 類的相對量。
[0184] -般來說，探針的數目將是針對待檢測或定量的每個核酸種類至少十。數目當然 是指不同探針的數目，而不是探針的分子的絕對數目。因此，所述核酸將包含至少十種不同 的特異性靶序列，并且所述累積信號是至少十個獨特探針的單獨信號的組合，所述累積信 號表示一種核酸種類。高水平的多重可用于相應地獲得高水平的信號擴增。例如，至少1〇〇、 至少1，000、至少10,000或甚至更大數目的探針可用于待檢測或定量的每種核酸種類。
[0185] 所述方法可包括使片段化的染色體的樣本與用于結合兩條或更多條染色體的多 個片段的多組探針相接觸，其包括：
[0186] 用于結合對第一染色體特異的多個靶片段的第一組探針，以及
[0187] 用于結合對第二染色體特異的多個靶片段的第二組探針，以及任選地
[0188] 用于結合對一條或多條另外的染色體特異的多個靶片段的一組或多組另外的探 針。
[0189] -組內的探針可共有定制序列，所述定制序列是所述組共同的并且不同于其他組 中的探針的定制序列，從而允許方便地鑒別來自各組的探針。每組探針可包含用于結合對 所述染色體特異的多個靶片段的至少500、600、700、800、900或至少1，000個不同的探針。例 如，一種方法可分別使用染色體21、13和18中的每種的1，000種不同的靶向寡核苷酸，以及 三種不同的主鏈寡核苷酸，每種用于每個染色體子組。
[0190] 有可能通過檢測針對每組探針的雙重連接的產物并且檢測所述產物中的定制序 列的相對量來測定樣本中的兩條或更多條染色體的相對量。
[0191] 使用其中靶向寡核苷酸以及上游和下游寡核苷酸形成環的探針，編碼特異性等位 基因和或基因座的基序可在尚多重中并入定制序列。
[0192] 數字染色體核型分析和無創產前診斷學
[0193] 本發明方法的一些實施方案能夠提供其中尋求靶DNA的精確定量的領域中的特定 優點。這包括多種基于核酸的診斷技術。這樣一種領域是分析來自患者的生物樣本(例如血 液)中的癌癥DNA的分析。另一這種領域是通過分析無細胞DNA的無創產前診斷學(NIPT)。
[0194] NIPT的一個挑戰是必須對大量特異性基因組片段進行計數以便實現診斷異常染 色體非整倍體(染色體拷貝數差異)所需的統計置信。由于胎兒DNA與母體DNA混合，構成孕 婦血流中遺傳物質的4%-30%，觀察胎兒DNA中的染色體非整倍性需要非常精確的測量。
[0195] 本文所述的探針可用于分析母體血液樣本中的游離環化胎兒DNA。通過使用針對 一條染色體的不同片段的多個探針和針對第二染色體的不同片段的多個探針，所述探針實 現以高置信度測定所述樣本中的兩條染色體的相對數量的不平衡。這允許甚至針對母體 DNA的高背景從胎兒DNA診斷染色體非整倍性，如三體性。
[0196] 本文所描述的探針可用于測試來自孕婦的母體血液樣本來檢測胎兒核酸以用于 診斷染色體異常如三體，從而針對腫瘤DNA測試患者樣本以用于診斷或監測患者中腫瘤的 存在。其他用途包括針對微生物核酸的存在測試材料的樣本，其中檢測到所述微生物核酸 指示材料被微生物感染，所述微生物可以是感染劑如細菌、病毒或真菌。所述樣本可以是來 自患者的組織或血液樣本。
[0197] 更一般地，通過使用數百或數千個不同的探針，本發明的方法可通過檢測數百或 數千個特異性核酸片段來實現高精確度，從而在一系列診斷應用中提供優點。檢測來自與 特定疾病相關的染色體或染色體基因座的大量DNA片段實現相對于對照染色體或基因座測 量所述染色體或基因座的量，以使得能夠確信地檢測樣本中的甚至輕微差異。
[0198] 通過分析短靶片段，可以高效率分析母體血液中的一大部分高度片段化的無細胞 DNA。這是重要的，因為非常少量的無細胞DNA可在母體血液中獲得。
[0199] -種相對于從個體獲得的核酸樣本中的第二染色體或染色體基因座定量第一染 色體或染色體基因座的方法可包括
[0200] (i)提供樣本，其中所述第一和第二染色體或染色體基因座被片段化成靶片段
[0201] (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈
[0202] (iii)使所述樣本與第一組探針和第二組探針相接觸，其中所述第一組探針特異 性地識別所述第一染色體的不同靶片段，并且其中所述第二組探針特異性地識別所述第二 染色體的不同靶片段，其中每個探針包含
[0203]靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0204] 分別具有游離的5'末端和3'末端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾 部序列分別與所述上游側翼序列和下游側翼序列互補，
[0205] (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜 交，并且靶片段(如果存在)與所述探針的靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的末端定 位成與所述頭部序列的5 '端和所述尾部序列的3 '端并置
[0206] (v)提供用于連接的條件，以使得如果存在靶片段，則將所述靶片段的3'端連接至 所述頭部序列的5'端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的5'端連接至所述尾部序 列的3 '端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述產物包含核酸的連續鏈， 所述核酸包含所述頭部序列和尾部序列以及所述靶片段，
[0207] (vi)檢測第一累積信號，所述第一累積信號是來自由所述第一組探針產生的連接 產物的單獨信號的組合;并且定量所述第一累積信號以測定第一信號水平，其中所述第一 信號水平與所述樣本中的所述第一染色體或染色體基因座的量成比例，
[0208] (vii)檢測第二累積信號，所述第二累積信號是來自由所述第二組探針產生的連 接產物的單獨信號的組合;并且定量所述第二累積信號以測定第二信號水平，其中所述第 二信號水平與所述樣本中的所述第二染色體或染色體基因座的量成比例，以及
[0209] (viii)比較所述第一和第二信號水平，從而測定所述樣本中的第一和第二染色體 或染色體基因座的相對量。
[0210] 所述方法可用于診斷胎兒中的非整倍性(例如三體性），其中所述核酸樣本是從母 體血液獲得的樣本并且包含與母體DNA混合的無細胞胎兒DNA，并且其中所述第一和第二信 號水平的不等比例指示非整倍性(例如三體性）。
[0211] 探針
[0212] 其他方面包括適合于在本發明方法中使用的探針。探針及其特征的實例已在上文 進行了描述。在此描述一些另外特性和實例。
[0213] 探針核酸優選地是DNA。然而，它可以是另一種核酸，天然存在的或非天然存在的。 DNA的標準堿基是A、T、C和G，但探針核酸可任選地包含非標準核苷酸。
[0214] -般而言，根據本發明的探針包含靶向寡核苷酸以及頭部序列和尾部序列。所述 頭部序列和尾部序列可以是靶向寡核苷酸的一部分，或者它們中的一者或兩者可在不同的 核酸分子上。任選地，所述探針包含靶向寡核苷酸、包含頭部序列的主鏈寡核苷酸以及包含 尾部序列的主鏈寡核苷酸。因此，探針可包含呈其非連接形式的一個、兩個或三個核酸分 子。
[0215] 所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列，以使得所述靶向 寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側翼序列與下游側 翼序列之間的雙鏈序列。所述頭部序列和尾部序列分別具有游離的5'端和3'端，并且分別 與所述上游側翼序列和下游側翼序列互補。在退火條件下在靶片段存在下，所述頭部序列 和尾部序列與所述側翼序列雜交，從而在所述頭部序列的5'端與所述尾部序列的3'端之間 限定空位，其中所述靶片段與靶標互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的末端 定位成與所述頭部序列的5 '端和所述尾部序列的3 '端并置。
[0216] 所述探針可被設計成使得在所述空位中的靶片段的雜交完成核酸的環，所述環包 含靶片段以及頭部序列和尾部序列。
[0217] 所述探針的頭部序列和/或尾部序列優選地連接至不與探針的其他區域或與靶片 段互補的定制序列。
[0218] 在所述探針的一些實施方案中，單個核酸分子包含頭部序列和尾部序列。
[0219] 所述頭部序列和尾部序列可與靶向寡核苷酸隔開以使得它們反式結合至側翼序 列。例如，所述頭部序列和尾部序列可分別在主鏈寡核苷酸的5'端和3'端。定制序列可包括 在主鏈寡核苷酸的頭部序列與尾部序列之間。這種探針的實例在圖1和圖3中示出。或者，所 述主鏈寡核苷酸的頭部序列和尾部序列可以是相鄰的，不具有插入核苷酸序列。在這種情 況下，靶向寡核苷酸的側翼序列沿著主鏈寡核苷酸的全長雜交并且可以使它環化。
[0220] 所述探針可被設計成使得頭部序列是靶向寡核苷酸的5'端和/或尾部序列是靶向 寡核苷酸的3'端，以使得所述空位中的靶片段的雜交完成核酸的鏈，所述核酸包含靶片段、 頭部序列和尾部序列、靶標互補序列以及側翼序列。所述頭部序列和尾部序列可在靶向寡 核苷酸的末端處并且順式結合至側翼序列。這種探針的實例在圖4中示出。在探針的這種型 式中，頭部序列和尾部序列以及靶標互補序列全部變得與靶片段環化。定制序列可被定位 在寡核苷酸的環中。探針核酸相對較長，但具有將寡核苷酸結構連接成預組裝的一個分子 并且不需要不同探針核酸分子的雜交的優點。
[0221] 探針也可被設計成具有主鏈寡核苷酸，所述主鏈寡核苷酸是來自靶向寡核苷酸的 核酸的單獨分子。尾部序列可以是靶向寡核苷酸的3'端，并且頭部序列可以是主鏈寡核苷 酸的5'端。或者，頭部序列可以是靶向寡核苷酸的5'端，并且尾部序列可以是主鏈寡核苷酸 的3'端。定制序列可被引入靶向寡核苷酸中，例如以在所述頭部或尾部序列與側翼序列之 間提供環。使用這種探針方法的一個優點是檢測序列可被引入所述環中并且與靶標互補序 列締合，這對于多重方法來說可以是有利的，尤其是利用高重檢測方案的更高多重。主鏈寡 核苷酸還可包含定制序列。通過在兩種寡核苷酸中提供探針，所述探針核酸分子比單一寡 核苷酸型式短，但維持相同的功能。
[0222] 探針的另一種設計在兩種主鏈寡核苷酸上提供頭部和序列尾部序列。因此，所述 探針包含
[0223] 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，
[0224] 包含具有游離5'端的頭部序列的主鏈寡核苷酸，以及
[0225] 包含具有游離3'端的尾部序列的主鏈寡核苷酸，
[0226]其中所述頭部和尾部寡核苷酸序列分別與上游和下游側翼序列互補。
[0227] -種主鏈寡核苷酸可攜帶捕獲部分，在這種情況下另一主鏈寡核苷酸用于檢測并 且可攜帶異源標記。一種或兩種主鏈寡核苷酸還可包含定制序列。可替代地或另外地，靶向 寡核苷酸可包含定制序列。
[0228] 在退火條件下在靶片段存在下，所述頭部序列和尾部序列與所述側翼序列雜交， 從而在所述頭部序列的5'端與所述尾部序列的3'端之間限定空位，其中所述靶片段與靶標 互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的末端定位成與所述頭部序列的5'端和所 述尾部序列的3'端并置。所述空位中的靶片段的雜交完成包含所述靶片段以及所述頭部和 尾部序列的核酸的鏈。所述鏈攜帶所述捕獲部分和所述標記，從而允許使用本文其他地方 所述的捕獲/檢測方法進行檢測。
[0229] 試劑盒和探針組
[0230] 本公開的另一方面是用于結合單鏈靶核酸片段的探針組，所述探針組包括多個探 針，所述探針具有用于結合多個不同靶片段的多個不同的靶標互補序列。
[0231] 所述探針組可用于結合人染色體的多個片段，其中所述組中的每個探針用于結合 對所述染色體特異的不同靶片段。所述探針可全部包含共同定制序列作為靶向寡核苷酸的 一部分或作為主鏈寡核苷酸的一部分。
[0232] 多組探針可被提供用于結合兩種或更多種人染色體的不同片段，其包括：
[0233] 用于結合對第一染色體特異的多個靶片段的第一組探針，以及
[0234] 用于結合對第二染色體特異的多個靶片段的第二組探針，以及任選地
[0235] 用于結合對一條或多條另外的染色體特異的多個靶片段的一組或多組另外的探 針。一組內的探針可共有定制序列，所述定制序列是所述組共同的并且不同于其他組中的 探針的定制序列。
[0236] 還可提供試劑盒，所述試劑盒包含在一個或多個容器中的溶液中的多組探針。
[0237] 用途
[0238] 本文所述的探針、探針組和試劑盒可用于針對靶核酸片段的存在測試樣本。它們 可用于在體外鑒別片段化核酸的樣本中的限定靶片段的存在。
[0239] -方面包括使用探針用于針對靶單鏈核酸片段的存在測試樣本，
[0240]其中所述探針包含靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸含有為靶片段的精確互補序 列的序列；以及頭部和尾部寡核苷酸序列，所述頭部和尾部寡核苷酸序列鄰近所述靶向寡 核苷酸上的靶片段雜交，
[0241] 其中所述靶片段與所述探針之間的雜交使靶片段模板化用于連接至頭部序列和 尾部序列。
[0242] 這類探針及其在測試樣本的方法中的用途的實例在本文其它地方更詳細地描述。 用途包括測試來自孕婦的母體血液樣本來檢測胎兒核酸以用于診斷染色體異常如三體性， 并且針對腫瘤DNA測試患者樣本以用于診斷或監測患者中腫瘤的存在。其他用途包括針對 微生物核酸的存在測試材料的樣本，其中所述微生物核酸的檢測指示材料被微生物感染， 所述微生物可以是傳染劑如細菌、病毒或真菌。所述樣本可以是來自患者的組織或血液樣 本。 實施例
[0243] 提供以下實施例以便展示且進一步說明本發明的某些實施方案和方面并且不應 被解釋為限制其范圍。
[0244] 實施例1
[0245] 適合用于進行圖1中所示的方法的方案如下：
[0246] 1)將10ng的DNA在相應的相容限$1」酶緩沖液中用1單位的限$1」酶消化。將反應在37 °C下孵育1小時，接著在80 °C下酶失活20分鐘。2)將DNA片段在95 °C下持續10分鐘變性為單 鏈片段并且與探針和連接酶混合以形成環。以10pM單獨濃度添加探針集合連同1U的 AmpligasdEpicentre)并且在55°C下在連接酶緩沖液中孵育1小時。3)添加1U外切核酸酶 以除去未反應的探針和片段。將I U的λ外切核酸酶(Epicentre)在37°C下持續1小時添加在 相應的外切核酸酶緩沖液中，接著在80°C下酶失活20分鐘。4)將剩余的環通過RCA擴增。將 1U的phi29聚合酶(New England Biolabs)在37°C下持續1小時添加在相應的phi29緩沖液 和核苷酸(dNTP)中。
[0247] 實施例2
[0248] 適合用于進行圖2中所示的方法的方案如下：
[0249] 1)將10ng的DNA在相應的相容限$1」酶緩沖液中用1單位的限$1」酶消化。將反應在37 °C中孵育1小時，接著在80°C下酶失活20分鐘。2)將DNA片段在95°C下持續10分鐘變性為單 鏈片段并且與探針和連接酶混合以形成線性連接產物。以10pM單獨濃度添加探針集合連同 1U的Ampligase(Epicentre)并且在55°C下在連接酶緩沖液中孵育1小時。3)將連接產物捕 獲在磁性鏈霉親和素珠粒上。為了除去未反應的探針和片段，將溶液與l〇ml M-280鏈霉親 和素涂覆的磁珠（Invitrogen)在200ml最終體積中的Tris-HCl(pH 7.5)、3.5mM EDTA和 0.07 % Tween-20中混合，并且在室溫下孵育15分鐘。在孵育之后，使用環形磁鐵收集珠粒， 并且除去上清液。
[0250] 實施例3
[0251] 材料和方法
[0252] 樣本準備:將來自每個受試者的10ml血液收集到無細胞DNA管(Streck，Omaha，NE) 中。通過雙重離心方案（1600g持續10分鐘，接著在第一旋轉之后管轉移之后16 000g持續10 分鐘）從血液分離血衆。根據制造商的方案通過Qiagen ccf核酸試劑盒(Qiagen，Hilden, Germany)分離cf DNA。將所得DNA在50ul的緩沖液(Qiagen試劑盒的一部分）中洗脫。
[0253] 探針和主鏈設計:本文所述的多重探針技術實現數千個染色體片段的特異性和同 時擴增。將探針設計成捕獲來自染色體21、18和13中的每種的2500-5000個片段(靶標）。靶 標被選擇為在基因組中具有獨特序列，均勻的AT/GC組成，在靶序列中不包含已知的多態性 也不包含CNV，以及18-35bp之間的大小。將靶向來自每條染色體13和18的2500個片段的探 針與靶向來自染色體21的片段的5000個探針匯集在一起以產生單個寡核苷酸探針集合。
[0254] 探針的示例性序列，" N "表示靶標互補序列：
[0255] 具有與探針的末端互補的頭部序列和尾部序列的主鏈被設計成包含用于測序和 數字計數的序列基序。將兩個主鏈用于在結果部分中概述的實驗中；與靶向染色體13和18 的探針互補的一個主鏈 ：（/ 5 P h 〇 s /
SEQ ID N0:2，以及靶向染色體21的一個主鏈：（/5Phos/
[0256] 生物化學探針方案：將50ul的純化cfDNA用55ul總體積中的lx NEB4緩沖液（New England Biolabs)和lx BSA中的5U MseI(New England Biolabs)在37°C下消化30分鐘，接 著在65°C下熱失活20分鐘。然后將消化的DNA與連接混合物連同探針和主鏈一起混合。將 55ul的消化的DNA與探針（ΙρΜ/探針）、主鏈(各自60nM)、lx連接緩沖液(Epicentre)、100U的 Ampligase(Epicentre)、ImM NAD以及5mM Mg2+混合至70ul的總體積。將消化的片段首先在 95 °C下在5分鐘內首先變性為單鏈DNA，接著在16小時內55 °C雜交和連接。然后將連接混合 物用外切核酸酶處理以除去任何剩余的線性DNA分子。將連接反應與75ul總體積的20U的 ExoI(NEB)和5U的ExoIII(NEB)以及lx BSA tot在37°C下混合持續60分鐘，接著在65°C下熱 失活10分鐘。
[0257] 分析:對于測序分析，將外切核酸酶處理的環用與Illumina測序儀器互補的測序 引物擴增并且隨后根據制造商方案負載在Illumina Miseq儀器上。
[0258] 對于數字分析，使外切核酸酶處理的反應經受滾環擴增反應(RCA)以產生所述環 的多聯體拷貝的離散DNA目標物。將37，5u 1的外切核酸酶處理的環與50u 1總體積中的4mM DTT、3U的phi29聚合酶(NEB)、0，luM引物、ImM dNTP混合物(NEB)以及lx BSA混合，并且在37 °C下孵育1小時，接著在65°C下熱失活10分鐘。然后將RCA反應用與主鏈序列互補的熒光標 記的寡核苷酸標記。將50u 1的RCA產物與100ul總體積中的0，1 % Tween 20 (Sigma)、5nM標記 的寡核苷酸以及2 x S S C ( S i g m a)混合。將標記的R C A產物最終沉積在涂覆有聚賴氨酸 (Sigma)的顯微鏡載玻片上并且在熒光顯微鏡中計數。
[0259] 莖里
[0260]在Illumina測序和數字計數系統上證明本文所述的探針方法。為了證明探針方法 的性能，將具有三體21的DNA樣本與不同濃度的從正常血漿樣本(3-5ml血漿)提取的DNA混 合。然后使樣本進行探針方法，并且通過測序進行評價。
[0261] 對于在圖8中所示的結果，使lOOng的細胞系DNA經受上述方案。將10,000個探針在 集合中混合以特異性地環化來自染色體13、18和21的10,000個對應染色體片段。然后將10， 〇〇〇個所得環用Illumina-對應PCR引物進行擴增且在測序之前在凝膠上進行分析。泳道1對 應于DNA梯度，泳道2在消化之后的DNA樣本，以及泳道3具有10,000個擴增的片段的PCR產 物。
[0262] 對于圖9、12中所示的結果，將正常血漿樣本與不同濃度的攜帶具有三體21的DNA 的樣本并行分析。提取DNA并且通過ΙΟΚ-plex探針方案進行處理，且最后在Illumina測序儀 上測序。使用提供99%特異性的置信區間，基于所估計的正常分布以90%靈敏度檢測陽性 樣本。
[0263] 為了證明將靶向片段轉化成標記的DNA目標物的原理，將具有三體21的10 %的DNA 添加至20ng正常細胞系DNA中且進行探針方法。將所得到的標記的RCA產物隨機沉積在顯微 鏡載玻片上并且計數。將靶向源自染色體21的探針用一種顏色標記并且將靶向源自染色體 13和18的片段用參考顏色標記。這些結果在圖10中示出。圖10的圖(A)示出來自顯微鏡的圖 像，示出標記的和檢測的RCA產物。通過用一種熒光團標記來自染色體13的所有片段并且用 第二熒光團標記來自參考染色體的片段，可實現比率測量。圖（B):將20ng的DNA通過10K-?161探針方案進行處理并且轉化成標記的此4-產物。將扣4-產物與攜帶三體210嫩的10% 添加的樣本并行分析。將12種正常DNA樣本(樣本#1-12)與三種陽性樣本(樣本#13-15)并行 分析。
[0264] 進一步描述
[0265] 以下條款是說明書的一部分。
[0266] 1. -種針對靶核酸片段的存在測試樣本的方法，所述方法包括：
[0267] (i)提供片段化核酸的樣本
[0268] (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈
[0269] (iii)使所述樣本與核酸探針相接觸，所述核酸探針包含
[0270] 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0271] 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和所述尾 部序列分別與所述上游側翼序列和所述下游側翼序列互補，
[0272] (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和所述尾部序列與所述側翼序列 雜交，并且所述靶片段(如果存在)與所述靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的所述末 端定位成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置
[0273] (v)提供用于連接的條件，以使得如果存在所述靶片段，則將所述靶片段的所述3' 端連接至所述頭部序列的所述5 '端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的所述5 '端 連接至所述尾部序列的所述3'端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述 產物包含核酸的連續鏈，所述核酸包含所述頭部序列和所述尾部序列以及所述靶片段，以 及
[0274] (vi)檢測是否存在所述雙重連接的產物，
[0275] 其中檢測到所述雙重連接的產物指示所述樣本中所述靶片段的存在。
[0276] 2.根據條款1所述的方法，其中所述片段化核酸的樣本是限制酶消化產物并且所 述靶片段是限制片段。
[0277] 3.根據條款1或條款2所述的方法，其中所述頭部序列的所述5'端和所述靶片段的 所述3 '端與所述靶向寡核苷酸的相鄰核苷酸雜交，并且所述尾部序列的所述3 '端和所述靶 片段的所述5'端與所述祀向寡核苷酸的相鄰核苷酸雜交。
[0278] 4.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述檢測所述雙重連接的產物的步驟 包括提供用于跨所述核酸的連續鏈的所述第一連接接合點和所述第二連接接合點擴增的 條件，并且檢測是否存在擴增產物。
[0279] 5.根據前述條款中任一項所述的方法，其中包含所述頭部序列和所述尾部序列以 及所述靶片段的所述核酸的連續鏈是核酸的環。
[0280] 6.根據條款5所述的方法，其中所述檢測所述雙重連接的產物的步驟包括提供用 于滾環復制的條件并且檢測是否存在滾環復制的產物。
[0281 ] 7.根據條款6所述的方法，其中所述滾環復制是超支化滾環復制。
[0282] 8.根據條款5至7中任一項所述的方法，其中所述探針包含在一個核酸分子上的所 述頭部序列和所述尾部序列。
[0283] 9.根據條款8所述的方法，其中所述探針包含分別在其5'端、3'端具有所述頭部序 列和所述尾部序列的主鏈寡核苷酸，其中所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列和所述尾部序 列在所述退火條件下反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述側翼序列。
[0284] 10.根據條款9所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含在所述頭部序列與所述尾 部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互 補。
[0285] 11.根據條款9所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列和所述尾部序 列是相鄰的。
[0286] 12.根據條款5至8中任一項所述的方法，其中所述頭部序列和所述尾部序列在所 述靶向寡核苷酸的末端處并且在所述退火條件下順式結合至所述側翼序列。
[0287] 13.根據條款12所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述靶向寡核苷酸與 所述頭部和/或尾部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或 與所述靶片段互補。
[0288] 14.根據條款1至7中任一項所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸 的所述3 '端，并且所述探針包含具有在其5 '端的所述頭部序列的主鏈寡核苷酸，
[0289] 其中在所述退火條件下，所述尾部序列順式結合至所述靶向寡核苷酸的所述下游 側翼序列，并且所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述上 游側翼序列。
[0290] 15.根據條款14所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含一對反向重復序列，其中
[0291] 在所述退火條件下，所述反向重復序列形成發夾結構，從而將所述主鏈寡核苷酸 的所述3 '端定位成與所述靶向寡核苷酸的所述5 '端并置，并且其中
[0292] 在所述用于連接的條件下，所述靶向寡核苷酸的所述5'端被連接至所述主鏈寡核 苷酸的所述3'端，以使得所述雙重連接的產物是包含所述靶向寡核苷酸、所述靶片段和所 述主鏈寡核苷酸的核酸的環。
[0293] 16.根據條款1至7中任一項所述的方法，其中所述頭部序列在所述靶向寡核苷酸 的所述5 '端，并且所述探針包含具有在其3 '端的所述尾部序列的主鏈寡核苷酸，
[0294] 其中在所述退火條件下，所述頭部序列順式結合至所述靶向寡核苷酸的所述上游 側翼序列，并且所述主鏈寡核苷酸的所述尾部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述下 游側翼序列。
[0295] 17.根據條款16所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含一對反向重復序列，其中
[0296] 在所述退火條件下，所述反向重復序列形成發夾結構，從而將所述主鏈寡核苷酸 的所述5 '端定位成與所述靶向寡核苷酸的所述3 '端并置，并且其中
[0297] 在所述用于連接的條件下，所述靶向寡核苷酸的所述3'端被連接至所述主鏈寡核 苷酸的所述5'端，以使得所述雙重連接的產物是包含所述靶向寡核苷酸、所述靶片段和所 述主鏈寡核苷酸的核酸的環。
[0298] 18.根據條款14至17中任一項所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含在所述反 向重復序列之間的定制序列，以使得在所述退火條件下所述主鏈寡核苷酸形成發夾環。
[0299] 19.根據條款1至4中任一項所述的方法，其中包含所述頭部序列和所述尾部序列 以及所述靶片段的所述核酸的連續鏈是核酸的線性鏈。
[0300] 20.根據條款19所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸的所述3'端， 并且所述探針包含具有在其5'端的所述頭部序列的主鏈寡核苷酸，
[0301] 其中在所述退火條件下，所述尾部序列順式結合至所述靶向寡核苷酸的所述下游 側翼序列，并且所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述上 游側翼序列。
[0302] 21.根據條款14、15或20中任一項所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述 下游側翼序列與所述尾部序列之間的定制序列，以使得在所述退火條件下所述靶向寡核苷 酸形成發夾環。
[0303] 22.根據條款19所述的方法，其中所述頭部序列在所述靶向寡核苷酸的所述5'端， 并且所述探針包含具有在其3'端的所述尾部序列的主鏈寡核苷酸，
[0304]其中在所述退火條件下，所述頭部序列順式結合至所述靶向寡核苷酸的所述上游 側翼序列，并且所述主鏈寡核苷酸的所述尾部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述下 游側翼序列。
[0305] 23.根據條款16、17或22中任一項所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述 頭部序列與所述上游側翼序列之間的定制序列，以使得在所述退火條件下所述靶向寡核苷 酸形成發夾環。
[0306] 24.根據條款14至18或20至23中任一項所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸攜帶 捕獲部分。
[0307] 25.根據條款19所述的方法，其中所述探針包含含有具有游離5'端的頭部序列的 主鏈寡核苷酸；以及含有具有游離3'端的尾部序列的主鏈寡核苷酸，其中在所述退火條件 下所述頭部序列和所述尾部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述側翼序列。
[0308] 26.根據條款25所述的方法，其中一個或兩個主鏈寡核苷酸還包含定制序列，其中 所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互補。
[0309] 27.根據條款25或條款26所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸中的一個攜帶捕獲 部分。
[0310] 28.根據條款27所述的方法，其中所述另一主鏈寡核苷酸攜帶異源標記。
[0311] 29.根據條款28所述的方法，其中所述標記是熒光團。
[0312] 30.根據條款24或條款27至29中任一項所述的方法，其中所述檢測是否存在所述 雙重連接的產物的步驟包括經由所述捕獲部分將所述主鏈寡核苷酸捕獲在基質上，洗滌所 述基質以除去未連接的探針并且保留包含所述基質和捕獲的主鏈寡核苷酸的捕獲級分，以 及針對所述捕獲級分中所述雙重連接的產物的存在進行測試。
[0313] 31.根據條款28或條款29所述的方法，其中所述檢測是否存在所述雙重連接的產 物的步驟包括經由所述捕獲部分將所述主鏈寡核苷酸捕獲在基質上，洗滌所述基質以除去 未連接的探針并且保留包含所述基質和捕獲的主鏈寡核苷酸的捕獲級分，以及針對所述捕 獲級分中所述標記的存在進行測試。
[0314] 32.根據條款24或條款27至31中任一項所述的方法，其中所述捕獲部分是生物素。
[0315] 33.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述祀標互補序列具有10至30個核 苷酸的長度。
[0316] 34.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述靶標互補序列與所述靶片段具 有少于5個堿基對錯配。
[0317] 35.根據條款34所述的方法，其中所述靶標互補序列是所述靶片段的精確互補序 列。
[0318] 36.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述側翼序列各自具有10至30個核 苷酸的長度。
[0319] 37.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述上游側翼序列和所述下游側翼 序列彼此不同。
[0320] 38.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述頭部序列與所述上游側翼序列 具有少于5個堿基對錯配，并且所述尾部序列與所述下游側翼序列具有少于5個堿基對錯 配。
[0321] 39.根據條款38所述的方法，其中所述頭部序列是所述上游側翼序列的精確互補 序列，并且所述尾部序列是所述下游側翼序列的精確互補序列。
[0322] 40.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸是線性的。
[0323] 41.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述樣本是片段化的人染色體的樣 本，并且所述靶片段是對一條染色體特異的人基因組片段。
[0324] 42.根據條款41所述的方法，其中所述靶片段對所述人基因組的一個基因座特異。
[0325] 43.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述探針核酸是DNA。
[0326] 44.根據前述條款中任一項所述的方法，其中所述方法包括使用多個所述探針并 行多重測試多個不同的靶核酸片段。
[0327] 45.根據條款44所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色體的樣本與用于結 合染色體的多個片段的一組探針相接觸，其中所述組中的每個探針用于結合對所述染色體 特異的不同靶片段。
[0328] 46.根據條款45所述的方法，其中所述探針共有共同定制序列。
[0329] 47.根據條款44所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色體的樣本與用于結 合兩條或更條染色體的多個片段的多組探針相接觸，其中所述探針組包含：
[0330] 用于結合對第一染色體特異的多個靶片段的第一組探針，以及
[0331] 用于結合對第二染色體特異的多個靶片段的第二組探針，以及任選地
[0332] 用于結合對一條或多條另外的染色體特異的多個靶片段的一組或多組另外的探 針。
[0333] 48.根據條款47所述的方法，其中各組探針包含用于結合對所述染色體特異的多 個靶片段的至少500個不同的探針。
[0334] 49.根據條款47或條款48所述的方法，其中一組內的所述探針共有定制序列，所述 定制序列是所述子組共同的并且不同于其他組中的探針的所述定制序列。
[0335] 50.根據條款49所述的方法，其包括通過檢測針對每組探針的所述雙重連接的產 物并且檢測所述產物中的所述定制序列的相對量來測定所述樣本中的所述兩條或更多條 染色體的相對量。
[0336] 51.根據條款45至50中任一項所述的方法，其中所述一條或多條染色體是人的。
[0337] 52.-種用于結合單鏈靶核酸片段的核酸探針，其中所述探針包含
[0338]靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0339] 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和所述尾 部序列分別與所述上游側翼序列和所述下游側翼序列互補
[0340] 以使得在退火條件下在所述靶片段存在下，所述頭部序列和所述尾部序列與所述 側翼序列雜交，從而在所述頭部序列的所述5'端與所述尾部序列的所述3'端之間限定空 位，其中所述靶片段與所述靶標互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的所述末 端定位成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置，并且其中
[0341] 所述空位中的所述靶片段的雜交完成核酸的環，所述環包含所述靶片段以及所述 頭部序列和所述尾部序列。
[0342] 53.根據條款52所述的核酸探針，其中所述頭部和/或尾部序列被連接至定制序 列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互補。
[0343] 54.根據條款52或條款53所述的核酸探針，其中單個核酸分子包含所述頭部序列 和所述尾部序列。
[0344] 55.根據條款52或條款53所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列與所述 靶向寡核苷酸隔開，并且反式結合至所述側翼序列。
[0345] 56.根據條款55所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列分別在主鏈寡核 苷酸的5'端和3'端。
[0346] 57.根據條款56所述的探針，其中所述主鏈寡核苷酸包含在所述頭部序列與所述 尾部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互 補。
[0347] 58.根據條款56所述的探針，其中所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列和所述尾部 序列是相鄰的。
[0348] 59.-種用于結合單鏈靶核酸片段的核酸探針，其中所述探針包含
[0349] 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及
[0350] 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部寡核苷酸序列 和所述尾部寡核苷酸序列分別與所述上游側翼序列和所述下游側翼序列互補，
[0351] 以使得在退火條件下在所述靶片段存在下，所述頭部序列和所述尾部序列與所述 側翼序列雜交，從而在所述頭部序列的所述5'端與所述尾部序列的所述3'端之間限定空 位，其中所述靶片段與所述靶標互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的所述末 端定位成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置，并且其中
[0352] 所述頭部序列是所述靶向寡核苷酸的5'端和/或所述尾部序列是所述靶向寡核苷 酸的3'端，以使得所述空位中的所述靶片段的雜交完成核酸的鏈，所述核酸包含所述靶片 段、所述頭部序列和所述尾部序列、所述靶標互補序列以及所述側翼序列。
[0353] 60.根據條款52或條款59所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列在所述 靶向寡核苷酸的末端處，并且反式結合至所述側翼序列。
[0354] 61.根據條款52或條款59所述的探針，其中所述尾部序列是所述靶向寡核苷酸的 3'端，并且所述頭部序列是與所述靶向寡核苷酸隔開的主鏈寡核苷酸的5'端。
[0355] 62.根據條款52或條款59所述的探針，其中所述頭部序列是所述靶向寡核苷酸的 5'端，并且所述尾部序列是與所述靶向寡核苷酸隔開的主鏈寡核苷酸的3'端。
[0356] 63.根據條款61或條款62所述的探針，其中所述主鏈寡核苷酸還包含定制序列，其 中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互補。
[0357] 64.-種用于結合單鏈靶核酸片段的核酸探針，其中所述探針包含
[0358]靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列， 以使得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側 翼序列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，
[0359]包含具有游離5'端的頭部序列的主鏈寡核苷酸，以及 [0360]包含具有游離3'端的尾部序列的主鏈寡核苷酸，
[0361] 其中所述頭部寡核苷酸序列和所述尾部寡核苷酸序列分別與所述上游側翼序列 和所述下游側翼序列互補，并且其中
[0362] -種主鏈寡核苷酸攜帶捕獲部分并且另一主鏈寡核苷酸攜帶異源標記，
[0363] 以使得在退火條件下在所述靶片段存在下，所述頭部序列和所述尾部序列與所述 側翼序列雜交，從而在所述頭部序列的所述5'端與所述尾部序列的所述3'端之間限定空 位，其中所述靶片段與所述靶標互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的所述末 端定位成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置，并且其中
[0364] 所述空位中的所述靶片段的雜交完成包含所述靶片段以及所述頭部序列和所述 尾部序列的核酸的鏈，其中所述鏈攜帶所述捕獲部分和所述標記。
[0365] 65.根據條款64所述的探針，其中所述捕獲部分是生物素。
[0366] 66.根據條款64或條款65所述的探針，其中所述標記是焚光團。
[0367] 67.根據條款64至66中任一項所述的探針，其中一個或兩個主鏈寡核苷酸還包含 定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互補。
[0368] 68.根據條款52至67中任一項所述的探針，其中所述靶向寡核苷酸還包含定制序 列，所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互補。
[0369] 69.根據前述條款中任一項所述的探針，其中所述靶標互補序列具有10至30個核 苷酸的長度。
[0370] 70.根據前述條款中任一項所述的探針，其中所述靶標互補序列與所述靶片段具 有少于5個堿基對錯配。
[0371] 71.根據條款70所述的探針，其中所述靶標互補序列是所述靶片段的精確互補序 列。
[0372] 72.根據條款52至71中任一項所述的探針，其中所述側翼序列各自具有10至30個 核苷酸的長度。
[0373] 73.根據條款52至72中任一項所述的探針，其中所述靶向寡核苷酸的所述上游側 翼序列和所述下游側翼序列彼此不同。
[0374] 74.根據條款52至73中任一項所述的探針，其中所述頭部序列與所述上游側翼序 列具有少于5個堿基對錯配，并且所述尾部序列與所述下游側翼序列具有少于5個堿基對錯 配。
[0375] 75.根據條款74所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列是所述側翼序列 的確切互補序列。
[0376] 76.根據條款52至75中任一項所述的探針，其中所述靶向寡核苷酸是線性的。
[0377] 77.根據條款52至76中任一項所述的探針，其中所述靶片段是限制性內切核酸酶 片段。
[0378] 78.根據條款52至77中任一項所述的探針，其中所述靶片段是人基因組片段。
[0379] 79.根據條款78所述的探針，其中所述靶片段是對一條染色體特異的人基因組片 段。
[0380] 80.根據條款79所述的探針，其中所述靶片段對所述人基因組的一個基因座特異。
[0381] 81.根據條款52至80中任一項所述的探針，其中所述探針核酸是DNA。
[0382] 82. -組用于結合單鏈靶核酸片段的探針，其包括根據條款52至81中任一項所述 的多個探針，所述探針具有用于結合多個不同靶片段的多個不同的靶標互補序列。
[0383] 83.根據條款82所述的一組探針，其用于結合人染色體的多個片段，其中所述組中 的每個探針用于結合對所述染色體特異的不同靶片段。
[0384] 84.根據條款83所述的一組探針，其中所述探針共有共同定制序列。
[0385] 85.用于結合兩條或更多條人染色體的不同片段的多組探針，其包括：
[0386] 用于結合對第一染色體特異的多個靶片段的第一組探針，以及
[0387] 用于結合對第二染色體特異的多個靶片段的第二組探針，以及任選地
[0388] 用于結合對一條或多條另外的染色體特異的多個靶片段的一組或多組另外的探 針。
[0389] 86.根據條款85所述的多組探針，其中一組內的所述探針共有定制序列，所述定制 序列是所述組共同的并且不同于其他組中的探針的所述定制序列。
[0390] 87.-種試劑盒，其包括在一個或多個容器中的溶液中的根據條款82至86中任一 項所述的一組或多組探針。
[0391] 88.根據條款52至81中任一項所述的探針、根據條款82至86中任一項所述的一組 探針或根據條款87所述的試劑盒的用途，其用于針對靶核酸片段的存在測試樣本。
[0392] 89.-種探針用于針對靶單鏈核酸片段的存在測試樣本的用途，
[0393]其中所述探針包含靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸含有為所述靶片段的確切互 補序列的序列；以及頭部寡核苷酸序列和尾部寡核苷酸序列，所述頭部寡核苷酸序列和所 述尾部寡核苷酸序列鄰近所述靶向寡核苷酸上的所述靶片段雜交，
[0394] 其中所述靶片段與所述探針之間的雜交使所述靶片段模板化用于連接至所述頭 部序列和所述尾部序列。
[0395] 90.根據條款89所述的用途，其中所述探針是如條款52至81中任一項中所定義。
[0396] -個實施方案提供一種處理核酸樣本的方法，所述方法包括:a)使包含靶片段的 樣本與核酸探針雜交，所述核酸探針包含:i.頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和所 述尾部序列是在第一寡核苷酸分子的末端處；以及ii.夾板序列，所述夾板序列依次包含： 與所述頭部序列互補的上游側翼序列，與所述靶片段互補的靶標互補序列以及與所述尾部 序列互補的下游側翼序列；從而產生雜交產物，其中所述靶片段的末端可連接地鄰近所述 第一寡核苷酸分子中的頭部序列和尾部序列的末端；以及b)將所述靶片段的末端連接至所 述第一寡核苷酸分子的頭部序列和尾部序列的末端，從而產生包含所述靶片段以及所述頭 部序列和尾部序列的環狀產物。
[0397] 在任何實施方案中，所述方法還可包括使用與所述第一寡核苷酸分子或所述夾板 序列雜交的引物通過滾環擴增來擴增所述環狀產物。在這些實施方案中，所述方法還可包 括定量所產生的滾環擴增產物的數目，從而提供所述樣本中的所述靶片段的量的估計。
[0398] 在一些實施方案中，所述夾板序列可在所述第一寡核苷酸分子中。
[0399] 在一些實施方案中，所述夾板序列可在第二寡核苷酸分子中。
[0400] 在任何實施方案中，所述靶標互補序列的長度可以是10至30個核苷酸。
[0401 ]在任何實施方案中，所述靶標互補序列可包含與所述靶片段的一個或多個錯配。 [0402]在任何實施方案中，所述側翼序列的長度可以是10與40個核苷酸。
[0403]在任何實施方案中，所述樣本可用限制酶消化。
[0404] 在任何實施方案中，所述樣本可包含基因組DNA，例如人基因組DNA。在這些實施方 案中，所述樣本可包含從血液分離的無細胞DNA。例如，在任何實施方案中，所述樣本可包含 從孕婦的血流分離的無細胞DNA。
[0405] 在一些實施方案中，所述夾板序列可在包含捕獲部分例如生物素部分的第二寡核 苷酸分子中。在這些實施方案中，所述方法可包括:c)通過結合所述捕獲部分將所述環狀產 物固定至固相；以及
[0406] d)洗滌所述固相以除去未連接的核酸和其他反應組分，從而富集所述環狀產物。
[0407] 在任何實施方案中，所述靶片段可來自染色體21、13或18。
[0408]在一些實施方案中，所述方法可包括將所述樣本與一組至少50個所述探針雜交， 其中所述探針靶向同一染色體上的不同片段，并且其中所述方法產生包含所述靶片段的多 種環狀產物。
[0409]在這些實施方案中，所述方法可包括將所述樣本與所述探針組中的第一組和第二 組雜交，其中所述第一組和第二組分別靶向第一染色體和第二染色體;通過滾環擴增(RCA) 擴增所述環狀產物并且比較對應于所述第一染色體的RCA產物的數目與對應于所述第一染 色體的RCA產物的數目。
[0410] 在這些實施方案中，所述方法可包括將所述樣本與所述探針組中的第一組和第二 組雜交，其中所述第一組和第二組分別靶向染色體上的第一區域和第二區域;通過滾環擴 增(RCA)擴增所述環狀產物并且比較對應于所述第一區域的RCA產物的數目與對應于所述 第二區域的RCA產物的數目。
[0411] 本文還提供一種包含核酸探針的組合物，如上所述。在一些實施方案中，所述核酸 探針可包含：i.頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和尾部序列是在第一寡核苷酸分 子的相對端處；以及ii.夾板序列，所述夾板序列依次包含:與所述頭部序列互補的上游側 翼序列，與人基因組中的靶片段互補的靶標互補序列以及與所述尾部序列互補的下游側翼 序列；其中所述探針被設計成使得當所述第一寡核苷酸、所述夾板序列以及所述靶片段彼 此雜交時，所述靶片段的末端可連接地鄰近所述第一寡核苷酸分子中的頭部序列和尾部序 列的末端。
[0412] 在任何組合物實施方案中，所述組合物可包含第一組至少50個核酸探針，其中所 述探針的靶標互補序列與第一人染色體的不同靶片段互補，例如人染色體是21、13或18。在 這些實施方案中，所述組合物可任選地包含第二組至少50個所述核酸探針，其中所述第二 組的探針的靶標互補序列與第二人染色體的不同靶片段互補，例如染色體13或18(如果第 一染色體是染色體21)。
【主權項】
1. 一種針對靶核酸片段的存在測試樣本的方法，所述方法包括 (i)提供片段化核酸的樣本 (i i)提供變性條件，在所述變性條件下所述靶片段為單鏈 (i i i)使所述樣本與核酸探針相接觸，所述核酸探針包含 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列，以使 得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側翼序 列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和所述尾部序 列分別與所述上游側翼序列和所述下游側翼序列互補， (iv)提供退火條件，在所述條件下所述頭部序列和所述尾部序列與所述側翼序列雜 交，并且所述靶片段(如果存在)與所述靶標互補序列雜交，由此將所述靶片段的所述末端 定位成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置 (V)提供用于連接的條件，以使得如果存在所述靶片段，則將所述靶片段的所述3'端連 接至所述頭部序列的所述5 '端以形成第一連接接合點，并且將所述靶片段的所述5'端連接 至所述尾部序列的所述3'端以形成第二連接接合點，從而產生雙重連接的產物，所述產物 包含核酸的連續鏈，所述核酸包含所述頭部序列和所述尾部序列以及所述靶片段，其中所 述連續鏈是核酸的環，以及 (vi)檢測是否存在所述雙重連接的產物， 其中檢測到所述雙重連接的產物指示所述樣本中所述靶片段的存在。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述片段化核酸的樣本是限制酶消化產物并且所 述靶片段是限制片段。3. 根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述頭部序列的所述5'端和所述靶片 段的所述3'端與所述靶向寡核苷酸的相鄰核苷酸雜交，并且所述尾部序列的所述3'端和所 述革G片段的所述5 '端與所述祀向寡核苷酸的相鄰核苷酸雜交。4. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述檢測所述雙重連接的產物的步驟 包括提供用于跨核酸的所述連續鏈的所述第一連接接合點和所述第二連接接合點擴增的 條件，并且檢測是否存在擴增產物。5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述檢測所述雙重連接的產物的步驟包括提供用 于滾環復制的條件并且檢測是否存在滾環復制的產物。6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述滾環復制是超支化滾環復制。7. 根據權利要求1所述的方法，其還包括通過捕獲在固相上來富集所述雙重連接產物。8. 根據權利要求5至7中任一項所述的方法，其中所述探針包含在一個核酸分子上的所 述頭部序列和所述尾部序列。9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述探針包含分別在其5 '端、3 '端具有所述頭部序 列和所述尾部序列的主鏈寡核苷酸，其中所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列和所述尾部序 列在所述退火條件下反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述側翼序列。10. 根據權利要求9所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含在所述頭部序列與所述尾 部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互 補。11. 根據權利要求9所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列和所述尾部序 列是相鄰的。12. 根據權利要求5至8中任一項所述的方法，其中所述頭部序列和所述尾部序列在所 述靶向寡核苷酸的末端處并且在所述退火條件下順式結合至所述側翼序列。13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述革El向寡核苷酸包含在所述革El向寡核苷酸與 所述頭部和/或尾部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或 與所述靶片段互補。14. 根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述尾部序列在所述靶向寡核苷酸 的所述3 '端，并且所述探針包含具有在其5 '端的所述頭部序列的主鏈寡核苷酸， 其中在所述退火條件下，所述尾部序列順式結合至所述靶向寡核苷酸的所述下游側翼 序列，并且所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述上游側 翼序列。15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含一對反向重復序列，其中 在所述退火條件下，所述反向重復序列形成發夾結構，從而將所述主鏈寡核苷酸的所 述3 '端定位成與所述靶向寡核苷酸的所述5 '端并置，并且其中 在所述用于連接的條件下，所述靶向寡核苷酸的所述5 '端被連接至所述主鏈寡核苷酸 的所述3'端，以使得所述雙重連接的產物是包含所述靶向寡核苷酸、所述靶片段和所述主 鏈寡核苷酸的核酸的環。16. 根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述頭部序列在所述靶向寡核苷酸 的所述5 '端，并且所述探針包含具有在其3 '端的所述尾部序列的主鏈寡核苷酸， 其中在所述退火條件下，所述頭部序列順式結合至所述靶向寡核苷酸的所述上游側翼 序列，并且所述主鏈寡核苷酸的所述尾部序列反式結合至所述靶向寡核苷酸的所述下游側 翼序列。17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含一對反向重復序列，其中 在所述退火條件下，所述反向重復序列形成發夾結構，從而將所述主鏈寡核苷酸的所 述5 '端定位成與所述靶向寡核苷酸的所述3 '端并置，并且其中 在所述用于連接的條件下，所述靶向寡核苷酸的所述3 '端被連接至所述主鏈寡核苷酸 的所述5'端，以使得所述雙重連接的產物是包含所述靶向寡核苷酸、所述靶片段和所述主 鏈寡核苷酸的核酸的環。18. 根據權利要求14至17中任一項所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸包含在所述反 向重復序列之間的定制序列，以使得在所述退火條件下所述主鏈寡核苷酸形成發夾環。19. 根據權利要求14或15中任一項所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述下 游側翼序列與所述尾部序列之間的定制序列，以使得在所述退火條件下所述靶向寡核苷酸 形成發夾環。20. 根據權利要求16或17中任一項所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸包含在所述頭 部序列與所述上游側翼序列之間的定制序列，以使得在所述退火條件下所述靶向寡核苷酸 形成發夾環。21. 根據權利要求14至20中任一項所述的方法，其中所述主鏈寡核苷酸攜帶捕獲部分。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述檢測是否存在所述雙重連接的產物的步驟 包括經由所述捕獲部分將所述主鏈寡核苷酸捕獲在基質上，洗滌所述基質以除去未連接的 探針并且保留包含所述基質和捕獲的主鏈寡核苷酸的捕獲級分，以及針對所述捕獲級分中 所述雙重連接的產物的存在進行測試。23. 根據權利要求21或權利要求22所述的方法，其中所述捕獲部分是生物素。24. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述靶標互補序列具有10至30個核 苷酸的長度。25. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述靶標互補序列與所述靶片段具 有少于5個堿基對錯配。26. 根據權利要求25所述的方法，其中所述靶標互補序列是所述靶片段的精確互補序 列。27. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述側翼序列各自具有10至30個核 苷酸的長度。28. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述上游側翼序列和所述下游側翼 序列彼此不同。29. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述頭部序列與所述上游側翼序列 具有少于5個堿基對錯配，并且所述尾部序列與所述下游側翼序列具有少于5個堿基對錯 配。30. 根據權利要求29所述的方法，其中所述頭部序列是所述上游側翼序列的精確互補 序列，并且所述尾部序列是所述下游側翼序列的精確互補序列。31. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述靶向寡核苷酸是線性的。32. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述樣本是片段化的人染色體的樣 本，并且所述靶片段是對一條染色體特異的人基因組片段。33. 根據權利要求32所述的方法，其中所述靶片段對所述人基因組的一個基因座特異。34. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述探針核酸是DNA。35. 根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述方法包括使用多個所述探針并 行多重測試多個不同的靶核酸片段。36. 根據權利要求35所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色體的樣本與用于結 合染色體的多個片段的一組探針相接觸，其中所述組中的每個探針用于結合對所述染色體 特異的不同靶片段。37. 根據權利要求36所述的方法，其中所述探針共有共同定制序列。38. 根據權利要求35所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色體的樣本與用于結 合兩條或更多條染色體的多個片段的多組探針相接觸，其中所述探針組包含： 用于結合對第一染色體特異的多個靶片段的第一組探針，以及 用于結合對第二染色體特異的多個靶片段的第二組探針，以及任選地 用于結合對一條或多條另外的染色體特異的多個靶片段的一組或多組另外的探針。39. 根據權利要求38所述的方法，其中各組探針包含用于結合對所述染色體特異的多 個靶片段的至少500個不同的探針。40. 根據權利要求38或權利要求39所述的方法，其中一組內的所述探針共有定制序列， 所述定制序列是所述子組共同的并且不同于其他組中的探針的所述定制序列。41. 根據權利要求40所述的方法，其包括通過檢測針對每組探針的所述雙重連接的產 物并且檢測所述產物中的所述定制序列的相對量來測定所述樣本中的所述兩條或更多條 染色體的相對量。42. 根據權利要求36至41中任一項所述的方法，其中所述一條或多條染色體是人的。43. -種用于結合單鏈靶核酸片段的核酸探針，其中所述探針包含 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列，以使 得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側翼序 列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部序列和所述尾部序 列分別與所述上游側翼序列和所述下游側翼序列互補， 以使得在退火條件下在所述靶片段存在下，所述頭部序列和所述尾部序列與所述側翼 序列雜交，從而在所述頭部序列的所述5 '端與所述尾部序列的所述3 '端之間限定空位，其 中所述靶片段與所述靶標互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的所述末端定位 成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置，并且其中 所述空位中的所述靶片段的雜交完成核酸的環，所述環包含所述靶片段以及所述頭部 序列和所述尾部序列。44. 根據權利要求43所述的核酸探針，其中所述頭部和/或尾部序列被連接至定制序 列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互補。45. 根據權利要求43或權利要求44所述的核酸探針，其中單個核酸分子包含所述頭部 序列和所述尾部序列。46. 根據權利要求43或權利要求44所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列與 所述靶向寡核苷酸隔開，并且反式結合至所述側翼序列。47. 根據權利要求46所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列分別在主鏈寡核 苷酸的5'端和3'端。48. 根據權利要求47所述的探針，其中所述主鏈寡核苷酸包含在所述頭部序列與所述 尾部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區域或與所述靶片段互 補。49. 根據權利要求47所述的探針，其中所述主鏈寡核苷酸的所述頭部序列和所述尾部 序列是相鄰的。50. -種用于結合單鏈靶核酸片段的核酸探針，其中所述探針包含 靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸比所述靶片段長并且包含內部靶標互補序列，以使 得所述靶向寡核苷酸與所述靶片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游側翼序 列與下游側翼序列之間的雙鏈序列，以及 分別具有游離的5'端和3'端的頭部序列和尾部序列，其中所述頭部寡核苷酸序列和所 述尾部寡核苷酸序列分別與所述上游側翼序列和所述下游側翼序列互補， 以使得在退火條件下在所述靶片段存在下，所述頭部序列和所述尾部序列與所述側翼 序列雜交，從而在所述頭部序列的所述5 '端與所述尾部序列的所述3 '端之間限定空位，其 中所述靶片段與所述靶標互補序列在所述空位中雜交，由此將所述靶片段的所述末端定位 成與所述頭部序列的所述5 '端和所述尾部序列的所述3 '端并置，并且其中 所述頭部序列是所述靶向寡核苷酸的5'端和/或所述尾部序列是所述靶向寡核苷酸的 3'端，以使得所述空位中的所述靶片段的雜交完成核酸的鏈，所述核酸包含所述靶片段、所 述頭部序列和所述尾部序列、所述靶標互補序列以及所述側翼序列，其中所述鏈是核酸的 環。51. 根據權利要求43或權利要求50所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列在 所述靶向寡核苷酸的末端處，并且反式結合至所述側翼序列。52. 根據前述權利要求中任一項所述的探針，其中所述靶標互補序列具有10至30個核 苷酸的長度。53. 根據前述權利要求中任一項所述的探針，其中所述靶標互補序列與所述靶片段具 有少于5個堿基對錯配。54. 根據權利要求53所述的探針，其中所述靶標互補序列是所述靶片段的精確互補序 列。55. 根據權利要求43至54中任一項所述的探針，其中所述側翼序列各自具有10至30個 核苷酸的長度。56. 根據權利要求43至55中任一項所述的探針，其中所述靶向寡核苷酸的所述上游側 翼序列和所述下游側翼序列彼此不同。57. 根據權利要求43至56中任一項所述的探針，其中所述頭部序列與所述上游側翼序 列具有少于5個堿基對錯配，并且所述尾部序列與所述下游側翼序列具有少于5個堿基對錯 配。58. 根據權利要求57所述的探針，其中所述頭部序列和所述尾部序列是所述側翼序列 的確切互補序列。59. 根據權利要求43至58中任一項所述的探針，其中所述靶向寡核苷酸是線性的。60. 根據權利要求43至59中任一項所述的探針，其中所述靶片段是限制性內切核酸酶 片段。61. 根據權利要求43至60中任一項所述的探針，其中所述靶片段是人基因組片段。62. 根據權利要求61所述的探針，其中所述靶片段是對一條染色體特異的人基因組片 段。63. 根據權利要求62所述的探針，其中所述靶片段對所述人基因組的一個基因座特異。64. 根據權利要求43至63中任一項所述的探針，其中所述探針核酸是DNA。65. 用于結合單鏈靶核酸片段的探針組，其包括根據權利要求52至81中任一項所述的 多個探針，所述探針具有用于結合多個不同靶片段的多個不同的靶標互補序列。66. 根據權利要求65所述的探針組，其用于結合人染色體的多個片段，其中所述組中的 每個探針用于結合對所述染色體特異的不同靶片段。67. 根據權利要求66所述的探針組，其中所述探針共有共同定制序列。68. -種組合物，其包含用于結合兩條或更多條人染色體的不同片段的多組探針，所述 多組探針包含： 用于結合對第一染色體特異的多個靶片段的第一組探針，以及 用于結合對第二染色體特異的多個靶片段的第二組探針，以及任選地 用于結合對一條或多條另外的染色體特異的多個靶片段的一組或多組另外的探針。69. 根據權利要求68所述的組合物，其中子組內的所述探針共有定制序列，所述定制序 列是所述組共同的并且不同于其他組中的探針的所述定制序列。70. -種試劑盒，其包括在一個或多個容器中的溶液中的根據權利要求65至69中任一 項所述的一組或多組探針。71. 根據權利要求43至64中任一項所述的探針、根據權利要求65至69中任一項所述的 一組探針或根據權利要求70所述的試劑盒的用途，其用于針對靶核酸片段的存在測試樣 本。72. -種探針用于針對靶單鏈核酸片段的存在測試樣本的用途， 其中所述探針包含靶向寡核苷酸，所述靶向寡核苷酸含有為所述靶片段的確切互補序 列的序列；以及頭部寡核苷酸序列和尾部寡核苷酸序列，所述頭部寡核苷酸序列和所述尾 部寡核苷酸序列鄰近所述靶向寡核苷酸上的所述靶片段雜交， 其中所述靶片段與所述探針之間的雜交使所述靶片段模板化用于連接至所述頭部序 列和所述尾部序列。73. 根據權利要求72所述的用途，其中所述探針是如權利要求43至64中任一項中所要 求。
【文檔編號】C12N15/11GK105899680SQ201480072154
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月26日
【發明人】C·O·F·達爾, J·O·埃瑞克森
【申請人】瓦納迪斯診斷公司