通過基于結構的探針切割實現的多路化核酸靶標鑒定的制作方法

通過基于結構的探針切割實現的多路化核酸靶標鑒定的制作方法
【專利摘要】本發明提供了用于核酸序列檢測的新方法和組合物。通過聚合酶的5'?核酸酶活性在PCR過程中產生與靶核酸結合的、來自探針的獨特的鑒定性切割片段。通過鑒定所述獨特的切割片段，可以確定靶標的身份。
【專利說明】
通過基于結構的探針切割實現的多路化核酸靶標鑒定
技術領域
[0001] 本發明涉及核酸檢測的領域。具體地，本發明提供了執行靶核酸的高通量多路檢 測的方法。
【背景技術】
[0002] 許多用于檢測靶核酸的方法是已知的。目前可獲得的用于核酸檢測的同質測定包 括TaqMan?、Ampliflour?、染料結合、等位基因選擇性的動態PCR和Scorpion?引物測定。 由于需要不同染料用于待檢測的每種靶核酸，這些測定操作不容易多路化，并且因此在其 改善潛力方面有限。為了克服這樣的局限性，幾項近期研究已公開了含有可切割的"標簽" 部分的寡核苷酸探針的應用，所述"標簽"部分可以容易地分離和檢測（例如美國專利公開 號2005/0053939;美國專利號8,133，701)。但是，來自這些研究的結果表明，存在能夠準確 地使檢測標簽與靶核酸關聯的問題，并且仍需要執行靶核酸的高通量多路檢測的準確方 法。
[0003] 發明概述 本發明提供了用于核酸序列檢測的新方法。在該方法中，在PCR期間通過DNA聚合酶的 5'-核酸酶活性產生與擴增區內的靶核酸結合的、來自寡核苷酸探針的獨特的鑒定性切割 片段。這通過具有附著至探針的5'末端的非互補"翼(flap)"區來實現。通過基于長度的分 離、基于電荷的分離或通過質量鑒定獨特的切割片段，可以確定靶核酸的身份。例如，這可 以容易地通過質譜法來完成。由于極大數目的具有獨特的且可容易分辨的質量的可能切割 片段，由此使得使用條形碼探針和質譜法的核酸靶標的快速高通量多路檢測成為可能。
[0004] 因此，在一個方面，本發明提供了檢測靶核酸序列在樣品中的存在或不存在的方 法，所述方法包括下述步驟： (a) 使包含靶核酸的樣品與下述物質接觸：（i) 一對寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸 引物包含與靶核酸序列的一條鏈中的一個區域互補的序列且引發第一延伸產物的合成，并 且其中第二寡核苷酸引物包含與所述第一延伸產物中的一個區域互補的序列且引發與所 述第一延伸產物互補的核酸鏈的合成，和(ii)寡核苷酸探針，其包含至少兩個不同部分，第 一部分包含標準核苷酸，具有或不具有核苷酸類似物，所述第一部分包含與靶核酸序列的 一個區域至少部分互補的序列，其中所述第一部分在所述寡核苷酸引物所結合的靶核酸序 列內對合，并且其中所述第一部分在3 '端處被封閉以阻止通過核酸聚合酶進行的延伸;并 且附著至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸 兩者，且包含與靶核酸序列非互補的序列；其中所述第二部分與所述第一部分被非核苷酸 接頭隔開，所述接頭衍生自單個單元或被磷酸酯鍵隔開的多個單元，其中所述接頭在所述 第一部分和所述第二部分的連接部處建立失穩區域； (b) 在特定條件下用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶擴增靶核酸序列，所述特定 條件允許所述寡核苷酸引物對和所述寡核苷酸探針與所述靶核酸序列對合以及從所述寡 核苷酸引物對合成引物延伸產物，同時所述核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能夠切割對合 的寡核苷酸探針并從其釋放優勢片段，所述優勢片段包含所述寡核苷酸探針的第二部分、 所述非核苷酸接頭和在所述寡核苷酸探針的第一部分的5 '末端處的單個核苷酸;和 (c)通過質譜法檢測所述優勢片段的存在或不存在，由此檢測所述靶核酸序列在所述 樣品中的存在或不存在。
[0005] 在某些實施方案中，在單個多路化反應中檢測兩種或更多種靶核酸。在某些實施 方案中，使用兩種或更多種寡核苷酸探針在單個多路化反應中檢測兩種或更多種靶核酸。 在某些實施方案中，所述非核苷酸接頭選自丙二醇、六甘醇(HEG)、三甘醇(TEG)、間隔物亞 磷酰胺9(Spacer Phosphoramidite 9)、間隔物C12 CE亞磷酰胺（Spacer C12 CE Phosphoramidite)和dSpacer CE亞磷酰胺（dSpacer CE Phosphoramidite)或它們的組合。 在某些實施方案中，所述非核苷酸接頭選自丙二醇和HEG。在某些實施方案中，通過質譜儀 完成檢測，所述質譜儀選自基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF) MS、串聯MS、電 噴射電離-飛行時間(ESI-T0F)、ESI-離子阱、液相層析(LC)-MS)、氣相層析(GC)-MS)和離子 迀移率(頂)-MS。在某些實施方案中，所述核酸聚合酶是熱穩定的DNA聚合酶。
[0006] 在另一個方面，本發明提供了一種包含寡核苷酸探針的組合物，其中所述寡核苷 酸探針包含至少兩個不同部分，其中第一部分包含標準核苷酸，具有或不具有核苷酸類似 物，所述第一部分包含與靶核酸序列的一個區域至少部分互補的序列，使得所述第一部分 能夠結合至所述靶核酸序列的該區域，且其中所述第一部分在3'端處被封閉以阻止DNA聚 合酶對所述寡核苷酸探針的延伸;并且附著至所述第一部分的5 '末端的第二部分包含核苷 酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補的序列；其中所述第 一部分和所述第二部分被非核苷酸接頭隔開，所述接頭衍生自單個單元或被磷酸酯鍵隔開 的多個單元，其中所述接頭在所述寡核苷酸探針的所述第一部分和所述第二部分的連接部 處建立失穩區域。
[0007] 在某些實施方案中，在所述寡核苷酸探針的所述第一部分和所述第二部分的連接 部處的非核苷酸接頭選自丙二醇、六甘醇（HEG)、三甘醇（TEG)、間隔物亞磷酰胺9 (Glen Research，目錄號 10-1909-90)、間隔物C12 CE亞磷酰胺（Glen Research 目錄號 10-1928-90)和dSpacer CE亞磷酰胺(Glen Research目錄號10-1914-90)或多個單元或這些的組合。
【附圖說明】
[0008] 圖1描繪了本發明的方法的示例性描述。
[0009] 圖2顯示了在實施例1中描述的實驗的質譜圖。
【具體實施方式】
[0010] 定義 本文用的術語"樣品"包括包含核酸的樣本或培養物(例如，微生物培養物）。術語 "樣品"還意圖包括生物樣品和環境樣品。樣品可以包括合成起源的樣本。生物樣品包括全 血、血清、血漿、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊水、腦脊液、脊髓液、洗出液(例如，支氣管肺泡的、胃 的、腹膜的、管的、耳的、關節鏡的洗出液）、活組織檢查樣品、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前 列腺液、精液、淋巴液、膽汁、淚液、汗液、乳汁、乳房流體、胚胎細胞和胎兒細胞。在一個優選 的實施方案中，所述生物樣品是血液，并且更優選地是血漿。本文中使用的術語"血液"包括 全血或任何血液級分，諸如如常規地定義的血清和血漿。血漿表示由用抗凝劑處理過的血 液的離心產生的全血級分。血清表示血液樣品已經凝固后剩下的流體的水樣部分。環境樣 品包括環境材料諸如表面物質、土壤、水和工業樣品，以及得自食物和乳制品加工器械、儀 器、設備、器皿、一次用棄的和非一次用棄的物品的樣品。這些例子不應解釋為限制可應用 于本發明的樣品類型。
[0011]本文中使用的術語"靶標"或"靶核酸"意圖指要檢測或測量其存在、或者要研究其 功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶標包括用于它的可檢測探針(例如，寡核苷酸探 針)或測定存在或可以由本領域技術人員生產的基本上任意的分子。例如，靶標可以是生物 分子，諸如核酸分子、多肽、脂質或碳水化合物，其能夠與可檢測探針(例如抗體)結合或以 其它方式發生接觸，其中所述可檢測探針還包含能夠通過本發明的方法檢測的核酸。本文 中使用的"可檢測探針"表示能夠與目標靶生物分子雜交或對合且允許如本文中所述的靶 生物分子的特異性檢測的任何分子或試劑。在本發明的一個方面，所述靶標是核酸，且所述 可檢測探針是寡核苷酸。術語"核酸"和"核酸分子"可以貫穿本公開內容互換使用。所述術 語表示寡核苷酸、寡物、多核苷酸、脫氧核糖核苷酸(DNA)、基因組DNA、線粒體DNA(mtDNA)、 互補DNA(cDNA)、細菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、核糖體 RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、質粒、M13、P1、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工 染色體(YAC)、擴增的核酸、擴增子、PCR產物及其它類型的擴增的核酸、RNA/DNA雜交體和聚 酰胺核酸(PNA)，所有這些可以呈單鏈或雙鏈形式，并且除非另有限制，否則將包括天然核 苷酸的已知類似物，其可以以與天然存在的核苷酸類似的方式起作用，及其組合和/或混合 物。因而，術語"核苷酸"表示天然存在的和經修飾的/非天然存在的核苷酸，包括三、二和單 磷酸核苷，以及在聚核酸或寡核苷酸內存在的單磷酸單體。核苷酸還可以是核糖核苷酸、 2'_脫氧核苷酸、2'，3'_脫氧核苷酸以及本領域眾所周知的廣泛多樣的其它核苷酸模仿物。 模仿物包括鏈終止核苷酸，諸如3'-0_甲基、鹵代堿基或糖取代；替代性的糖結構，包括非 糖、烷基環結構;替代性的堿基，包括肌苷;脫氮修飾的;接頭修飾的X和Φ;質量標記修飾的； 磷酸二酯修飾或替換，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼代磷酸酯、酰胺、酯、醚;和堿基或完 全核苷酸間替換，包括切割鍵諸如光可切割的硝基苯基部分。
[0012]可以定量地或定性地測量靶標的存在或不存在。靶標可以以多種不同形式出現， 包括例如簡單或復雜混合物，或基本上純化的形式。例如，靶標可以是含有其它組分的樣品 的組成部分，或可以是樣品的唯一或主要組分。因此，靶標可以是全細胞或組織的組分、細 胞或組織提取物、其分級分離的裂解物或基本上純化的分子。另外，靶標可以具有已知的或 未知的序列或結構。
[0013]術語"擴增反應"表示用于增加革巴核酸序列的拷貝的任何體外方式。
[0014] "擴增"表示使溶液處于足以允許擴增的條件的步驟。擴增反應的組分可以包括、 但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。術語"擴增"通常表示靶核酸的 "指數"增加。但是，本文中使用的"擴增"還可以表示選定的靶核酸序列的數目的線性增加， 但是不同于一次性的、單引物延伸步驟。
[0015] "聚合酶鏈式反應"或"PCR"表示用于以等比數列擴增靶雙鏈DNA的特定區段或子 序列的方法。PCR是本領域技術人員眾所周知的；參見，例如，美國專利號4，683,195和4， 683,202;和 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis 等人編， 1990ο
[0016] 本文中使用的"寡核苷酸"表示通過磷酸二酯鍵或其類似物連接的天然或經修飾 的核苷單體的線性寡聚體。寡核苷酸包括能夠特異性地結合靶核酸的脫氧核糖核苷、核糖 核苷、其端基異構形式、肽核酸(ΡΝΑ)等。通常，單體通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成 寡核苷酸，所述寡核苷酸的大小范圍從幾個單體單元(例如3-4個)至幾十個單體單元(例如 40-60個）。每當寡核苷酸通過字母的序列諸如"ATGCCTG"表示時，應該理解，核苷酸從左到 右是5'-3'次序，并且除非另外指出，否則"Α"表示脫氧腺苷，"C"表示脫氧胞苷，"G"表示脫 氧鳥苷，"Τ"表示脫氧胸苷，并且"U"表示核糖核苷，尿苷。通常，寡核苷酸包含四種天然脫氧 核苷酸;但是，它們還可以包含核糖核苷或非天然核苷酸類似物。當酶由于活性具有特定寡 核苷酸或多核苷酸底物要求時，例如單鏈DNA、RNA/DNA雙鏈體等，則關于寡核苷酸或多核苷 酸底物的適當組成的選擇完全是在普通技術人員的知識內。
[0017] 本文中使用的"寡核苷酸引物"或簡稱"引物"表示這樣的多核苷酸序列:其與靶核 酸模板上的序列雜交并且促進寡核苷酸探針的檢測。在本發明的擴增實施方案中，寡核苷 酸引物充當核酸合成的起始點。在非擴增實施方案中，寡核苷酸引物可以用于建立能夠被 切割試劑切割的結構。引物可以具有多種長度，并且通常是小于50個核苷酸的長度，例如 12-25個核苷酸的長度。可以基于本領域技術人員已知的原則來設計用于PCR中的引物的長 度和序列。
[0018] 本文中使用的術語"寡核苷酸探針"表示這樣的多核苷酸序列：其能夠與目標靶核 酸雜交或對合并且允許所述靶核酸的特異性檢測。
[0019] "錯配核苷酸"或"錯配"表示在所述一個或多個位置處與靶序列不互補的核苷酸。 寡核苷酸探針可以具有至少一個錯配，但還可以具有2、3、4、5、6或7個或更多個錯配核苷 酸。
[0020] 本文中使用的術語"多態性"表示等位基因變體。多態性可以包括單核苷酸多態性 (SNP)以及簡單序列長度多態性。多態性可以是由于與另一個等位基因相比在一個等位基 因處的一個或多個核苷酸置換，或可以是由于本領域已知的插入或缺失、復制、倒轉及其它 改變。
[0021] 本文中使用的術語"質量可區分的大小"可以與"切割產物大小"、"降解產物大小" 或"探針片段大小"互換使用，并且表示如通過本文方法描述的由寡核苷酸探針的切割和釋 放產生的一種優勢降解產物的大小。具有質量可區分的大小(MDF)的片段可以包括、但不限 于寡核苷酸探針片段、核苷酸寡核苷酸探針片段、非核苷酸寡核苷酸探針片段、含有修飾標 簽(例如疏水部分和親和部分）以促進分離的寡核苷酸探針片段。產生具有獨特的質量可區 分的大小的片段會導致顯著改善的靈敏度，且允許增強執行多路反應的能力。
[0022] 本文中使用的術語"修飾"表示在分子水平（例如，堿基部分、糖部分或磷酸酯主 鏈)改變寡核苷酸探針。核苷修飾包括、但不限于引入切割阻斷劑或裂解誘導物，引入小溝 結合劑，同位素富集，同位素耗盡，引入氘和鹵素修飾。核苷修飾還可以包括增加雜交的嚴 謹性或增加寡核苷酸探針的解鏈溫度的部分。例如，核苷酸分子可以用連接2'和4'碳的額 外橋進行修飾，從而產生對核酸酶切割具有抗性的鎖核酸(LNA)核苷酸。
[0023]提及一種分子與另一種分子的結合的術語"特異性的"或"特異性"，諸如探針對靶 多核苷酸的特異性，表示兩種分子之間的識別、接觸和穩定復合物的形成，以及該分子與其 它分子的基本上更少的識別、接觸或復合物形成。本文中使用的術語"對合"表示兩種分子 之間的穩定復合物的形成。
[0024] 如果探針的至少一個區域與核酸序列的補體的至少一個區域共享實質序列同一 性，則所述探針"能夠與核酸序列對合"。"實質序列同一性"是至少約80%、優選地至少約 85%、更優選地至少約90%、95%或99%、和最優選地100%的序列同一性。為了確定DNA序列和 RNA序列的序列同一性的目的，U和T通常視為相同核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探針能 夠與包含序列GCUGAU的靶RNA序列雜交。
[0025] 本文中使用的術語"切割試劑"表示能夠切割寡核苷酸探針以產生質量可區分的 大小的片段的任何方式，包括、但不限于酶。對于其中不發生擴增的方法，切割試劑可以僅 用于切割、降解或以其它方式釋放寡核苷酸探針的第二部分或其片段。切割試劑可以是酶。 切割試劑可以是天然的、合成的、未經修飾的或經修飾的。
[0026] 對于其中發生擴增的方法，切割試劑優選地是具有合成(或聚合)活性和核酸酶活 性的酶。這樣的酶通常為核酸擴增酶。核酸擴增酶的一個例子是核酸聚合酶，諸如水生棲熱 菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA聚合酶(TaqMAN.RTM.)或大腸桿菌(E. coli)DNA聚合酶 I。所述酶可以是天然存在的、未經修飾的或經修飾的。
[0027] "核酸聚合酶"表示催化核苷酸向核酸內的摻入的酶。示例性的核酸聚合酶包括 DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端轉移酶、逆轉錄酶、端粒末端轉移酶等。
[0028] "熱穩定的DNA聚合酶"表示這樣的DNA聚合酶：當遭受高溫選定的時間段時，其為 穩定的（即抵抗分解或變性)且保持足夠的催化活性。例如，當遭受高溫使雙鏈核酸變性所 需的時間時，熱穩定的DNA聚合酶保留實現后續引物延伸反應的足夠活性。核酸變性所需的 加熱條件是本領域眾所周知的，并且在美國專利號4,683，202和4,683,195中舉例說明。本 文中使用的熱穩定的聚合酶通常適用于溫度循環反應諸如聚合酶鏈式反應（"PCR"）中。熱 穩定的核酸聚合酶的例子包括水生棲熱菌Taq DNA聚合酶、棲熱菌屬(Thermus)種Z05聚合 酶、黃棲熱菌（Thermus flavus)聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶諸如 TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
[0029] "經修飾的"聚合酶表示其中至少一個單體不同于參照序列的聚合酶，所述參照序 列是例如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一種修飾形式。示例性修飾包 括單體插入、缺失和置換。經修飾的聚合酶還包括嵌合聚合酶，其具有衍生自兩個或更多個 親本的可鑒定的組分序列（例如，結構或功能結構域等）。在經修飾的聚合酶的定義內還包 括包含參照序列的化學修飾的那些。經修飾的聚合酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合 酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、 ΔΖ05聚合酶、AZ05-Gold聚合酶、AZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚 合酶、E678G TMA-30聚合酶等。
[0030] 術語"5 '至3 '核酸酶活性"或"5 ' -3 '核酸酶活性"表示通常與核酸鏈合成相關的核 酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5 '末端除去。例如，大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活 性，而克列諾片段沒有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。這樣的5'至 3'外切核酸酶的例子包括:得自枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的外切核酸酶，得自脾的磷 酸二酯酶，λ外切核酸酶，得自酵母的外切核酸酶II，得自酵母的外切核酸酶V，和得自粗糙 鏈抱霉(Neurospora crassa)的外切核酸酶。
[0031]術語"優勢片段"表示占所有片段的超過90%的片段，其可以通過任何給定的檢測 方法來檢測。
[0032]術語"丙二醇"或"丙二醇間隔物"表示1，3_丙二醇，并且與丙烷-1，3-二醇、1，3_二 羥基丙烷和亞丙基二醇同義。術語"HEG"或"HEG間隔物"表示六甘醇，其與3,6,9，12，15-五 氧雜十七燒-1，17-二醇同義。
[0033]本發明的多個方面基于核酸聚合酶的特殊性質。核酸聚合酶可以具有幾種活性， 其中包括5'至3'核酸酶活性，由此核酸聚合酶可以從寡核苷酸切割單核苷酸或小寡核苷 酸，所述寡核苷酸與它的較大互補多核苷酸對合。為了使切割有效地發生，上游寡核苷酸還 必須與相同的較大多核苷酸對合。
[0034]利用5 '至3 '核酸酶活性的靶核酸的檢測可以通過如以下文獻所述的"TaqMan ? " 或"5~核酸酶測定"來執行:美國專利號5，210，015、5，487，972和5，804，375;和Hoi land等 人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280。在TaqMan? 測定中，在擴增區 內雜交的標記的檢測探針在擴增反應期間存在。探針如此進行修飾，以阻止探針充當DNA合 成的引物。所述擴增使用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶執行。在擴增的每個合成 步驟期間，與來自待延伸引物下游的靶核酸雜交的任何探針通過DNA聚合酶的5'至3'外切 核酸酶活性降解。因而，新靶鏈的合成也導致探針的降解，并且降解產物的積累會提供靶序 列合成的量度。
[0035] 適合用于檢測降解產物的任何方法均可用在5'核酸酶測定中。通常，檢測探針用 兩種熒光染料進行標記，其中之一能夠淬滅另一種染料的熒光。所述染料附著至探針，通常 報道或檢測染料附著至5'末端，且淬滅染料附著至內部位點，使得當探針處于非雜交狀態 時，淬滅發生，并且使得通過DNA聚合酶的5 '至3 '外切核酸酶活性實現的探針切割發生在兩 種染料之間。擴增導致染料之間的探針切割，伴隨淬滅的消除和來自最初淬滅的染料的可 觀察的熒光的增加。通過測量反應熒光的增加，監測降解產物的積累。美國專利號5,491， 063和5,571，673描述了用于檢測與擴增伴隨發生的探針降解的替代方法。
[0036] 用于檢測靶核酸的5'核酸酶測定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的任何聚 合酶。因此，在某些實施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是熱穩定和熱活性的核酸聚合 酶。這樣的熱穩定的聚合酶包括、但不限于來自真細菌屬棲熱菌屬、熱袍菌屬(Thermatoga) 和棲熱腔菌屬(Thermosipho)的多個種的天然和重組形式的聚合酶以及其嵌合形式。例如， 可以用于本發明的方法中的棲熱菌屬種聚合酶包括水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、嗜熱棲熱 菌(Thermus thermophilus) (Tth)DNA聚合酶、棲熱菌屬種Z05(Z05)DNA聚合酶、棲熱菌屬種 spsl7(spsl7)和棲熱菌屬種 Z05(例如在美國專利號 5,405,774、5,352,600、5,079,352、4， 889，818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和 5,795,762中所述）。可以用于本發明的方法 中的熱袍菌屬聚合酶包括例如海棲熱袍菌DNA聚合酶和新阿波羅棲熱袍菌（Thermatoga neapoli tana) DNA聚合酶，而可以使用的棲熱腔菌屬聚合酶的一個例子是非洲棲熱腔菌 (Thermosipho africanus)DNA聚合酶。海棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌DNA聚合酶的序列公開 于國際專利公開號W0 92/06200中。新阿波羅棲熱袍菌的序列可以在國際專利公開號W0 97/09451中找到。
[0037] 在5'核酸酶測定中，擴增檢測通常與擴增同時發生（即，"實時"）。在某些實施方案 中，擴增檢測是定量的，并且擴增檢測是實時的。在某些實施方案中，擴增檢測是定性的（例 如，靶核酸的存在或不存在的終點檢測）。在某些實施方案中，擴增檢測在擴增之后。在某些 實施方案中，擴增檢測是定性的，并且擴增檢測在擴增之后。
[0038] 在本發明中，來自寡核苷酸探針的降解產物的檢測不涉及使用熒光報道染料和淬 滅染料，而是涉及具有兩個不同部分的探針的合成。第一部分是與靶核酸至少部分互補的 互補部分，并且由標準核苷酸或核苷酸類似物組成，使得該部分能夠與待檢測的靶核酸結 合。此外，探針的該第一部分的3'末端是經修飾的或被封閉的，使得它不可被DNA聚合酶延 伸。第二部分是附著至第一部分的5'末端的非互補部分，并且形成不能與靶核酸結合的"5' 翼"區（參見圖1)。該5'翼部分可以包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者。可以 存在于寡核苷酸探針的5'翼第二部分中的非核苷酸可以是任何有機部分或重復單元(例如 (CH2_CH2_0)n等）。
[0039] 寡核苷酸探針的第一部分和第二部分被非核苷酸接頭隔開(參見圖1)。該接頭可 以包含碳、碳和氧、碳和氮、或這些的任意組合，且可以具有任意長度。此外，所述接頭可以 包含線性部分或環狀部分。所述接頭可以衍生自單個單元或衍生自被磷酸酯鍵隔開的多個 相同或不同單元。接頭的目的是在寡核苷酸探針的第一部分和第二部分的連接部處建立失 穩的鉸鏈區，以便通過在連接所述寡核苷酸探針的第一部分的第一個和第二個核苷酸的磷 酸二酯鍵處的切割實現優勢5'_核酸酶片段。因而，具有5'-核酸酶活性的酶對寡核苷酸探 針的切割會產生靶標特異性的、單一的"獨特質量"片段，其由"5'_翼"區域（即寡核苷酸探 針的第二部分)與接頭和來自寡核苷酸探針的靶標特異性的互補部分（即第一部分)的單個 核苷酸組成。適合用在本發明中的接頭的例子包括丙二醇、六甘醇(HEG)、三甘醇(TEG)、間 隔物亞磷酰胺9 (Glen Research，目錄號10-1909-90)、間隔物C12 CE亞磷酰胺（Glen Research 目錄號 10-1928-90)和dSpacer CE亞磷酰胺（Glen Research 目錄號 10-1914-90) 〇 接頭可以是在單個單元中，在單一類型的分子的多個連續單元中，或在分子的組合的多個 連續單元中。
[0040] 如以前所述，用于給定靶核酸的寡核苷酸探針的5'-翼部分可以包含核苷酸、非核 苷酸或二者的組合，只要它具有使它與其它靶核酸的5'_翼不同且可區分開的獨特質量大 小。大體而言，這可以允許來自單個反應的數百種靶核酸的多路檢測。例如，僅使用標準核 苷酸A、G、C和T，由僅6個核苷酸組成的5'-翼可以產生84種可能的片段，都具有獨特的質量 可區分的大小。另外，5'-翼部分可以連接用于促進片段的分離或純化的修飾標簽，諸如在 相分離層析中的熒光標簽(參見例如，美國專利號5,859,247)或在生物素-抗生蛋白鏈菌素 親和層析中的生物素標簽。
[0041] 本發明提供了寡核苷酸引物和探針。不預期用于產生這些探針和引物的方法以任 何方式受到限制。本領域技術人員熟悉多種用于產生探針和引物的化學合成策略和試劑。 還不預期本發明的寡核苷酸探針限于天然存在的核苷酸結構或天然存在的堿基(例如，腺 嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）。除核酸中通常發現的天然存在的雜環堿基之 外，非天然核酸類似物也與本發明一起使用。
[0042] 非天然類似物包括具有非天然存在的雜環堿基或其它經修飾的堿基的那些。具體 地，許多非天然存在的堿基進一步描述在，例如，Seela等人（1991)，Helv. Chim. Acta 74: 1790，Grein等人（1994)，Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 971-976,和Seela等人 (1999)，Helv. Chim. Acta 82: 1640。為了進一步舉例說明，任選地包括在核苷酸中使用 的充當解鏈溫度(Tm)改性劑的某些堿基。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如，7-脫 氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等）、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN (例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等。參見，例如，美國專利號5，990，303。其它代表性的雜環堿基包括，例如，次黃嘌呤、 肌苷、黃嘌呤;2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的 8-氮雜衍生物;腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌 呤、肌苷和黃嘌呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物;6-氮雜胞嘧啶;5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶;5-碘 胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶;5-碘尿嘧啶;5-溴尿嘧啶;5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶;5-乙炔基尿 嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-異戊烯基腺 嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2_二甲基鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲 基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲 基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(V)、懷丁 氧苷(wybutoxosine)、假尿啼啶、Q核苷、2硫代胞啼啶、5-甲基-2-硫尿啼啶、2-硫尿啼啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧 啶、（acp3)w、2,6-二氨基噪呤和5-丙炔基啼啶等。為了進一步舉例說明，經修飾的寡核苷酸 的其它例子包括具有一個或多個鎖核酸(LNA TM )單體的那些(包含LNA TM單體的寡核苷酸， 可得自例如LinkTechnologies，Ltd·，Lanarkshire，蘇格蘭；在來自ExiqonA/S，Vedbffi k，Denmark的許可證下）。諸如此類的核苷酸類似物也描述在例如美國專利號6，639，059、 美國專利號6，303，315和美國專利公開號2003/0092905中。
[0043]使用本領域已知的任何技術，可以制備寡核苷酸探針和引物。在某些實施方案中， 例如，使用任何核酸合成方法化學合成寡核苷酸探針和引物，所述方法包括例如根據 Beaucage和Caruthers (1981)，Tetrahedron Letts. 22(20): 1859 1862描述的固相亞 磷酰胺方法。為了進一步舉例說明，還可以使用三酯法合成寡核苷酸(參見，例如，Capaldi 等人（2000)，"Highly efficient solid phase synthesis of oligonucleotide analogs containing phosphorodithioate linkages"，Nucleic Acids Res. 28(9): e40 ,和E1 drup等人（1994)，"Preparation of oligodeoxyribonucleoside phosphorodithioates by a triester method"，Nucleic Acids Res. 22(10): 1797-1804)。還可以利用本領域已知的其它合成技術，包括、例如，使用自動化的合成儀，如在 Needham VanDevanter等人（1984)，Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168中所述。多種用 于自動化寡核苷酸合成的設備是商購可得的。還任選地利用多核苷酸合成方案(例如，三_ 核苷酸合成等）。此外，引物核酸任選地包括各種修飾。在某些實施方案中，例如，引物包括 限制位點接頭，例如以促進后續擴增子克隆等。為了進一步舉例說明，引物還任選地經過修 飾以改善擴增反應的特異性，如例如美國專利號6,001，611中所述，且探針還可以用如本文 描述的或如本領域以其它方式已知的各種其它修飾進行合成。
[0044]在本發明的反應混合物、方法和其它方面中利用的探針可以具有核苷酸或非核苷 酸標簽。這樣的標簽可以通過本領域已知的多種技術直接地或間接地附著至寡核苷酸。為 了舉例說明，取決于使用的標簽的類型，標簽可以附著至末端(寡核苷酸引物和/或探針的 5'或3'末端)或非末端核苷酸，并且可以通過各種大小和組成的接頭或間隔臂間接地附著。 使用商購可得的亞磷酰胺試劑，經由適當保護的亞磷酰胺，可以產生在5'或3'末端處含有 官能團（例如，硫醇或伯胺）的寡核苷酸，并且可以使用例如以下文獻中所述的方案將標簽 附著至這樣的寡核苷酸：Innis等人（編）PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990)(Innis)〇
[0045] 基本上任何核酸(標準的或非標準的，標記或未標記的）可以從多種商業來源中的 任一種定制或標準定購，諸如The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX)、 Operon Technologies Inc. (Huntsville, AL)、Proligo LLC (Boulder, CO)及許多其它 公司。
[0046] 在使用質譜法檢測PCR產物時，特別在用于檢測大量靶核酸的多路場合中，存在許 多挑戰。Beer等人(Analyst，2012，137: 5325-5333)描述了使用液相層析-電噴射電離質 譜法的多路PCR-基因分型測定，其用于檢測來自14個基因的23種不同的SNP。來自這些SNP 位點的擴增子的長度是在從78 bp至130 bp的范圍內。但是，已知的是，長擴增子不會較好 地離子化且難以通過質譜法分離。此外，由于A:T和G:C堿基對之間的小質量差異，雙鏈PCR 產物可以使分析復雜化。因此，在PCR期間產生的短且獨特的靶片段的應用將更易于檢測， 導致更高的靈敏度，并且提供更好的成功多路化的機會。
[0047]幾項最近的研究已經公開了含有可切割的"標簽"部分的寡核苷酸探針的應用，所 述"標簽"部分可以容易地分離和檢測（例如美國專利公開號2005/0053939;美國專利號8， 133,701)。但是，由于"標簽"分子的復雜性質（在美國專利公開號2005/0053939的情況下） 或給定靶核酸的多個片段的產生(在美國專利號8,133,701的情況下），這些研究在它們的 執行靶核酸的多路檢測的能力方面受到限制。在任一種情況下，在多路場合內難以準確鑒 定特定靶核酸的存在或不存在。本發明解決了該問題，在本發明中，寡核苷酸探針的5'翼部 分和互補部分被接頭隔開，其中在具有5'核酸酶活性的酶切割以后，將為每個單獨的靶核 酸產生由5'-翼、接頭和在互補部分的5'端上的一個另外核苷酸組成的單一"獨特質量"片 段，所述片段然后可以通過質譜法明確地檢測和分辨。
[0048]具有質量可區分的大小(MDF)的片段通過特定物理屬性或檢測特征(包括、但不限 于長度、質量、電荷或荷質比）來區別。在一個優選的實施方案中，所述檢測特征是質量。在 另一個有關的實施方案中，MDF可以通過與物理屬性相關的行為來區別，包括、但不限于質 量、在MALDI-T0F質譜法中的飛行時間。在一個有關的實施方案中，來自一種或多種寡核苷 酸探針的MDF被釋放且從質譜基質選擇性地解吸，使得非選擇性引物和寡核苷酸探針（即不 存在靶核酸）不解吸。對于這些實施方案，與寡核苷酸探針或反應混合物中存在的其它非 MDF相比，MDF應從質譜基質更有效地解吸。優選的質譜基質包括2，5-二羥基苯甲酸、α-氰 基-4-羥基肉桂酸、3-羥基吡啶甲酸(3-ΗΡΑ)、檸檬酸二銨(DAC)和它們的組合。在另一個實 施方案中，質譜基質可以設計用于蛋白質分析。用于蛋白質分析的示例性基質包括、但不限 于DHB和CHCA。
[0049]該方法可以進一步包括使一種或多種寡核苷酸探針片段（即，MDF)與未切割的或 部分地切割的寡核苷酸探針分離的另外步驟。可以使用捕獲配體(諸如生物素或其它親和 配體)和與所述捕獲配體具有特異性結合活性的捕獲試劑(諸如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈 菌素、抗體、受體、與MDF互補的捕獲探針或其功能片段)來完成分離。MDF可以含有對捕獲試 劑具有特異性結合活性的捕獲配體。捕獲配體和捕獲試劑還可以用于給MDF的剩余部分添 加質量，使得它可以從質譜儀中檢測的MDF的質量范圍中排除。在一個實施方案中，捕獲探 針可以具有用于切割產物的通用擴增的通用引物。
[0050] 分離步驟還可以用于從MDF中除去鹽、酶或其它緩沖液組分。本領域眾所周知的幾 種方法諸如層析、凝膠電泳或沉淀可以用于提純樣品。例如，尺寸排阻層析或親和層析可以 用于從樣品除去鹽。分離方法的選擇可以取決于樣品的量。例如，當少量樣品可獲得或使用 小型化儀器時，可以使用微量親和層析分離步驟。另外，是否需要分離步驟，以及分離方法 的選擇，可以取決于使用的檢測方法。例如，通過從樣品除去鹽，可以改善基質輔助的激光 解吸/電離和電噴射電離的效率。例如，鹽可以吸收來自基質輔助的激光解吸/電離中的激 光的能量并且導致更低的電離效率。
[0051] 質譜法是檢測本發明的具有質量可區分的大小(MDF)的片段的優選方法，并且因 此鑒定和/或定量靶核酸。MDF可以在質譜儀中離子化，并且離子基于它們的質荷比在空間 或時間中分離。質譜儀然后計算與每種離子相關的質量。因此，當提及質譜法時，術語質量 可以用于簡潔描述質荷比。
[0052]質譜法是用于分離和鑒定分子的靈敏且準確的技術。通常，質譜儀具有兩個主要 部件，即用于產生離子的離子源和用于測量離子的質荷比的質量選擇性分析儀，其是且轉 換成這些離子的質量的測量。幾種電離方法是本領域已知的并且在本文中描述。MDF可以在 從寡核苷酸探針切割之前、期間或之后是帶電的。結果，通過質譜法測量的MDF不總是需要 電荷，因為電荷可以通過質譜法操作來獲得。在質譜法分析中，MDF的任選組分諸如電荷和 檢測部分可以用于給MDF貢獻質量。
[0053] 如本文中所述的不同質譜法方法例如四極質譜法、離子阱質譜法、飛行時間質譜 法、氣相層析質譜法和串聯質譜法可以利用離子源和質量分析儀的各種組合，其允許在設 計定制的檢測方案中的靈活性。另外，質譜儀可以程序化成將來自離子源的所有離子依次 或同時傳遞進質譜儀。此外，質譜儀可以程序化成選擇特定質量的離子用于傳遞進質譜儀， 同時阻斷其它離子。
[0054] 精確地控制質譜儀中的離子移動的能力允許檢測方案中的更多選項，當分析例如 來自多路實驗的大量mMDF時，這可以是有利的。例如，在具有大量MDF的多路實驗中，可以有 利的是，從一組相似報道分子中選擇個別報道分子且然后分別分析該報道分子。基于控制 通過質譜儀檢測的質量范圍的另一個優點包括從分析中排除未切割的或部分地切割的帶 標簽的探針的能力，這會降低來自測定的背景噪音。
[0055] 質譜儀可以分辨具有小質量差異的離子，并且以高準確度測量離子的質量。因此， 相似質量的MDF可以一起用于相同實驗中，因為質譜儀可以區分甚至緊密相關的標簽的質 量。使用質譜法方法達到的高分辨程度和質量準確度允許使用帶標簽的探針的大集合，因 為所得到的報道標簽可以彼此區別。當設計多路實驗時，使用帶標簽的探針的大集合的能 力是一個優點。
[0056]使用質譜法用于檢測MDF的質量的另一個優點是基于這類質量分析的高靈敏度。 通過利用由離子源形成的大部分離子且將這些離子通過質量分析儀有效地傳遞給檢測器， 質譜儀實現高靈敏度。因為該高靈敏度水平，使用質譜法可以測量甚至有限量的樣品。這可 以是多路實驗中的一個優點，在所述多路實驗中每個MDF種類的量可以很小。
[0057] 質譜法方法是本領域眾所周知的（參見Burlingame等人.Anal. Chem. 70: 647R-716R (1998);Kinter和Sherman， Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, New York (2000))。與質譜法方法相 關的基本過程是產生從樣品衍生出的氣相離子并測量其質量。
[0058]使用在質譜儀中產生的電磁場，可以精確地控制氣相離子的移動。離子在這些電 磁場中的移動與離子的m/z成比例，并且這構成測量樣品的m/z并因此測量樣品的質量的基 礎。離子在這些電磁場中的移動允許離子被包含和集中，這解釋了質譜法的高靈敏度。在m/ z測量過程期間，離子以高效率傳遞給顆粒檢測器，所述顆粒檢測器記錄這些離子的到達。 在每個m/z處的離子數量通過圖上的峰來證實，在圖中X軸是m/z，并且y軸是相對豐度。不同 的質譜儀具有不同的分辨水平，也就是說，分辨在質量上緊密相關的離子之間的峰的能力。 分辨率定義為R=m/S m，其中m是離子質量，并且δπι是質譜圖中兩個峰之間的質量差異。例如， 具有1000的分辨率的質譜儀可以將具有100.0的m/z的離子與具有100.1的m/z的離子區分 開。
[0059] 幾類質譜儀是可獲得的，并且可以以各種構型產生。一般而言，質譜儀具有下述主 要部件:樣品入口、離子源、質量分析儀、檢測器、真空系統和器械控制系統以及數據系統。 樣品入口、離子源和質量分析儀中的差異一般限定器械的類型及其能力。例如，入口可以是 毛細管柱液相層析源，或可以是諸如在基質輔助的激光解吸中使用的直接探針或臺 (stage)。常見的離子源是例如電噴射，包括納米噴霧和微米噴霧或基質輔助的激光解吸。 示例性的質量分析儀包括四極質量過濾器、離子阱質量分析儀和飛行時間質量分析儀。
[0060] 離子形成過程是質譜圖分析的起點。幾種電離法是可獲得的，并且電離法的選擇 取決于待分析的樣品。例如，對于多肽的分析，相對溫和的電離操作諸如電噴射電離(ESI) 可以是合乎需要的。對于ESI，使含有樣品的溶液在高電位穿過細針，所述高電位產生強電 場，從而產生被導向質譜儀的高度荷電的微滴的細噴霧。其它電離操作包括例如快原子轟 擊(FAB)，其使用中性原子的高能束來撞擊固相樣品，從而造成解吸和電離。基質輔助的激 光解吸電離(MALDI)是一種其中使用激光脈沖撞擊樣品的方法，所述樣品已經在吸收紫外 線的化合物基質中結晶。本領域已知的其它電離操作包括例如等離子體和輝光放電、等離 子體解吸電離、共振電離、和次級電離。MDF可以在從帶標簽的探針切割之前、期間或之后變 成尚子化。
[0061] 電噴射電離(ESI)具有可用于本文描述的發明的幾種特性。例如，ESI可以用于難 以電離或蒸發的生物分子諸如多肽。另外，ESI的效率可以是極高的，這會提供用于高靈敏 度測量的基礎。此外，ESI產生來自溶液的荷電分子，這對于分析溶液中的MDF是方便的。相 反，電離操作諸如MALDI要求在電離前使樣品結晶。
[0062] 因為ESI可以直接從溶液產生荷電分子，所以它與來自液相層析系統的樣品相容。 例如，質譜儀可以具有用于液相層析系統(諸如HPLC)的入口，使得級分從層析柱流進質譜 儀內。液相層析系統和質譜儀的這種線內排列有時被稱為LC-MS。LC-MS系統可以用于例如 在質譜法分析前使未切割的或部分地切割的MDF與切割的MDF分離。另外，層析可以用于在 質譜法分析前從MDF樣品除去鹽或其它緩沖液組分。例如，使用線內或離線反相HPLC柱使樣 品脫鹽，可以用于增加電離過程的效率，且因此改善質譜法的檢測靈敏度。
[0063] 多種質量分析儀是可獲得的，其可以與不同離子源配對。不同的質量分析儀具有 不同的優點，如本領域技術人員已知的和如本文描述的。選擇用于檢測的質譜儀和方法取 決于特定測定，例如，當產生少量離子用于檢測時，可以使用更靈敏的質量分析儀。在下文 描述了幾類質量分析儀和質譜法方法。
[0064] 離子迀移率質量(IM)光譜測定法是一種氣相分離方法，其給質譜法(MS)添加新量 綱。IM基于氣相離子的碰撞橫截面來分離它們，并且可以與飛行時間（T0F)質譜法偶聯以產 生用于鑒定和表征蛋白質和肽的有力工具。因此，當MDF是蛋白質或肽時，IM-MS對于本發明 而言具有特殊效用。Verbeck等人在Journal of Biomolecular Techniques(第13卷，第2 期，56-61)中更詳細地討論了頂-MS。
[0065] 四極質譜法利用四極質量過濾器或分析儀。這類質量分析儀由排列為兩套兩個電 連接桿的四個桿組成。當離子從質量過濾器開始移動到末端時，將rf和dc電壓的組合施加 于每對桿，這會產生引起離子的振蕩運動的場。這些場的結果是在一對桿中產生高通質量 過濾器，并且在另一對桿中產生低通過濾器。高通和低通過濾器之間的重疊留下限定的m/ z，其可以穿過兩個過濾器且穿越四極的長度。該m/z被選擇且在四極質量過濾器中保持穩 定，而所有其它m/z具有不穩定的軌跡并且不保留在質量過濾器中。質譜圖如下產生:使施 加的場逐漸變化，使得逐漸增加的m/z被選擇穿過質量過濾器且到達檢測器。另外，通過施 加僅rf場，四極還可以設置為含有且傳遞所有m/z的離子。這允許四極充當質譜儀的特定區 域中的透鏡或聚焦系統，在所述特定區域中需要離子傳遞而無需質量過濾。這可用于如下 文進一步描述的串聯質譜法中。
[0066] 四極質量分析儀、以及本文描述的其它質量分析儀可以程序化成分析限定的m/z 或質量范圍。質譜儀的這種特性對于本文描述的發明是有用的。因為切割的MDF的質量范圍 是在測定前已知的，所以質譜儀可以程序化成傳遞投射的正確質量范圍的離子，同時排除 更高或更低質量范圍的離子。選擇質量范圍的能力可以減小測定中的背景噪音并且因此增 加信噪比。另外，限定的質量范圍可以用于排除任何未切割的寡核苷酸探針的分析，所述未 切割的寡核苷酸探針具有比MDF的質量更高的質量。因此，質譜儀可以完成固有的分離步驟 以及MDF的檢測和鑒定。
[0067] 離子阱質譜法利用離子阱質量分析儀。在這些質量分析儀中，施加場使得所有m/z 的離子最初都被捕集在質量分析儀中且在其中振蕩。離子從離子源穿過聚焦裝置諸如八極 透鏡系統進入離子阱。在激發和穿過電極射出到檢測器前，離子捕集發生在捕集區中。質量 分析通過依次施加電壓來完成，所述電壓以將遞增m/z的離子射出阱且進入檢測器中的方 式增加振蕩的振幅。與四極質譜法相比，所有離子都保留在質量分析儀的場內，除了具有選 定的m/z的那些之外。離子阱的一個優點是，它們具有極高靈敏度，只要小心地限制一次捕 集的離子的數目。通過改變將離子注射到阱內的時間，可以完成離子數目的控制。離子阱的 質量分辨率類似于四極質量過濾器的質量分辨率，盡管離子阱的確具有低m/z限制。
[0068] 飛行時間質譜法利用飛行時間質量分析儀。對于這種m/z分析方法，離子首先通過 在電場（由高電壓產生）中加速獲得固定量的動能。在加速后，離子進入無場或"漂移"區域， 在該區域中它以與其m/z成反比的速度行進。因此，具有低m/z的離子比具有高m/z的離子更 速地行進。測量離子經過無場區域的長度所需的時間，并用于計算離子的m/z。
[0069] 這類質量分析中的一個考慮是，將待研究的離子集合同時引入分析儀內。例如，這 類質量分析非常適合于電離技術如MALDI，其以短的充分確定的脈沖產生離子。另一個考慮 是控制由離子產生的速度分布，所述離子在其動能的量方面具有變動。更長的飛行管、離子 反射器或更高的加速電壓的應用可以幫助使速度分布的效應最小化。飛行時間質量分析儀 具有高靈敏度水平和比四極或離子阱質量分析儀更寬的m/z范圍。另外，用這類質量分析儀 可以快速地獲得數據，因為質量分析儀的掃描不是必要的。
[0070] 氣相層析質譜法會為實時檢測靶標提供良好解決方案。系統的氣相層析(GC)部分 將化學混合物分離成分析物(例如，MDF)的脈沖，并且質譜儀(MS)鑒定和定量分析物。
[0071] 串聯質譜法可以利用上文描述的質量分析儀的組合。串聯質譜儀可以使用根據其 m/z來分離離子的第一質量分析儀，以便分離目標離子用于進一步分析。分離的目標離子隨 后破碎成碎片離子(稱為碰撞活化的解離或碰撞誘導的解離），并且碎片離子由第二質量分 析儀進行分析。這些類型的串聯質譜儀系統被稱為在空間上串聯的系統，因為兩個質量分 析儀通常被碰撞室在空間上分離。串聯質譜儀系統還包括在時間上串聯的系統，其中使用 一種質量分析儀，但是，質量分析儀依次用于分離離子、誘導破碎和隨后執行質量分析。
[0072] 空間串聯類別中的質譜儀具有超過一個質量分析儀。例如，串聯四極質譜儀系統 可以具有第一四極質量過濾器，隨后為碰撞室，隨后為第二四極質量過濾器，然后為檢測 器。另一種排列是使用四極質量過濾器用于第一質量分析儀，并使用飛行時間質量分析儀 用于第二質量分析儀，碰撞室將兩個質量分析儀隔開。其它串聯系統是本領域已知的，包括 反射-飛行時間、串聯扇區和扇區-四極質譜法。
[0073] 時間串聯類別中的質譜儀具有在不同時間執行不同功能的一個質量分析儀。例 如，離子阱質譜儀可以用于捕集所有m/z的離子。應用一系列rf掃描功能，其從阱射出所有 m/z的離子，除了目標離子的m/z之外。在目標m/z已被分離后，施加 rf脈沖以產生與阱中的 氣體分子的碰撞，從而誘導離子的破碎。然后通過質量分析儀測量碎片離子的m/z值。離子 回旋加速器共振器械，也被稱作傅里葉變換質譜儀，是在時間上串聯的系統的一個例子。
[0074] 通過控制在實驗的每個階段中選擇的離子，可以執行幾類串聯質譜法實驗。不同 類型的實驗利用質量分析儀的不同操作模式，有時稱為"掃描"。在被稱為質譜圖掃描的第 一個例子中，第一質量分析儀和碰撞室將用于質量分析的所有離子傳遞到第二質量分析儀 內。在被稱為產物離子掃描的第二個例子中，目標離子在第一質量分析儀中進行質量選擇， 然后在碰撞室內破碎。所形成的離子隨后通過掃描第二質量分析儀進行質量分析。在稱為 前體離子掃描的第三個例子中，掃描第一質量分析儀以依次將分析過質量的離子傳遞到碰 撞室內用于破碎。第二質量分析儀對目標產物離子進行質量選擇用于傳遞給檢測器。因此， 檢測器信號是所有前體離子的結果，其可以破碎成共同的產物離子。其它實驗形式包括中 性丟失掃描，其中在質量掃描中表示出恒定質量差異。與多路實驗一樣，當在單個實驗中測 量報道標簽的大集合時，這些不同的串聯質譜法掃描操作的應用可以是有利的。
[0075] 在典型應用中，基于循環閾（Ct)值確定在反應期間生成的MDF量，所述Ct值代表產 生可檢測量的核酸所需的循環的數目。Ct值的確定是本領域眾所周知的。簡言之，在PCR期 間，隨著形成的擴增子的量增加，信號強度增加至可測量的水平，并且在反應進入非對數期 時在以后循環中達到平臺。通過相對于反應的對數期中的循環數目繪制信號強度，可以推 斷出獲得可測量信號時的具體循環，且用于計算在PCR開始之前的靶標數量。確定Ct的示例 性方法描述在例如Heid等人· Genome Methods 6:986-94，1996中，參考水解探針。 實施例
[0076] 實施例1 使用5'-翼探針檢測EGFR T790M擴增 執行PCR測定，以檢測人表皮生長因子受體(EGFR)基因的T790M突變(核苷酸變化2369 C->T)。下述引物用于擴增EGFR基因的包括T790M突變位置的區域： 正向引物：5'CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGA 3'（SEQ ID NO: 1) 反向引物：5'CAGTCGAAGGGCATGAGCTGEA 3'（E=叔丁基芐基-dC) (SEQ ID NO: 2) 為了檢測，使用下述含有兩個連續六甘醇(HEG)分子的5'-翼探針作為接頭： 5'-T9JJTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGP-3'（SEQ ID N0: 3)，其中T9代表非互補的5'-翼部 分，J代表HEG，并且P代表磷酸酯。在96孔板上制備具有下述終濃度的PCR反應混合物:50 mM Tris-HCl(pH 8·0)，80-100 mM氯化鉀，200μΜ每種dATP、dCTP和dGTP，400yM dUTP，200 nM每 種引物，200 nM 5'-翼探針，靶DNA( 1,000-100，000個EGFR質粒拷貝，20 nM DNA聚合酶(具 有5'核酸酶活性），0.1 mM EDTA，2.5 mM乙酸鎂。使用Roche LightCycler?480器械(Roche Applied Science，Indianapolis，Ind.)完成擴增和分析。使用下述溫度分布:95°C保持1分 鐘(或2個95 °C (10秒)至62 °C (25秒）的循環，隨后從92 °C (10秒)至62 °C (25-30秒)循環99次。
[0077] 使反應產物穿過TopTip (Glygen Corp)陰離子交換旋轉柱，用于除去去污劑及其 它污染物，然后裝載到Agilent Q-T0F 6530器械上，并且通過LC-MS分析片段。圖2顯示了來 自該實驗的提取離子層析圖（EIC)，以尋找在大小上與T9JJT和T 9JJTG對應的片段。僅檢測到 與片段T9JJT對應的單個峰，這證實了5 '核酸酶幾乎排它地在鄰近雙HEG接頭分子的3 '側的 核苷酸位置處的切割。在該片段的3 '末端上的"T"核苷酸對應于所述探針的與EGFR基因互 補的部分的5 '末端核苷酸。
【主權項】
1. 一種檢測靶核酸序列在樣品中的存在或不存在的方法，所述方法包括下述步驟： (a) 使包含靶核酸的樣品與下述物質接觸： (i) 一對寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含與靶核酸序列的一條鏈中的一個 區域互補的序列且引發第一延伸產物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含與所述第一 延伸產物中的一個區域互補的序列且引發與所述第一延伸產物互補的核酸鏈的合成，和 (ii) 寡核苷酸探針，其包含至少兩個不同部分，第一部分包含標準核苷酸，具有或不具 有核苷酸類似物，所述第一部分包含與靶核酸序列的一個區域至少部分互補的序列，其中 所述第一部分在所述寡核苷酸引物對所結合的靶核酸序列內對合，并且其中所述第一部分 在3'端處被封閉以阻止通過核酸聚合酶進行的延伸;并且附著至所述第一部分的5'末端的 第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補的 序列；其中所述第二部分與所述第一部分被非核苷酸接頭隔開，所述接頭衍生自單個單元 或被磷酸酯鍵隔開的多個單元，其中所述接頭在所述第一部分和所述第二部分的連接部處 建立失穩區域； (b) 在條件下用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶擴增靶核酸序列，所述條件允許 所述寡核苷酸引物對和所述寡核苷酸探針與所述靶核酸序列對合以及從所述寡核苷酸引 物對合成引物延伸產物，同時所述核酸聚合酶的5 '至3 '核酸酶活性能夠切割對合的寡核苷 酸探針并從其釋放優勢片段，所述優勢片段包含所述寡核苷酸探針的第二部分、所述非核 苷酸接頭和在所述寡核苷酸探針的第一部分的5 '末端處的單個核苷酸;和 (c) 通過質譜法檢測所述優勢片段的存在或不存在，由此檢測所述靶核酸序列在所述 樣品中的存在或不存在。2. 根據權利要求1所述的方法，其中在單個多路化反應中檢測兩種或更多種靶核酸。3. 根據權利要求2所述的方法，其中使用兩種或更多種寡核苷酸探針在單個多路化反 應中檢測兩種或更多種靶核酸。4. 根據權利要求1-3中的任一項所述的方法，其中所述非核苷酸接頭選自丙二醇、六甘 醇(HEG)、三甘醇(TEG)、間隔物亞磷酰胺9、間隔物C12 CE亞磷酰胺和dSpacer CE亞磷酰胺 或它們的組合。5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述非核苷酸接頭選自丙二醇和HEG。6. 根據權利要求1-5中的任一項所述的方法，其中通過質譜儀完成檢測，所述質譜儀選 自基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF) MS、串聯MS、電噴射電離-飛行時間(ESI-T0F)、ESI-離子阱、液相層析(LC)-MS)、氣相層析(GC)-MS)和離子迀移率(ΠΟ-MS。7. 根據權利要求1-6中的任一項所述的方法，其中所述核酸聚合酶是熱穩定的DNA聚合 酶。8. -種包含寡核苷酸探針的組合物，其中所述寡核苷酸探針包含至少兩個不同部分， 其中第一部分包含標準核苷酸，具有或不具有核苷酸類似物，所述第一部分包含與靶核酸 序列的一個區域至少部分互補的序列，使得所述第一部分能夠結合至所述靶核酸序列的該 區域，且其中所述第一部分在3'端處被封閉以阻止DNA聚合酶對所述寡核苷酸探針的延伸； 并且附著至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷 酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補的序列；其中所述第一部分和所述第二部分被非核苷 酸接頭隔開，所述接頭衍生自單個單元或被磷酸酯鍵隔開的多個單元，其中所述接頭在所 述寡核苷酸探針的所述第一部分和所述第二部分的連接部處建立失穩區域。9. 根據權利要求8所述的組合物，其中所述非核苷酸接頭選自丙二醇、六甘醇(HEG)、三 甘醇(TEG)、間隔物亞磷酰胺9、間隔物C12 CE亞磷酰胺和dSpacer CE亞磷酰胺或它們的組 合。10. 根據權利要求9所述的組合物，其中所述非核苷酸接頭選自丙二醇和HEG。
【文檔編號】C12Q1/68GK105899676SQ201480068099
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月18日
【發明人】A.古普塔
【申請人】豪夫邁·羅氏有限公司