用于干細胞的培養基的制作方法

用于干細胞的培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于儲存、保存、培養和/或分化干細胞的培養基。培養基采用分散在水性媒介物中的合成的熱響應共聚物，其允許培養基通過簡單地調整溫度跨過培養基的膠凝溫度容易地在非凝膠狀(流體)形式和凝膠狀形式之間“轉換”。如此，干細胞可以通過以下被容易地捕獲在3D凝膠基質中：將干細胞與非凝膠狀/流體形式的培養基簡單混合、并且然后通過調整溫度跨過培養基的膠凝溫度使培養基膠凝。被包封在凝膠狀形式的培養基內的干細胞然后可在直接使用培養基中的干細胞之前(例如，在治療中或在培養、分化等中)、或在所述干細胞從培養基提取之后的使用之前被保存很長一段時間。
【專利說明】用于干細胞的培養基
[0001] 引言
[0002] 本發明涉及用于儲存、保存、培養和/或分化干細胞的培養基。本發明還涉及使用 本發明的培養基儲存、保存、培養和/或分化干細胞的方法，以及用于形成本發明的培養基 的試劑盒，和包含分散在本發明的培養基中的干細胞的組合物（例如，藥物組合物）。
[0003] 背景
[0004] 干細胞是多年來密集研究的焦點。對干細胞的生物學和功能存在固有的興趣以及 對其潛在的治療用途存在濃厚的興趣。
[0005] 在醫學領域中，研究者認為干細胞具有徹底改變某些人類疾病的治療的潛能。事 實上，很多成體干細胞治療已經存在，諸如在治療白血病中使用的骨髓移植物。在將來，醫 學研究者期望能夠使用源自干細胞研究的技術以治療廣泛范圍的疾病，除了一些其他損害 和狀況之外包括癌癥、帕金森氏疾病、脊髓損傷、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、多發性硬化癥 和肌肉損傷。
[0006] 對于正在進行的干細胞研究和將來基于干細胞的治療的開發，對培養干細胞的有 效且有成本效益的方法存在需求。特別是對能夠在儲存、運輸和培養期間維持干細胞的活 力和表型的培養基存在需求。還對可以：（i)被容易地被滅菌；（ii)消除或最小化生物材料 的存在；并且（iii)當期望時允許干細胞從培養基容易地收集并分離的干細胞培養基存在 需求。
[0007] 目前在市場上的干細胞培養基產品使用動物來源的材料，由于其組成中批次間的 變化性，其是次佳的。
[0008] 因此，本發明的目的是提供滿足一些或所有前述需求的用于干細胞的培養基。
[0009] 發明概述
[0010] 根據本發明的第一方面，提供了用于干細胞的培養基，所述培養基包含分散在水 性媒介物中的合成的熱響應共聚物的顆粒；
[0011] 其中培養基能夠響應溫度變化經受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的變化，并且 在非凝膠狀形式中，培養基包含合成的熱響應共聚物的顆粒的膠狀穩定的水性分散體，并 且在凝膠狀形式中，培養基是提供能夠容納干細胞的支架或基質的凝膠形式；
[0012] 并且其中水性媒介物還包含用于維持干細胞的活力的營養物。
[0013] 根據本發明的第二方面，提供了一種干細胞組合物，所述干細胞組合物包含分散 在根據本發明第一方面的培養基中的一種或更多種干細胞。
[0014] 根據本發明的第三方面，提供了制備根據本發明第二方面的干細胞組合物的方 法，所述方法包括：
[0015] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物（即，干細胞在培養基中的流體分散體）；以及
[0016] (ii)任選地改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式，從 而產生膠凝的干細胞組合物，其中干細胞被分散在膠凝的培養基中。
[0017] 根據本發明的第四方面，提供了儲存或保存一種或更多種干細胞的方法，所述方 法包括：
[0018] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物；
[0019] (ii)改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式并且從而 產生膠凝的干細胞組合物；以及
[0020] (iii)儲存膠凝的干細胞組合物。
[0021] 根據本發明的第五方面，提供了培養干細胞的方法，所述方法包括：
[0022] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物；
[0023] (ii)改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變成凝膠狀形式并且從而 產生膠凝的干細胞組合物；以及
[0024] (iii)在膠凝的干細胞組合物內培養干細胞。
[0025] 根據本發明的第六方面，提供了分化干細胞的方法，所述方法包括：
[0026] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物；
[0027] (ii)改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變成凝膠狀形式并且從而 產生膠凝的干細胞組合物；以及
[0028] (iii)在促進干細胞的分化的條件下培養干細胞。
[0029] 根據本發明的第七方面，提供了從如本文定義的膠凝的干細胞組合物釋放一種或 更多種干細胞的方法，所述方法包括：
[0030] (i)提供膠凝的干細胞組合物，所述膠凝的干細胞組合物包含分散在凝膠狀形式 的根據第一方面的培養基中的一種或更多種干細胞；
[0031] (ii)改變干細胞培養基的溫度使得培養基從凝膠狀形式改變成非凝膠狀形式，從 而產生流體干細胞組合物；以及
[0032] (iii)任選地其后從流體干細胞組合物分離所述干細胞。
[0033] 根據本發明的第八方面，提供了制備根據本發明第一方面的培養基的方法，所述 方法包括使所述合成的熱響應共聚物的顆粒分散在水性媒介物中，所述水性媒介物還包含 用于維持干細胞的活力的營養物。
[0034] 根據本發明的第九方面，提供了用于制備根據本發明第一方面的培養基的試劑 盒，所述試劑盒包括：
[0035] (i)合成的熱響應共聚物的顆粒，如本文定義的；以及
[0036] (ii)水性媒介物，所述水性媒介物還包含用于維持干細胞的活力的營養物。
[0037] 根據本發明的第十方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含根據本發明第 二方面的干細胞組合物和任選地一種或更多種藥學上可接受的賦形劑。
[0038] 根據本發明的第十一方面，提供了根據第十方面的藥物組合物，用于在治療中使 用。
[0039] 根據本發明的第十一方面，提供了根據第十方面的藥物組合物，用于在細胞治療 中使用。
[0040] 根據本發明的第十二方面，提供了如本文定義的培養基用于儲存、保存、培養和/ 或分化一種或更多種干細胞的用途。
[0041] 本領域技術人員將理解的是，除非另有聲明，包括本發明的任何特定方面的任選 的、合適的和優選的特征的特征可以適用于包括本發明的任何其他方面的任選的、合適的 和優選的特征的特征。
[0042] 附圖簡述
[0043] 本發明的實施方案在下文中參考附圖被進一步描述，其中：
[0044] 圖1是d4-甲醇中記錄的PGMA45-PHPMA n。和PGMA 45的蟲NMR光譜。
[0045] 圖2顯示了 10 % w/w PGMA45-PHPMAn。雙嵌段共聚物分散體的損耗模量和儲能模量 的溫度依賴性。臨界凝膠化溫度（CGT)被估計為17°C。
[0046] 圖 3 是 d4-甲醇中記錄的粗 PGMA55-P (HPMAS4-stat-DEGMA36)的1H NMR 光譜。
[0047] 圖 4 顯示了 10% w/w PGMA55 - P(HPMAS4-stat-DEGMA36)雙嵌段共聚物的損耗模量 和儲能模量的溫度依賴性。臨界凝膠化溫度（CGT)被估計為26°C。
[0048] 圖5顯示了凝膠內（培養4天后）的胚胎干細胞聚集物。直至培養期的結束存在 少的聚集物擴展。
[0049] 圖6顯示了 21天之后從凝膠恢復的胚胎干細胞聚集物。聚集物顯示出相對少的 分化的形態學指示。
[0050] 圖7顯示了培養21天之后從凝膠恢復的并且傳代進入標準胚胎干細胞培養的胚 胎干細胞聚集物。在48h之后，形成胚胎干細胞的集落并且從聚集物擴展（標有箭頭的）。
[0051] 圖8顯示了之前在蠕蟲凝膠（worm gel)/細胞復合培養基中孵育21天的胚胎干 細胞聚集物的用抗體表面標志物Tra-1-60 (多能性（pluripotency))、SSEA-4 (多能性）、 SSEA1 (分化）標記的細胞的比例的FACS分析的直方圖。
[0052] 圖9顯示了培養21天之后從凝膠恢復并且傳代進入標準胚胎干細胞培養的胚胎 干細胞聚集物。在培養14天之后，聚集物顯示出形態分化為多種細胞類型。
[0053] 圖10顯示了被平鋪至具有單獨的培養基（對照-無凝膠）的孔的胚胎干細胞凝 聚物的用抗體表面標志物Tra-1-60 (多能性）、SSEA-4 (多能性）、SSEA1 (分化）標記的細 胞的比例的FACS分析的直方圖。
[0054] 圖11顯示了取決于溫度形成不同形態的PGMA-HPMA嵌段共聚物。
[0055] 圖12顯示了 MTS測定。在組織培養塑制品（2D)中和PGMA-PHPMA共聚物凝膠（3D) 中培養NTERA2克隆D1細胞直至7天。
[0056] 圖13顯示了 NTERA克隆D1 EC細胞的肌動蛋白/DAPI染色。蠕蟲凝膠和2D平面 基底（組織培養塑制品）之間的比較顯示了細胞的增殖直至7天。
[0057] 圖14顯示了通過免疫熒光分析的標志物表達。在3D(蠕蟲凝膠）和2D(組織培 養塑制品）中，用視黃酸培養NTERA2克隆D1 EC細胞7、14、21天之后，TRA 1-60多能性標 志物表達（紅色）和DAPI核酸染色（藍色）。在3D (蠕蟲凝膠）和2D (組織培養塑制品） 中，用視黃酸培養NTERA2克隆D1 EC細胞7、14、21天之后，Vin2Pb22分化標志物表達（紅 色）和DAPI核酸染色（藍色）。
[0058] 圖15顯示了通過qPCR分析的標志物表達。Nanog、0ct_04和β 3微管蛋白、h-ASHl 分別為在用視黃酸培養14天之后對NTERA2克隆D1 EC細胞分析的多能性和分化標志物。 值表示為Δ/ACt值。
[0059] 圖16顯示了 HDF細胞活力針對PGMA55-PHPMA135共聚物蠕蟲凝膠的優化。針對在細 胞培養基中產生共聚物蠕蟲凝膠，三種方案被評價。方案1 (在150mM PBS中制備20% w/ v共聚物凝膠，稀釋兩倍并且對PBS透析兩天），方案2 (與方案1相同，但透析7天），方案 3 (與方案2相同，隨后冷凍干燥過夜并且再分散在純細胞培養基（DMEM)中）。利用與細胞 單層的直接接觸測定以及使用ThinCert插入物的間接測定兩者來評價HDF細胞活力。MTT 測定被用來評價在37°C下的細胞活力。實驗以一式三份（N = 3)來實施Γρ〈0. 0l/p〈0. 05。
[0060] 圖17顯示了使用PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠，用于hES細胞集落的凝膠化/去凝膠 化過程。A)機械地收獲在t25容器內的Nutristem中生長的集落并且在8孔ibidi載玻片 上立即凝膠化。使含有細胞集落的凝膠在增濕的培養箱（5% C02/95%空氣）中于37°C維持 超過7、14或21天。B)在每一個時間點之后，將ibidi孔置于冰上5分鐘以引起凝膠化。然 后將含有細胞集落的自由流動的冷的共聚物分散體在含有Nutristem培養基的Cellstart 處理的6孔板中稀釋約10倍以釋放集落。
[0061] 圖18顯示了使用共聚焦顯微術對浸入PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠內的hES細胞集 落的存活/死亡成像。在37°C使用Syto 9和碘化丙啶（PI)染料對浸入蠕蟲凝膠（根據 方案3制備的）內7、14或21天的細胞集落存活/死亡染色之后記錄的代表性熒光顯微圖 像。細胞可滲透的染料Syto-9報告細胞膜完整性（活細胞），而細胞不可滲透的染料PI僅 染色死細胞。Hoechst 33342被用作核復染劑。
[0062] 圖19顯示了 hES細胞集落在其于37°C在使用Nutristem制備的PGMA55-PHPMA135 蠕蟲凝膠中長期儲存之后的恢復。集落恢復％被計算為每個時間點的平均集落恢復（在去 凝膠化之前將SEM對集落的初始數目歸一化）。集落損耗％也被相似地評價。內部對照組 也被包含在該研究中，其中將集落浸入蠕蟲凝膠中約l〇min，冷卻至5°C以引起去凝膠化并 且隨后通過離心分離。實驗在一式三份的孔的樣品中執行，η = 3次獨立實驗。
[0063] 圖20顯示了原始hES集落大小對在37°C于蠕蟲凝膠中長期儲存14天之后、隨 后經由冷卻至5°C的去凝膠化的分離的集落恢復的影響。將hES集落機械地分散在包含 Nutristem細胞培養基的水性PGMA-PHPMA蠕蟲凝膠中并且在37°C儲存14天。然后將集落 通過冷卻至5°C的去凝膠化分離并且隨后將集落平鋪在Cellstart和Nutristem液體培養 基上。（A)-(E)培養5天后多種hES細胞集落的光學顯微圖像。小集落（〈100 μπι)表現出 (Α)隨時間推移最小的生長和分化或（Β)在去凝膠化之后未能旺盛生長。（C)對于尺寸大 于100 μ m的集落，獲得了改進的附著和生長并且（D)對于100-200 μ m的集落，獲得了最佳 生長，其還表現出典型的ES細胞形態。（E)在高密度培養物中，在相對大的（》200 μπι)集 落的邊緣觀察到分化的神經元細胞。痕跡線表示初始去凝膠化后原始集落大小。
[0064] 圖21顯示了在37°C浸入6% w/v PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠內直至21天的hES細 胞的增殖曲線。集落通過在相關時間點（〇、7、14和21天）的去凝膠化而被收獲并且收獲 并定量總DNA，如在實施例9中描述的。將數據對從在第0天接種的集落獲得的初始DNA量 歸一化（作為100% )。數據代表一式兩份的孔中執行的η = 3次實驗的平均值。光學顯 微圖像（參見插圖）表明集落大小隨時間推移的非常小的變化，其與非增殖的觀察結果是 一致的。
[0065] 圖22顯示了免疫標記實驗，其如在實施例9中描述的被實施。（Α)在液體培養基 和Cellstart基質中正常增殖期間hES細胞集落針對ki-67被陽性染色。然后將集落機 械地移除并且在37°C浸入含有Nutristem培養基的PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠內持續（B) 7 天、（D) 14天和（F) 21天。盡管浸入蠕蟲凝膠內，對任何細胞集落（B、D和F)都未檢測到 ki-67蛋白質。在（C)7天、（E) 14天和（G)21天之后通過去凝膠化分離集落，再平鋪至用 Cellstart包被的孔上并且在Nutristem培養基中生長5天，然后實施另外的ki-67的免疫 標記實驗。在所有情況（參見C、E和G)中，ki-67的存在通過陽性染色（Cy3,紅色）來確 認。核復染劑（Hoechst 33342,藍色）。實驗在一式三份的孔中執行，η = 3次獨立實驗。
[0066] 圖23顯示了在18-22°C儲存直至72h之后hES細胞集落的恢復。在每一個時間點 (即24h、48h或72h)之后，將儲存在液體Nutristem中的hES細胞集落返回至正常細胞培 養條件（37°C，于增濕的培養箱（5% C02/95%空氣）中），而將儲存在6% PGMA55-PHPMA135 蠕蟲凝膠內的hES細胞集落通過去凝膠化分離，如之前描述的。將細胞集落留置在細胞培 養箱中過夜以恢復。光學顯微圖像表明在16h的恢復時間段之后細胞集落的典型外觀。
[0067] 圖24顯示了于37°C在傳統的液體3i細胞培養基或使用相同的3i培養基制備的 6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠內儲存24h之后的hES細胞恢復。（A)將于37°C在傳統的液 體3i培養基內儲存24h的個體hES細胞的懸浮液在Cellstart包被的6孔板上培養。（B) 于37°C在增濕的培養箱（5% C02/95%空氣）中儲存24h之后將浸入6% PGMA55-PHPMA135蠕 蟲凝膠內的hES細胞通過去凝膠化分離并且平鋪在Cellstart包被的6孔板上。允許細胞 培養物粘附至Cellstart包被的6孔板上16h并且然后通過光學顯微術檢查。不考慮其儲 存條件，觀察到與多能性干細胞有關的典型形態。
[0068] 圖25顯示了（a)在1. 0%的應用的應變和1. Orad s 1的固定的角頻率下，凝膠強 度（G<、G")對將6%w/v PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠（根據方案3通過將冷凍干燥的共聚 物粉末在4°C分散入多種水性培養基中制備；詳細請參見標記）從37°C冷卻至2°C的溫度 依賴性。（b)凝膠強度（G<、G")在lrads 1的角頻率、37°C下隨應用的應變的變化。（C) 對于多種細胞培養基中的6%w/v PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠，凝膠強度（G<、G")隨角頻 率（在1. 0%的固定的應用應變下）的變化。
[0069] 發明詳述
[0070] 定義
[0071] 除非有相反的特別聲明，根據1巴的一般大氣壓的推定給出所有溫度、溫度范圍、 和對應所述溫度的材料的任何特征/特性。
[0072] 本文中，術語"干細胞"指的是可以分裂并分化為廣泛范圍的特定細胞類型的細 胞，并且還可以自我更新/復制以產生呈其未分化狀態的更多干細胞。盡管干細胞現在可 以人工生長，但是哺乳動物干細胞包括從囊胚的內細胞團分離的"胚胎干細胞"，以及在包 括以下的多種組織中發現的"成體干細胞"：
[0073] -骨髓，其需要通過鉆入骨骼（例如股骨或髂骨）中提取；
[0074] -脂肪組織（脂質細胞），其需要通過抽脂術提取；
[0075] -血液，其需要通過單采術（pheresis)提取，其中血液從供體提取，通過提取干細 胞的機器并且將血液的其他部分返回至供體；以及
[0076] -剛出生后的臍帶血。
[0077] 本文中，"干細胞"包括全能性（totipotent)和多能性（pluripotent)干細胞（其 可以成熟為任何細胞類型），以及多能（multipotent)或單能（unipotent)祖細胞（在其 能變成的細胞類型方面其是更局限的）。最合適地，用于本發明的"干細胞"包括全能性和 /或多能性干細胞，特別是多能性干細胞。
[0078] 本文中，術語"全能性"指的是可以分化為胚胎和胚外細胞類型并且可以導致完整 的活的生物體的構建的干細胞。此類細胞通過融合卵細胞和精細胞來產生，并且通過受精 卵的最初幾個循環的分裂來進一步產生。
[0079] 本文中，術語"多能性"指的是已經從全能性干細胞傳代的干細胞，并且其可分化 為來自以下三個胚層的任何一種的基本上所有細胞類型：即內胚層（內部胃黏膜、胃腸道、 肺）、中胚層（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚層（表皮組織和神經系統）。盡管多 能性細胞可以導致任何胎兒或成體細胞類型，但是其自身不能發育成胎兒或成體生物體， 因為其缺少促成胚外組織（例如，胎盤）的能力。多能性干細胞（諸如卵裂球）可以從哺 乳動物胚胎的內細胞團（ICM)獲得。
[0080] 本文中，術語"多能"或"多能祖細胞"指的是仍可以分化為許多細胞類型，但僅是 密切相關家族的那些的干細胞。如此，多能細胞具有比全能性或多能性干細胞更局限的命 運。多能祖細胞可以長時間自我更新，但不同于多能性干細胞，并不是無限期地。多能祖細 胞也已經被稱為"成體干細胞"或"間充質基質細胞"以表示存在于非胚胎生物體的組織中 的細胞。例如，多能祖細胞可以從骨髓、臍帶血、外周血、乳房、肝臟、皮膚、胃腸道、胎盤和子 宮獲得。多能祖細胞可以包括能夠分化為神經元細胞的神經元干細胞、能夠分化為血細胞 的造血干細胞、能夠分化為骨骼、軟骨、脂肪和肌肉的間充質干細胞、以及能夠分化為肝細 胞的肝干細胞。
[0081] 本文中，術語"分化的細胞"指的是注定成為特定細胞類型且通常不能夠分化為其 他細胞類型的細胞。例如，分化的細胞的實例包括內皮細胞、平滑肌細胞、橫紋肌、皮膚和間 質成纖維細胞、神經元細胞（例如，星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞）、心肌細胞、肝 細胞和胰腺細胞。
[0082] 本文中，"未分化的細胞"是還沒有變為特定細胞類型的干細胞。
[0083] 本文中，提及"分化后的干細胞"意指根據本發明即使用本文描述的干細胞培養基 已經分化的干細胞，并且除非另外聲明不意圖包括已經通過任何其他方法分化的干細胞。
[0084] 本文中，分化的細胞和多能祖細胞包括來源于任何動物不論是人、猴、豬、馬、牛、 綿羊、狗、貓、小鼠或大鼠的那些，優選地來源于人的那些。
[0085] 本文中，術語"水性媒介物"指的是合成的熱響應的共聚物分散遍布其中以形成本 發明的培養基的培養基。水性媒介物必要地包括延長儲存于其中的干細胞的活力的營養 物。如此，水性媒介物可以簡單地允許干細胞存活。但是，水性媒介物可以是或可以包含促 進干細胞生長（即復制）和存活的培養基。此外，水性媒介物可以是、可以包含或可在其中 加入其他分化劑的生長因子，以促進干細胞的原位（in situ)分化。
[0086] 本文中，術語"培養基"，特別是"標準培養基"指的是使哺乳動物細胞能夠體外 生長和存活的培養基。用于本發明的培養基可包括本領域中通常使用的所有有關的培養 基。培養基可以是細胞培養最低培養基（CCMM)，其通常包含碳源、氮源和微量元素 。CCMM 的實例包括，但不限于DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基）、MEM(最低必需培養基）、 BME (Eagle 基本培養基）、RPMI1640、F-10、F-12、α ΜΕΜ(α 最低必需培養基）、GMEM(Glasgow 最低必需培養基）、和IMDM(Iscove改良的Dulbecco培養基）。用于本發明的培養基還可 以包含許多不同添加劑的一種或更多種，如本領域中已知的，例如抗生素諸如青霉素、鏈霉 素、慶大霉素或其組合、氨基酸、維生素、胎牛血清或其替代物。
[0087] 本文中，關于細胞的術語"培養的（caltured) "意指在受控制的環境條件下，通常 維持在37°C并且含有用于哺乳動物細胞的約21 %的氧和約5-10%的0)2的環境中，在定義 的培養基存在下生長的細胞群體。相似地，術語"培養（culturing)"指的是通過在受控制 的環境條件下，通常維持在設定的溫度并提供定義的氧和C0 2的濃度以及任選地其它參數 諸如濕度的培養箱中，并且以設定的速率以受控制的方式攪動使感興趣的一種細胞或多種 細胞生長，來產生細胞的擴大的群體的過程。
[0088] 本文中，術語"有活力的"，當關于細胞使用時，指活細胞。
[0089] 本文中，術語"細胞活力"指的是在給定的樣品中活細胞的比例，其可以通過本領 域中熟知的方法來評價。
[0090] 本文中，術語諸如"保存的活力"、"持續的活力"、"延長的活力"、"持續的儲存壽 命"、"延長的維持"和"延長的存活"可交換地使用，并且指的是與未被本發明的處理方法 (例如，儲存/保存的方法）之一處理的細胞群體或其樣品相比，在經受如此處理的細胞群 體中存活的活細胞的較大比例。
[0091] 本文中，術語"室溫"指的是在20°C至26°C范圍內的溫度。
[0092] 本文中，術語"環境溫度"指的是在約18°C至約32°C范圍內的溫度。
[0093] 在低于其或高于其干細胞培養基變成或開始變成凝膠狀的溫度在本文中被稱作 "膠凝溫度（gelling tempreture)"。本文中，調整溫度"跨過"膠凝溫度意指降低溫度低于 膠凝溫度（在其中當從某點降低溫度之后培養基變成凝膠狀的實施方案中）或升高溫度高 于膠凝溫度（在其中當從某點升高溫度之后培養基變成凝膠狀的實施方案中）。
[0094] 本文中，術語"凝膠狀"被用來描述物質（例如干細胞培養基）的凝膠（即膠狀的） 形式。盡管凝膠可以是硬的或軟的，但是通常本發明的培養基的凝膠形式是軟的。此類凝 膠是非流體的并且通常以其穩定的狀態不會流動。
[0095] 本文中，術語"非凝膠狀"被用來描述物質諸如干細胞培養基的（大體上）的流體 形式。此類流體形式通常表現出可流動的特性。
[0096] 一般描述
[0097] 本發明本質上提供了用于干細胞的培養基（即干細胞培養基），所述培養基能夠 經受可逆凝膠化。因此，該培養基可以通過簡單地調整溫度跨過培養基的凝膠化溫度在非 凝膠狀（流體）形式和凝膠狀形式之間容易地"轉換"。如此，干細胞可以通過以下被容易 地捕獲在3D凝膠基質中：將干細胞與非凝膠狀/流體形式的培養基簡單地混合、并且然后 通過調整溫度跨過培養基的膠凝溫度來使培養基膠凝。被包封在凝膠狀形式的培養基內的 干細胞然后可在直接使用培養基內的干細胞之前（例如，在治療中或在培養、分化等中）、 或在所述干細胞從培養基提取之后的使用之前被保存很長時間段。
[0098] 另外，膠凝的培養基可以被用作用于干細胞的3D培養和/或分化的培養基。培養 基內的營養物可以被改變以促進干細胞的培養。另外的營養物、生長因子或孵育條件可以 被用來促進干細胞分化。如此，本發明的培養基用途極其廣泛。
[0099] 由于本發明的培養基可以適用于在環境溫度或室溫下干細胞的相對長期儲存，提 供了更便利、有成本效益且節能的干細胞儲存系統。特別是，本發明的培養基可以緩解對用 于干細胞的長期儲存和/或運輸的昂貴的冷卻系統的需求。
[0100] 用以產生本發明的培養基的材料是相對便宜的并且可以使用穩健的且可擴展的 合成化學技術來容易地產生。
[0101] 考慮到本發明的培養基是完全合成的，待儲存的干細胞不存在生物污染或干擾的 風險（不同于當動物來源的產品被用來形成此類培養基時）。此外，本發明的培養基的合成 性質有助于更好的批次間再現性并且從而降低不期望的變化性，所述不期望的變化性通常 與生物來源的產品諸如動物蛋白質的使用相關。本發明共聚物的合成性質還允許培養基的 合理調整以優化特性，如需要的。
[0102] 本發明的培養基與干細胞生物相容并且對其無毒。凝膠狀形式的培養基的相對柔 軟性和滲透性使營養物能夠容易地擴散遍及培養基以確保其中包含的干細胞被合適地滋 養并且從而被保存。
[0103] 本發明的培養基易于滅菌，因為其非凝膠狀形式可以通過過濾容易地滅菌（熱響 應共聚物的顆粒的小的尺寸和呈該形式的培養基的流體性質）。
[0104] 在優選的實施方案中，本發明的培養基還是透明的，其使干細胞能夠例如使用光 學顯微鏡在培養基自身中被研究。當培養基另外被用于培養被研究的干細胞和/或使其分 化時，這是特別地有用的。
[0105] 培養基的可轉換形式使干細胞能夠在容器之間靈巧地轉移，并且還可以有助于干 細胞的準確的體積測量和分配。
[0106] 本發明的培養基的可逆凝膠化使能夠靈巧操作儲存于其中的干細胞，因為其可以 在被釋放入非凝膠狀流體形式之前在凝膠狀形式的培養基內儲存一段時間以使干細胞在 被重新捕獲到凝膠狀形式的培養基內之前能夠接收另外的營養物。
[0107] 本發明的培養基還是生物相容的，所以培養基自身可以用作用于干細胞的治療性 施用的藥物載體（carrier)或媒介物（vehicle)，無論是作為植入物的部分、貼劑或干細胞 的其他合適的施用形式。此外，培養基可以被調整使得膠凝溫度對于設想的任何一種治療 用途是合適的。
[0108] 本發明的培養基的許多其他優勢將從以下的描述是明顯的。
[0109] 培養基
[0110] 本發明提供了用于干細胞的培養基，所述培養基包含分散在水性媒介物中的合成 的熱響應共聚物的顆粒；
[0111] 其中培養基能夠響應溫度變化經受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的變化，并且 在非凝膠狀形式中，培養基包含合成的熱響應共聚物的顆粒的膠狀穩定的水性分散體，并 且在凝膠狀形式中，培養基提供能夠容納干細胞的支架或基質；
[0112] 并且其中水性媒介物還包括用于維持干細胞的活力的營養物。
[0113] 合適地，培養基是干細胞培養基。
[0114] 由于合成的熱響應共聚物的顆粒的存在，培養基合適地是熱響應的。
[0115] 培養基合適地能夠響應溫度變化經受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的可逆變 化。這意味著可逆凝膠化的至少一個循環可以被實施，即凝膠化和隨后的去凝膠化（即流 體化）的至少一個循環可（通過合適的溫度變化）被選擇性地引起。在特定的實施方案中， 培養基能夠經過多于一個循環可逆凝膠化，并且合適地可逆凝膠化經過多個凝膠化和去凝 膠化的循環被保持。此類可逆凝膠化允許干細胞重復地被捕獲/包封入本發明的膠凝的干 細胞組合物中并且然后從其釋放。
[0116] 培養基的非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的轉變（并且反之亦然），合適地通過 培養基的相變或狀態改變來表征。相變合適地是由于熱響應共聚物的顆粒的形態的溫度依 賴性改變。在宏觀尺度上，培養基的相變通過培養基的粘度的改變來表征。培養基的非凝 膠狀形式是相對地自由流動的流體并且因此具有相對低的粘度，而凝膠狀形式是基本上無 需支撐的（free-standing)凝膠，其不能自由流動并且因此具有相對高的粘度。
[0117] 培養基的凝膠狀形式合適地是相對軟的凝膠。
[0118] 在優選的實施方案中，培養基在低于膠凝溫度的溫度下以非凝膠狀形式存在并且 在高于培養基的膠凝溫度的溫度下以凝膠狀形式存在。
[0119] 在優選的實施方案中，培養基在環境溫度和/或在室溫下是凝膠狀形式。合適地， 在大于或等于15°C、合適地大于或等于20°C、合適地大于或等于30°C的溫度下是凝膠狀 形式。合適地，培養基在35°C和40°C之間的溫度下是凝膠狀形式。合適地，培養基在直至 45°C、合適地直至60°C的溫度下保持凝膠狀形式。
[0120] 在優選的實施方案中，培養基在小于或等于10°C、合適地小于或等于5°C的溫度 下是非凝膠狀形式。合適地，培養基在低至〇°C、合適地低至-5°C的溫度下保持非凝膠狀形 式。
[0121] 合適地，干細胞培養基的"膠凝溫度"在5°C和30°C之間、合適地在10°C和25°C之 間、合適地在15°C和20°C之間。培養基的膠凝溫度和特性可以通過調整某種關鍵參數諸如 熱響應共聚物或其部分的聚合度、熱響應共聚物的親水性/疏水性平衡、存在于熱響應共 聚物中的特定單體等來改變。如此，本發明提供了調整用于關注的特定應用的培養基的膠 凝溫度的方法。
[0122] 培養基合適地是生物相容的。特別地，培養基自身合適地是對細胞無毒的，特別是 對干細胞無毒的。合適地，在其中存在合適的營養物的培養基中儲存干細胞將保存所述干 細胞的活力。
[0123] 培養基合適地是與哺乳動物細胞特別是人細胞生物相容的（例如，當并入用于治 療應用的組合物諸如藥物組合物中時），并且合適地以治療有效量對哺乳動物物種和/或 細胞是無毒的。這允許培養基用作用于施用干細胞治療（或來源于干細胞的分化的細胞的 治療）的媒介物或藥物載體。
[0124] 培養基合適地以凝膠狀形式是透明的，或至少足夠透明以允許用裸眼和/或通過 合適的放大倍數（例如使用光學或共聚焦顯微鏡）觀察凝膠狀培養基內捕獲的任何細胞。 培養基合適地以非凝膠狀形式是透明的，或至少足夠透明以允許分散于其中的任何細胞通 過裸眼和/或通過合適的放大倍數（例如使用光學或共聚焦顯微鏡）是可視的。這樣的透 明度允許原位分析培養基內的細胞。
[0125] 培養基（任何干細胞/分化后的細胞除外）合適地不含動物來源的產品。合適地， 本發明的培養基無任何熱響應蛋白質、肽或從生物（例如動物）來源獲得的其他生物聚合 物。例如，熱響應共聚物合適地是完全合成的。培養基內使用的熱響應共聚物的合成性質 允許最小化批次間變化（與使用生物體來源的熱響應共聚物的培養基截然不同）并且從而 改進本發明的干細胞培養基的可靠性。
[0126] 在凝膠形式中，培養基提供了特別地適于儲存、保存、培養和/分化干細胞的3D支 架或基質。合適地，支架有效地模擬體內（in vivo)發現的三維（3D)細胞外基質（ECM)。
[0127] 本發明的培養基被合適地配置以允許在凝膠狀形式的培養基中選擇性捕獲或包 封干細胞。然后，干細胞隨后可以被釋放并且通過將培養基轉換回非凝膠狀形式來分離。例 如，干細胞可通過以下被合適地包封在凝膠狀培養基內：首先將所述干細胞與非凝膠狀形 式的培養基混合并且然后通過調整溫度跨過膠凝溫度使得培養基改變為其凝膠狀形式，從 而將干細胞包封在凝膠狀形式的培養基內。這提供了膠凝的干細胞組合物。然后干細胞可 在膠凝的干細胞組合物內被儲存、保存、培養和/或分化。干細胞可通過以下從膠凝的干細 胞組合物/基質合適地釋放：再次通過調整溫度跨過膠凝溫度，使得培養基改變為其非凝 膠狀形式。任選地，然后干細胞可以通過重復整個過程而被捕獲在凝膠狀培養基內。
[0128] 當干細胞從凝膠狀形式的培養基被釋放時（例如通過使得干細胞培養基改變為 其非凝膠狀形式），其可通過本領域中熟知的方法（諸如超濾法和/或離心）合適地從非凝 膠狀形式的培養基提取。
[0129] 已經發現的是，以上概述的過程不會影響干細胞的活力。因此，本發明的培養基是 用于儲存/保存、培養和/或分化干細胞的有用的工具，并且為使用干細胞的研究者、制造 者、治療專家和臨床醫生提供了明顯的益處。
[0130] 本發明的培養基合適地包含1%和30% w/w之間的合成的熱響應共聚物，合適地 2%和20% w/w之間的合成的熱響應共聚物，合適地3%和12% w/w之間的合成的熱響應共 聚物。在特定的實施方案中，本發明的培養基包含3%和7% w/w之間的合成的熱響應共聚 物。在特定的實施方案中，本發明的培養基包含8%和12% w/w之間的合成的熱響應共聚 物。在特定的實施方案中，本發明的培養基包含5%和12% w/w之間的合成的熱響應共聚 物。
[0131] 本發明的培養基包含用于維持干細胞的活力的營養物。可以將此類營養物直接添 加至合成的熱響應共聚物或其分散體以便稀釋合成的熱響應共聚物。可選地，可通過透析 將此類營養物引入合成的熱響應共聚物的分散體。可選地，可通過透析方法和直接添加的 組合將此類營養物引入培養基。
[0132] 合適地，干細胞培養基（基本上）不含表面活性劑，合適地包含小于或等于lwt% 表面活性劑、合適地小于或等于0. 5wt%表面活性劑、合適地小于或等于0. lwt%表面活性 劑、合適地包含零表面活性劑。
[0133] 合適地，干細胞培養基（基本上）不含十二烷基磺酸鈉（即有時在RAFT聚合反應 中使用的一種類型的表面活性劑），合適地包含小于或等于lwt%十二烷基磺酸鈉、合適地 小于或等于〇. 5wt %十二烷基磺酸鈉、合適地小于或等于0. lwt %十二烷基磺酸鈉、合適地 包含零十二烷基磺酸鈉。
[0134] 合成的熱響應共聚物的顆粒
[0135] 合成的熱響應共聚物合適地是合成的，即，其通過合成化學技術形成而不是生物 來源的。
[0136] 熱響應共聚物合適地是生物相容的，并且合適地對干細胞是無毒的。合適地，熱響 應共聚物（基本上）不含表面活性劑。合適地，熱響應共聚物（基本上）不含十二烷基磺 酸鈉。
[0137] 熱響應共聚物合適地在水性媒介物中形成膠束顆粒。這些顆粒合適地經受形態 方面的溫度依賴的改變并且該形態方面的改變被理解為使得培養基從非膠凝的狀態改 變成膠凝的狀態。合適地，形成核心的鏈（即P 2)是熱響應的，其合適地是（基本上）水 (aqueous)/水（water)不溶性的或合適地否則是疏水性的（至少相對于穩定劑鏈（即 PJ)。合適地，穩定劑鏈（即PJ相比形成核心的鏈（即P2)是較不熱響應的并且最合適地 穩定劑鏈（基本上）是非熱響應的，其合適地是（基本上）水溶性的/可溶于水的或合適 地否則是親水性的（至少相對于形成核心的鏈（即P 2))。因此，合適地，形成核心的鏈是共 聚物的熱響應行為的原因。這合適地通過經由以下形成熱響應共聚物的顆粒來實現：以包 括式A的部分（參見以下-這涉及Pi部分）的預形成的水溶性聚合物開始，并且在（基本 上）水溶性的/可溶于水的單體％的存在下（因為這促進最佳顆粒的形成）通過經由RAFT 聚合的鏈延伸在所述聚合物基礎上構建另外的（基本上）水不溶性的/不可溶于水的嵌段 (P2)。合理地改變各共聚單體和聚合物的相對溶解度可以有助于形成這種性質的熱響應共 聚物。對于本領域技術人員而言辨別個體聚合物嵌段是否是水溶性的/可溶于水的和/或 熱響應的是簡單的。
[0138] 顆粒經受形態改變的溫度對應于培養基的膠凝溫度。因此，在一些實施方案中，形 態改變發生在15°C和30°C之間、合適地10°C和30°C之間、合適地6°C和36°C之間。
[0139] 在培養基的"非凝膠狀形式"中，熱響應共聚物的顆粒是聚合物顆粒的膠狀穩定的 分散體。合適地，顆粒是大小小于500nm、并且更合適地小于100nm的納米顆粒。合適地，顆 粒基本上是球形（例如球體或類球體顆粒），合適地為膠束的形式。該非凝膠狀形式天然地 比對應的干細胞培養基的凝膠狀形式更具流動性且粘性較小。培養基的非凝膠狀形式是自 由流動的并且適于將干細胞混合在其中。
[0140] 在培養基的"凝膠狀形式"中，熱響應共聚物的顆粒合適地是具有與非凝膠狀形式 中存在的顆粒不同形態的膠狀穩定的聚合物顆粒。合適地，在培養基的"凝膠狀形式"中， 熱響應共聚物的顆粒合適地是各向異性的"懦蟲（worm) "或"懦蟲狀（worm like) "顆粒。 這些細長的顆粒彼此相互作用以形成培養基的凝膠狀形式。不希望被任何特定的理論所束 縛，認為這些"蠕蟲狀"顆粒彼此相互作用并且該相互作用被認為引起培養基的"凝膠狀形 式"。干細胞培養基的凝膠狀形式雖然不能自由流動但合適地是相對軟的，其促進營養物的 分散并且有助于容納活的干細胞并且從而延長其活力。彈性模數（G'）通常是20-1000Pa、 合適地10-200Pa。
[0141] 此類顆粒的形狀可以使用本領域中已知的合適的電子顯微鏡技術（例如SEM、 TEM)來適當地驗證。
[0142] 熱響應共聚物合適地具有1，000g/mol和100, 000g/mol之間、合適地5, 000g/mol 和 80, 000g/mol 之間、更合適地 7, 000g/mol 和 70, 000g/mol 之間、最合適地 10, 000g/mol 和60, 000g/mol之間的數均摩爾質量（Mn)。
[0143] 熱響應共聚物合適地具有數均摩爾質量（Mn)和重均摩爾質量（Mw)使得1/^在 1. 05和1. 50之間。
[0144] 無論在干細胞培養基的凝膠狀形式或非凝膠狀形式中，熱響應共聚物的顆粒的性 質取決于存在的溫度（即其決定共聚物形態）和共聚物自身的性質（即在所研究的溫度下 其是否形成"球形"顆粒或"蠕蟲狀"顆粒）。
[0145] 熱響應共聚物合適地是兩性共聚物（即包括親水性和疏水性特性兩者）。在許 多實施方案中，熱響應共聚物包含至少一種親水性聚合物嵌段和至少一種疏水性聚合物嵌 段。
[0146] 合適地，熱響應共聚物包含熱響應聚合物嵌段。在特定的實施方案中，熱響應共聚 物包含熱響應聚合物嵌段和非熱響應嵌段，其中非熱響應聚合物嵌段合適地在〇°C和45°C 之間的溫度范圍中（基本上）是非熱響應的。在特定的實施方案中，熱響應共聚物包含熱 響應的第一聚合物嵌段和相比第一聚合物嵌段是較不熱響應的第二聚合物嵌段。
[0147] 在某些實施方案中，熱響應共聚物可由式B來定義：
[0148]
[0149] 其中Pi表示源自單體M i的聚合物組分并且P 2表示源自水溶性單體Μ 2的基本上水 不溶性的聚合物組分。
[0150] 在一定程度上，Pi JpPjP Μ2可以由W0 2011/110841 Α2(謝菲爾德大學，2011年 3月8日提交）中給予其的含義的任一種來定義，這提供了根據本發明的熱響應共聚物（即 適當地排除了非熱響應共聚物）。同樣地，在一定程度上，由式Β定義的熱響應共聚物可以 通過W0 2011/110841 Α2(謝菲爾德大學，2011年3月8日提交）中定義的方法的任一種 來制備，這提供了根據本發明的熱響應共聚物（即適當地排除了非熱響應共聚物）。如此， TO 2011/110841 Α2通過引用被并入本文。期望的熱響應特性可以通過根據本發明將共聚 物分散在水或甚至水性媒介物內并且檢查經過"非凝膠狀"和"凝膠狀"形式之間轉換或反 之亦然的溫度范圍獲得的分散體來適當地驗證。
[0151] 合適地，？1是至少部分水分溶性的/可溶于水的。合適地，P 1是（基本上上）水 溶性的/可溶于水的。合適地，Pi是比P 2更具水溶性/更加溶于水。
[0152]
[0153] 合適地，每一個單體吣選自式M1A、M1B和/或M 1C的單體：
[0154]
[0155] 其中R1、Rw和R 11表示允許P i是至少部分水溶性的M 1AS M i。的取代基，
[0156] R2代表 H、CH 3或 CN，
[0157] Rs代表有效允許Pi是至少部分水溶性的芳環的一個或更多個取代基，并且
[0158] 每一個單體M2選自式Μ 2A和/或Μ 2B的單體：
[0159]
[0160] 其中R3是允許P 2是基本上水不溶性的Μ 2的取代基，并且R4和R6獨立地表示Η或 甲基；
[0161] 或Pi是包括單體M i和單體Μ 2的共聚物，條件是聚合物P i保持水溶性。
[0162] 在本發明的實施方案中，？1是共聚物，其包括以上定義的式M1A、M 1B和M1C的兩個或 更多個單體吣。
[0163] 在可選的實施方案中，？1是包括選自以上定義的Μ 1A、M1B和M 1C的單體的單一單體 Mi的均聚物。
[0164] 在一個實施方案中，包括式Μ 1A或Μ 1B的單體的均聚物或共聚物。
[0165] 在一個實施方案中，？1是包括式Μ 1A的單體的均聚物或共聚物。
[0166] 在一個實施方案中，Pi是包括單體I和單體Μ 2A的共聚物，條件是聚合物Pi保持 水溶性。
[0167] 在本發明的另外的實施方案中，匕是共聚物，其中單體M2選自以上定義的式M 2A和 M2B的兩個或更多個單體。
[0168] 在可選的實施方案中，P2是包括選自式Μ 2A和Μ 2B的單體的單一單體Μ 2的均聚物。
[0169] 合適地，Ρ2是包括選自式Μ2Α的單體的單體Μ2的聚合物或共聚物。因此，在特定的 實施方案中，？ 2是包括式Μ 2Α的單體的聚合物或共聚物。
[0170] 在某些實施方案中，無論Ρ2是共聚物或均聚物，？2可以另外地包括交聯的單體單 元（諸如，例如EGDMA)。在其他實施方案中，？ 2不包括任何交聯的單體單元。
[0171] 在本發明的優選的實施方案中，PJP Ρ2兩者均是如以上定義的均聚物。
[0172] 在一個實施方案中，熱響應共聚物由式Β來定義，并且Pig身是包含單甲基丙烯 酸甘油酯（GMA)單體單元的聚合物或共聚物，并且匕自身是包含甲基丙烯酸2-羥基丙酯 (HPMA)單體單元的聚合物或共聚物。PJP/SP2可以是均聚體，例如分別是聚（單甲基丙 烯酸甘油酯）（PGMA)和聚（甲基丙烯酸2-羥基丙酯）（PHPMA)。可選地P 2或P JP P 2 二者可以是共聚物或基本上是摻雜其他單體單元的均聚物。例如，鑒于？:可以是均聚物聚 (單甲基丙烯酸甘油酯）（PGMA)嵌段，P2可以是包括GMA和HPMA單體單元兩者的共聚物嵌 段或P 2可以是包括甲基丙烯酸二甘醇酯（DEGMA)和HPMA單體單元兩者的共聚物嵌段。
[0173] 在特定的實施方案中，熱響應共聚物是選自包括以下的組的式BtPfPj的嵌段共 聚物：
[0174] 1. PGMA-PHPMA。PGMA嵌段可以合適地具有在10和200之間、合適地在25和100 之間、合適地在30和80之間的聚合度（DP)。PHPMA嵌段可以合適地具有在50和300之間、 合適地在60和280之間、合適地在70和250之間的聚合度（DP)。
[0175] 2. PGMA-P(GMA-HPMA)。PGMA嵌段可以合適地具有10至120的聚合度（DP)。 P(GMA-HPMA)嵌段可以合適地具有在20和200之間、合適地在50和150之間、合適地在70 和120之間的聚合度（DP)。在P(GMA-HPMA)嵌段內的GMA與HPMA單體單元的比合適地在 10:1和1:10之間、合適地在1:1和1:5之間、合適地在1:2和1:3之間。
[0176] 3. PGMA-P(DEGMA-HPMA)。PGMA嵌段可以合適地具有在10和200之間、合適地在 30和100之間、合適地在40和60之間的聚合度（DP)。P(DEGMA-HPMA)嵌段可以合適地具 有在20和200之間、合適地在50和150之間、合適地在70和120之間的聚合度（DP)。在 P (DEGMA-HPMA)嵌段內的DEGMA與HPMA單體單元的比合適地在10:1和1:10之間、合適地 在1:1和1:5之間、合適地在1:2和1:3之間。
[0177] 熱響應共聚物的顆粒在其包括在本發明的干細胞培養基內之前使用合適的合成 過程合適地預形成。但是，在某些實施方案中，熱響應共聚物的顆粒可以在水性培養基內原 位形成，該水性培養基是或（在加入合適的營養物之后）成為干細胞培養基的水性媒介物。 盡管從處理的角度來說，在產生干細胞培養基之前以其"非凝膠狀"形式（即膠狀分散的流 體樣形式）初始地形成顆粒或至少將其轉化成其"非凝膠狀"形式是更加便利的，顆粒可以 以其"凝膠狀"或"非凝膠狀"形式（例如，作為分別地為蠕蟲或球形）被初始形成。
[0178] 在優選的實施方案中，熱響應共聚物的顆粒被預形成并且然后在其用于干細胞培 養基之前被超濾。最合適地，在所述顆粒以其"非凝膠狀"形式的同時將所述顆粒超濾（即 超濾作為膠狀穩定的聚合物顆粒的水性分散體，優選地基本上是"球形"顆粒）。合適地，這 樣的超濾在低溫下執行，合適地其中當其被超濾時，膠狀穩定的共聚物顆粒的預過濾的水 性分散體是在10°c或低于10°C、更合適地在5°C或低于5°C的溫度下。顆粒在其包括在干 細胞培養基內之前以這種方式合適地超濾以將顆粒滅菌。但是，這樣的超濾也可以便利地 移除顆粒的形成中涉及的試劑和副產物。然后將顆粒合適地分散在水性媒介物中或水性培 養基中，其隨后被調整以形成本發明的水性媒介物。
[0179] 在本發明的特定實施方案中，熱響應共聚物的顆粒通過受控的合成聚合方法、最 優選地通過聚合誘導的自組裝法（即從而顆粒在水性聚合反應介質中原位形成）來預形 成。在特定的實施方案中，熱響應共聚物的顆粒使用在水性分散體聚合條件下執行的可逆 加成-斷裂鏈轉移（RAFT)類型聚合過程來制備。在特別優選的實施方案中，在一定程度上， 熱響應共聚物的顆粒通過W0 2011/110841 A2(謝菲爾德大學，2011年3月8日提交）中定 義的方法的任一種來制備，這提供了根據本發明的熱響應共聚物（即合適地排除非熱響應 共聚物）。此類技術對于以受控制的和可再生的方式制備雙嵌段共聚物的膠體顆粒是理想 的。如此，W0 2011/110841 A2通過引用被并入本文。期望的熱響應特性可以通過根據本 發明將共聚物分散在水或甚至水性媒介物內并且檢查在經過"非凝膠狀"和"凝膠狀"形式 之間的轉換或反之亦然的溫度范圍內獲得的分散體來合適地驗證。
[0180] 在特定的實施方案中，熱響應共聚物的顆粒通過在水基培養基中形成如以上定義 的式B的嵌段共聚物來形成，所述式B的嵌段共聚物通過以下形成：將以下（a)與（b)混 合，并且啟動在水性分散體聚合條件下執行的可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT)聚合以提供式 B的嵌段共聚物：
[0181] (a)包括式A的部分的水溶性聚合物
[0182]
[0183] 其中X表示Pi的末端基團，至少一些基團X是鏈轉移劑（CTA)末端基團，
[0184] (b)如以上定義的單體M2。
[0185] 合適地，形成式B的嵌段共聚物的可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT)聚合（基本上） 在不存在表面活性劑的情況下被執行。合適地，形成式B的嵌段共聚物的可逆加成-斷裂 鏈轉移（RAFT)聚合（基本上）在不存在十二烷基磺酸鈉的情況下被執行。合適地，形成式 B的嵌段共聚物的可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT)聚合被執行，使得如果任何表面活性劑存 在，總表面活性劑與包括式A的部分的水溶性聚合物的重量比是1:25或更小（即更少的表 面活性劑）、合適地1:100或更小、合適地1:200或更小。合適地，形成式B的嵌段共聚物的 可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT)聚合被執行，使得如果任何表面活性劑存在，總表面活性劑 與單體M 2的重量比是1:25或更小（即更少的表面活性劑）、合適地1:100或更小、合適地 1:200或更小、合適地1:1000或更小。
[0186] 在特定的實施方案中，熱響應共聚物由式B來定義：
[0187]
[0188] 其中，Pi表示來源于單體M i (其也合適地是基本上水溶性的/可溶于水的）的基 本上水溶性的（或可溶于水的）聚合物組分并且匕表示來源于水溶性（或可溶于水的）單 體％的基本上水不溶性的（或不可溶于水的）聚合物組分；
[0189] 其中：
[0190] i)形成核心的鏈（即P2)是熱響應的并且穩定劑鏈（即PJ是非熱響應的；或者
[0191] ii)穩定劑鏈（即PJ比形成核心的鏈（即P2)較不熱響應并且最合適地穩定劑 鏈是（基本上）非熱響應的。
[0192] 如前述的，在一定程度上，？1為、？2和12可以通過冊2011/110841八2(謝菲爾德 大學，2011年3月8日提交）中給予其的含義的任一種來定義，這提供了根據本發明的熱響 應共聚物（即合適地排除了非熱響應共聚物）。
[0193] 水件媒介物
[0194] 水性媒介物包含水和用于干細胞的合適的營養物。水性媒介物合適地包含 80-9 5wt %的水。營養物可以是本領域中已知的任何合適的細胞培養營養物。
[0195] 水性媒介物合適地包含緩沖鹽水，諸如磷酸鹽緩沖鹽水。
[0196] 在一個實施方案中，水性媒介物可以是或可以包括本領域中已知的水性培養基。
[0197] 水性媒介物合適地包含干細胞培養基、合適地人干細胞培養基、最合適地人胚胎 干細胞培養基（例如來自Invitrogen的K0-DMEM培養基）作為營養物。此類干細胞培養 基自身合適地被提供作為相關營養物的水性溶液或分散體。合適地，水性媒介物包含至少 20% w/w的干細胞培養基、合適地至少40% w/w的干細胞培養基。合適地，水性媒介物包含 至多97% w/w的干細胞培養基、合適地至多95% w/w的干細胞培養基、合適地至多80% w/ w的干細胞培養基、合適地至多60% w/w的干細胞培養基。
[0198] 培養基還可以包含促進干細胞分化為期望的細胞類型的生長因子或其他營養物。
[0199] 干細朐
[0200] 任何干細胞都可以被用于本發明的培養基。
[0201 ] 在某些實施方案中，用于與本發明的方法和培養基一起使用的干細胞是哺乳動物 干細胞，最合適地人干細胞。在特定的實施方案中，干細胞是胚胎干細胞（例如人胚胎干細 胞）。然而，此類胚胎干細胞合適地是干細胞而不是通過涉及破壞人胚胎和/或人胚胎干細 胞的方法產生或獲得的那些。在可選的實施方案中，干細胞是非胚胎（例如成體）干細胞。
[0202] 合適地，干細胞基本上是未分化的。合適地，干細胞是多能性干細胞。
[0203] 胚胎干細胞合適地從囊胚的內細胞團分離。
[0204] 非胚胎干細胞可以從多種組織獲得和分離，所述組織包括：
[0205] -骨髓，其需要通過鉆入骨骼（例如股骨或髂骨）中提取；
[0206] -脂肪組織（脂質細胞），其需要通過抽脂術提取；
[0207] -血液，其需要通過單采術提取，其中血液從供體提取，通過提取干細胞的機器并 且將血液的其他部分返回至供體；
[0208] -剛出生后的臍帶血。
[0209] 根據本發明使用的干細胞合適地是全能性干細胞或多能性干細胞、最合適地多能 性干細胞。此類多能性干細胞合適地可以分化為來自三個胚層即內胚層（內部胃黏膜、胃 腸道、肺）、中胚層（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚層（表皮組織和神經系統）的任 何一個的細胞類型。可選地，干細胞可以是多能干細胞。
[0210] 本發明的干細胞培養基合適地被配置以將一種或更多種干細胞捕獲/包封在凝 膠基質內，同時干細胞培養基是凝膠狀形式。此類干細胞合適地與相關營養物一起被包封 在3D支架內，所述相關營養物允許干細胞在凝膠中存活并且甚至生長。
[0211] 合適的分離的細胞制品可以是富含多能祖細胞的制品，所述多能祖細胞通常從諸 如骨髓、外周全血、白細胞單采術產物或單采術產物、臍帶血和從組織或器官制備的細胞懸 浮液的來源獲得的。
[0212] 多能祖細胞可以使用本領域中已知的細胞培養、增殖和分離的方法，例如使用如 由本發明的發明人在美國專利號6, 737, 074和6, 503, 731中公開的纖維蛋白微珠來分離。 可選的方法除了其他的以外包括在美國專利號7, 592, 174、5, 908, 782、5, 486, 359和美國 專利申請公布號2010/006819U2009/0124007和2010/0297233中公開的那些。
[0213] 用于細胞富集和/或分離的典型方法包括密度梯度法（例如，Ficoll (R)、膠狀二 氧化硅）、淘洗法、離心、通過低滲休克裂解紅細胞和此類方法的多種組合。例如，從骨髓純 化干細胞需要移除紅細胞和粒細胞，其通常通過Ficoll (R)密度梯度離心、隨后為通過傳 統離心的重復洗滌步驟來完成。
[0214] 用于細胞富集和/或分離的方法還可以包括本領域中已知的用于細胞分離的在 多種類型的過濾器上的過濾。例如，正切流動過濾（還稱為錯流過濾）可以被用于從骨髓 或血液成分的非均勻混合物富集干細胞，如在美國專利號7, 790, 039中公開的。
[0215] 從混合物分離多能細胞還可以并入吸附至合適的基底諸如塑料培養容器的步驟。
[0216] 用于本發明的分離的多能祖細胞包括稱為"間充質干細胞"（本文還稱為"MSC"） 的那些，諸如從骨髓基質和臍帶血獲得的那些，其具有在體外分化為不同細胞類型特別是 軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞和肌細胞的能力。體外研究已經證實了 MSC分化為肌細胞、 神經元樣前體、心肌細胞和可能的其他細胞類型的能力。另外，MSC已經被公開提供用于造 血干細胞擴增的有效飼養層。
[0217] 在特定的實施方案中，干細胞是多能性干細胞、特別地多能性人胚胎干細胞。干細 胞合適地在轉移至本發明的培養基之前被機械地收獲（例如通過移液管）。合適地，干細胞 聚集物被添加至干細胞培養基。合適地，干細胞（或干細胞聚集物）與培養基的體積比在 1:1000和1:5之間、更合適地在1:100和1:10之間、最合適地在1:50和1:20之間。例如， 將約20 μ L的干細胞聚集物（通常每一個聚集物大小為20-200 μ m)添加至約600 μ L的培 養基。
[0218] 將干細朐容納在培養基內
[0219] 當為凝膠狀形式時，培養基能夠容納活的干細胞。此外，培養基中的干細胞維持其 活力經過延長的時間段并且沒有任何表型改變（除非存在促進分化的劑或條件）。
[0220] 合適地，凝膠狀培養基能夠維持干細胞的活力至少7天、合適地至少14天、更合適 地至少21天、更合適地至少28天、最合適地至少56天。假設沒有分化劑（例如生長因子） 被添加至培養基，容納的干細胞被維持在未分化的形式，并且保持有活力的。此類容納的干 細胞合適地可以在從培養基提取之后自我更新/復制。
[0221] 合適地，凝膠狀形式的干細胞培養基能夠取決于干細胞是否被儲存、培養和/或 分化而在環境溫度和/或最佳培養溫度（即30-42Γ )和/或分化溫度下容納活的干細胞。 合適地，凝膠狀形式的干細胞培養基能夠在15°C和42°C之間的溫度下容納活的干細胞。此 類干細胞可以以休眠狀態或停滯態（即其中基本上沒有分化和/或增殖發生）被儲存。
[0222] 制備干細朐培養基的方法
[0223] 本發明提供了制備根據本發明第一方面的培養基的方法，所述方法包括將所述合 成的生物相容的熱響應共聚物的顆粒分散在水性媒介物中，所述水性媒介物還包含用于維 持干細胞的活力的營養物。
[0224] 可分別制備/提供熱響應共聚物的顆粒和水性媒介物并且然后混合在一起。然 后，合成的熱響應共聚物的顆粒合適地在所得培養基藉以以其非凝膠狀形式存在的溫度下 分散在水性媒介物中。
[0225] 熱響應共聚物的顆粒可以通過本文描述的方法中的任何一種被提供，特別是通過 在TO 2011/110841 A2(謝菲爾德大學，2011年3月8日提交）中公開的方法被提供。如 此，所述顆粒合適地通過受控的自由基聚合諸如RAFT聚合被原位形成。合適地，此類顆粒 通過以下形成：
[0226] ⑴提供溶解在聚合介質/溶劑（例如水）中的預形成的聚合物嵌段（比如，PGMA 的嵌段）；以及
[0227] (ii)從所述預形成的聚合物嵌段生長第二聚合物嵌段（例如通過使用合適的單 體啟動另外的聚合例如RAFT聚合），其中所述第二聚合物嵌段致使所得雙嵌段共聚物（基 本上）不可溶于聚合介質/溶劑，并且從而原位形成膠體顆粒。
[0228] 熱響應共聚物的顆粒合適地在并入干細胞培養基之前被滅菌。這樣的滅菌可以通 過超濾來執行。最合適地，顆粒以其非凝膠狀形式被超濾（即當相關膠體顆粒是最小的并 且因此流體粘度被最小化時）。如此，顆粒可以在提供非凝膠狀形式的顆粒（或其對應的分 散體）的合適溫度下被超濾。
[0229] 合適地，熱響應共聚物的顆粒的超濾可通過0. 01-1 μ m過濾器、合適地 0. 3-0. 6 μ m過濾器來執行。在一些實施方案中，過濾器可以是0. 22 μ m或0. 45 μ m的過濾 器。
[0230] 合適地，熱響應共聚物的顆粒待分散入其中的水性媒介物在將熱響應共聚物的顆 粒分散至其中之前被單獨地預形成。然而，水性媒介物可以可選地例如在顆粒已經被初始 地分散在部分形成的水性媒介物（例如水）中之后原位制備。在此類情況下，相關的營養 物可以在顆粒已經合適地分散之后被添加至部分形成的水性媒介物。
[0231] 形成之后，將培養基合適地儲存并與干細胞一起直接使用。
[0232] 干細朐組合物
[0233] 本發明提供了干細胞組合物，所述干細胞組合物包含分散在如本文定義的干細胞 培養基內的一種或更多種干細胞。
[0234] 水性媒介物，特別是其中的干細胞營養物，可以容易地分散遍及凝膠狀形式的培 養基。合適地，取決于干細胞培養基和/或水性媒介物的含量，水性媒介物和/或其中包 含的營養物容易的分散遍及凝膠狀形式的干細胞基質允許包封在其中的干細胞被儲存、保 存、培養和/或分化。
[0235] 干細胞組合物基質可以包含直至10% v/v的干細胞。干細胞基質可以包含至少 0. 5% v/v的干細胞。
[0236] 形成干細朐組合物的方法
[0237] 本發明還提供了制備根據本發明第二方面的干細胞組合物的方法，所述方法包 括：
[0238] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物（即干細胞在培養基中的流體分散體）；以及
[0239] (ii)任選地改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式，從 而產生膠凝的干細胞組合物，其中干細胞分散在膠凝的培養基中。
[0240] 合適地，在啟動干細胞組合物的凝膠化之前，將流體干細胞組合物充分攪拌，合適 地以提供具有一種或更多種干細胞以（基本上）均勻的模式分散的流體干細胞組合物。
[0241] 優選地，然后通過使培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式使干細胞組合物膠 凝，并且從而產生膠凝的干細胞組合物。
[0242] 儲存和/或保存干細朐的方法
[0243] 本發明提供了儲存或保存一種或更多種干細胞的方法，所述方法包括：
[0244] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物；
[0245] (ii)改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式并且從而 產生膠凝的干細胞組合物；以及
[0246] (iii)儲存膠凝的干細胞組合物。
[0247] 在優選的實施方案中，以上方法的步驟（i)合適地在10°C或低于10°C、合適地在 5°C或低于5°C的溫度下用干細胞培養基來執行。
[0248] 改變溫度可以包括取決于培養基的膠凝特性和與其相關的熱響應共聚物，分別增 加或降低溫度高于或低于膠凝溫度。
[0249] 在優選的實施方案中，干細胞培養基低于膠凝溫度為非凝膠狀且高于膠凝溫度為 凝膠狀。如此，以上方法的步驟（ii)合適地包括從最初低于膠凝溫度升高干細胞組合物的 溫度，直至或高于膠凝溫度。最合適地，步驟（ii)包括調整干細胞基質的溫度從在l〇°C或 低于l〇°C直至或高于18°C、合適地直至或高于35°C、最合適地直至約37°C。
[0250] 然后可以將干細胞儲存在膠凝的干細胞組合物中持續合適的時間段。特別地，可 以將干細胞成功儲存在基質內持續至少7天、合適地至少14天、合適地至少21天、合適地 至少28天、合適地至少56天。然而，從業者可以選擇將所述干細胞儲存持續更少的時間。 合適地，在18°C或高于18°C、合適地在35°C或高于35°C、最合適地在約37°C的溫度下存儲 干細胞。
[0251] 干細胞儲存于其中的膠凝的干細胞組合物自身可以合適地被包含于合適地容器 內、最合適地密封的容器內。在一些實施方案中，將干細胞基質儲存在包括至少1% v/v的 C02、合適地至少3% v/v的C02、更合適地至少4. 5% v/v的032的密封的大氣內。合適地， 密封的大氣包括不多于8%的C02、合適地不多于6%的C0 2。密封的大氣合適地具有至少 80%的濕度、合適地至少90%的濕度、合適地約95%的濕度。密封的大氣合適地具有至多 100%的濕度、合適地至多98%的濕度。
[0252] 在將干細胞儲存在本發明的培養基內期間，可以用營養物培養基覆蓋膠凝的培養 基，營養物培養基諸如本文描述的干細胞培養基，特別是人胚胎干細胞培養基。可以將此類 營養物培養基定期替換和/或補充（例如至少每兩天）。該過程可有助于維持干細胞的活 力。
[0253] 除了捕獲和儲存干細胞之外，以上的方法可以包括隨后釋放干細胞的步驟。通常 這包括使得培養基恢復至其非凝膠狀形式以提供流體干細胞組合物（例如通過將溫度調 整至在10°C或低于10°C，或在5°C或低于5°C )，并且還可包括從該流體干細胞組合物提取 干細胞。干細胞可以被機械地提取，例如通過移液管。此類干細胞可以被提取為聚集物，合 適地在引入本發明的培養基之前以相同方式將其收獲。然后干細胞可以以任何合適的方式 被隨后使用。
[0254] 在儲存于本發明的培養基期間特別地持續21天或更少的儲存時間期間，所述培 養基合適地延遲和/或阻止干細胞分化和/或增殖（特別地相比于儲存在標準干細胞培養 基中）。增殖狀態或減少可以通過視覺檢查，例如通過顯微鏡來判斷。分化狀態或減少可以 通過檢查細胞形態和經由用特定的標志物單克隆抗體通過熒光激活細胞分選術（FACS)的 分析來判斷。
[0255] 培養干細朐的方法
[0256] 本發明提供了培養干細胞的方法，所述方法包括：
[0257] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物；
[0258] (ii)改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式并且從而 產生膠凝的干細胞組合物；以及
[0259] (iii)在膠凝的干細胞組合物內培養干細胞。
[0260] 膠凝的干細胞組合物提供了用于培養干細胞的3D凝膠網絡。這不同于標準的2D 細胞培養方法。
[0261] 在優選的實施方案中，在30°C和45°C之間、優選地在35°C至40°C、最優選地37°C 的溫度下用干細胞基質進行培養。
[0262] 培養基可以是水性媒介物自身。在一些實施方案中，水性媒介物被初始地制備為 培養基。在一些實施方案中，可以將另外的成分添加至水性媒介物以產生培養基，例如然后 儲存、保存或分化干細胞。
[0263] 培養基可以合適地包括促進干細胞生長的標準培養營養物。此類標準培養基可以 包括HES培養基和小鼠胚胎成纖維細胞飼養細胞。此類培養基合適地不同于儲存干細胞期 間在本發明的培養基內使用的任何干細胞營養物/培養基。
[0264] 本文中培養干細胞的方法預期包括培養任何分化后的干細胞。
[0265] 培養的方法可以在培養之前或之后另外地包括儲存和/或保存。
[0266] 與儲存或保存干細胞的方法相同，該培養干細胞的方法可以包括隨后的釋放干細 胞的步驟。通常這包括使得干細胞培養基變為非凝膠狀以形成流體干細胞基質，并且還可 以包括從流體干細胞基質提取干細胞。然后干細胞可以以任何合適的方式被使用，包括用 于本文描述的任何應用。
[0267] 分化干細朐的方法
[0268] 本發明提供了分化干細胞的方法，所述方法包括：
[0269] (i)使非凝膠狀形式的根據本發明第一方面的培養基與一種或更多種干細胞接觸 以產生流體干細胞組合物；
[0270] (ii)改變培養基的溫度使得培養基從非凝膠狀形式改變為凝膠狀形式并且從而 產生膠凝的干細胞組合物；以及
[0271] (iii)在促進干細胞的分化的條件下培養干細胞。
[0272] 在優選的實施方案中，在30°C和45°C之間、優選地35°C至40°C、最優選地37°C的 溫度下用干細胞基質實現培養。
[0273] 促進干細胞分化的合適的劑可以從一開始就存在于培養基中或可選地，可以在培 養期間（例如，在儲存、保存或甚至培養干細胞之后）被加至膠凝的干細胞組合物。
[0274] 所述方法可以包括在干細胞分化之前或之后的細胞培養。在一些實施方案中，此 類分化和培養可以在原位進行，但是合適地是順序地而不是同時地進行。
[0275] 分化的方法可以另外地包括在干細胞分化之前或之后儲存和/或保存細胞。
[0276] 與儲存或保存干細胞的方法相同，該分化干細胞的方法可以包括隨后的釋放干細 胞的步驟。通常這包括使得干細胞培養基變為非凝膠狀以形成流體干細胞基質，并且還可 以包括從流體干細胞基質提取干細胞。然后干細胞可以以任何合適的方式被使用，包括用 于本文描述的任何應用。
[0277] 用于儲存、保存、培養和/或分化干細朐的試劑倉
[0278] 本發明提供了用于制備根據本發明第一方面的培養基的試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0279] ⑴如本文定義的合成的熱響應共聚物的顆粒；以及
[0280] (ii)水性媒介物，所述水性媒介物任選地還包含用于維持干細胞的活力的營養 物。
[0281] 在混合水性媒介物之前可以在水性媒介物（例如水）中預形成顆粒。可選地，可 以將共聚物提供為分散在水性媒介物中的固體，從而其自發地形成合適的膠體顆粒。
[0282] 合適地，水性媒介物還包括用于干細胞的營養物，但是在某些實施方案中這些可 以被分別添加并且形成試劑盒的不同組分。
[0283] 細朐治療和藥物組合物
[0284] 本發明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含根據本發明第二方面的干細胞 組合物和任選地一種或更多種藥學上可接受的賦形劑。
[0285] 本領域中已知的任何合適的藥物賦形劑可以被使用。設想本發明的大多數藥物組 合物將是包含本發明的干細胞組合物的注射劑、輸注劑或植入物。
[0286] 根據本發明的第十一方面，提供了如本文定義的藥物組合物，用于在治療中使用。
[0287] 根據本發明的第十一方面，提供了如本文定義的藥物組合物，用于在干細胞治療 中使用。
[0288] 根據本發明的第十二方面，提供了如本文定義的培養基用于儲存、保存、培養和/ 或分化一種或更多種干細胞的用途。
[0289] 當將如上文定義的細胞或干細胞基質以合適的劑量范圍施用時，預期沒有不利的 毒物學作用。
[0290] 用于在治療中使用的本發明的細胞或干細胞組合物的有效量是足以緩解研究的 身體狀況的癥狀、減慢所述身體狀況的進展、或降低具有身體狀況的患者（例如人）中的癥 狀惡化的風險的量。
[0291] 根據熟知的醫學原則，本發明的細胞或干細胞組合物的用于治療或預防目的的劑 量大小將根據狀況的性質和嚴重度、動物或患者的年齡和性別以及施用途徑自然地變化。
[0292] 本文定義的細胞和干細胞組合物可以被用于的治療最合適地是細胞治療，尤其是 干細胞治療。預期接受此類治療的受試者合適地是人或動物受試者。治療可以包括用于以 下的治療：細胞缺損（例如組織缺損、軟骨缺損、骨缺損、骨疾病）、骨關節炎、骨質疏松癥、 脊髓損傷、牙周病、心肌梗死、癌癥、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、多發性硬化癥、 肌肉退行性紊亂和肌肉損傷。例如，治療可以包括骨髓移植以治療白血病。本發明的細胞 和干細胞基質可以被用于組織和/或器官的恢復、重建和/或更換。
[0293] 本發明的培養基還可以被用以維持從在某些治療過程期間的患者獲得的干細胞， 諸如維持從在密集的癌癥化學治療或放射治療過程期間的患者的骨髓獲得的干細胞。然 后，在醫學治療后，可以將干細胞重新引入至患者。 實施例
[0294] 材料和方法
[0295] 所有試劑購自Sigma-Aldrich并且直接使用，除非另外注明。GMA單體由GE0 Specialty Chemicals (Hythe, UK)提供并且 HPMA 單體購自 Alfa-Aesar (Heysham, UK) 〇
[0296] 使用DMF作為洗脫液通過凝膠滲透色譜法（GPC)評價分子量分布。GPC裝置包括 兩個Polymer Laboratories PL凝膠5 μ m混合C柱和一個維持在60°C的PL極性凝膠5 μ m 保護柱，與Varian 390LC折光率檢測器聯用。DMF流動相包含10mM LiBr并且流速是1. OmL min ^十種近似單分散的聚（甲基丙烯酸甲酯）標準物（Mp= 625 - 618, 000g mol 4被用 于校準。使用近似單分散的聚（甲基丙烯酸甲酯）校準標準物從GPC曲線計算數均分子量 (Mn)和 Mw/Mn。
[0297] 使用Bruker AVl-400MHz分光儀在d4-甲醇中記錄1H NMR光譜。
[0298] 使用在100kV下運行的配備Gatan lk CCD相機的Philips CM 100設備實施透射 電子顯微術（TEM)研究。碳包被的銅載網被輝光放電20-30秒以創建親水性表面。然后將 載網浸入水性嵌段共聚物分散體（0. 5w/w% )中lmin并且然后浸入甲酸鈾酰溶液（0. 75% w/v)中20s用于負染色。然后用濾紙將每一個載網印跡并且使用真空管干燥。
[0299] 實施例1 :通討在磷酸鹽緩沖鹽水中的RAFT水件分散體聚合合成聚（單甲基丙燔 酸甘油醅）-聚（甲基丙燔酸2-羥基丙醅）（PGMA-PHPMA)蠕蟲凝膠伸用2-氰丙基二硫代 苯甲酸醅（CPDB)合成聚（單甲基丙燔酸甘油醅）macro-CTA
[0300] 將 CPDB(0.576g，80%純度，0.00208mol)和 GMA(20.00g，125.0mol，60 當量）稱重 進入 250ml 圓底燒瓶并且用 N2凈化 20min。添加 ACVA(0. 117g，0. 416mmol，[CPDB]/[ACVA] =5. 0)并且將燒瓶脫氣持續另外的5min。添加脫氣的無水乙醇（30ml)并且將燒瓶脫氣持 續另外的5min，然后浸入設定在70°C的油浴。在115min之后，粗產物的 1H NMR分析表明 單體轉化率為71%。通過從甲醇重復沉淀入過量二氯甲烷兩次，將獲得的？6獻!^(^〇-〇^ 純化，然后溶解在水中并且冷凍干燥過夜以產生粉紅色粉末，其通過 1H NMR光譜法被鑒定 為純度>99%。
[0301] 通過1H NMR確定的平均聚合度為45 (參見圖1)。
[0302] DMF GPC 分析（相對 ΡΜΜΑ 標準物）：Mn= 13,800g mol 1 Mw/Mn= 1. 13〇
[0303] 合成PGMA^ - PHPMA^雙嵌段共聚物蠕蟲
[0304] 將 PGMA45(4. 904g，0. 63mmol)和 ΗΡΜΑ(1(λ 0g，69. 4mmol)稱重進入 50ml 圓底燒瓶 并且用N2凈化20min。添加 ACVA(59. 0mg，0. 21mmol)并且將燒瓶脫氣持續另外的5min。 然后添加預先用隊凈化30min的磷酸鹽緩沖鹽水溶液（59ml)并且將溶液脫氣持續另外的 5min，然后將燒瓶浸入設定在70°C的油浴。在3h之后，基于5. 5ppm和6. 5ppm之間的乙稀 基信號的消失，粗產物的1H NMR分析表明HPMA單體轉化率>99%。將獲得的雙嵌段共聚物 對磷酸鹽緩沖鹽水溶液透析過夜以產生無單體的20% w/w共聚物分散體，其在室溫形成無 需支撐的凝膠。通過4 NMR和DMF GPC分析干燥的共聚物樣品。
[0305] 通過1H NMR光譜法確定的雙嵌段組成為PGMA45-PHPMAn。（參見圖1)。
[0306] DMF GPC 分析（相對 PMMA 標準物）：Mn= 31，600g mol 1 Mw/Mn= 1. 09。
[0307] 流變學測量表明臨界凝膠化溫度（CGT)為17°C (參見圖2)。
[0308] 實施例2 :通討在磷酸鹽緩沖鹽水中的RAFT水件分散體聚合合成聚（單甲基 丙燔酸甘油醅）-嵌段-聚（甲基丙燔酸2-羥基丙醅-stat-甲基丙燔酸二甘醇醅） (PGMA-P(HPMA-DEGMA))蠕蟲凝膠
[0309] 合成 PGMA^jnacro-CTA
[0310] 根據以上方案合成PGMA macro-CTA。在本實施例中，在2h后實現了 88%的GMA 轉化率并且通過1H NMR計算出平均聚合度（DP)為55。
[0311] DMF GPC 分析（相對 ΡΜΜΑ 標準物）：Μη= 15, 700g mol 1 Mw/Mn= 1. 17〇
[0312] 合成 PGMA= - P (HPMA^-stat-DEGMA^)雙嵌段共聚物
[0313] 將 PGMA55 (0. 750g，0. 085mmol)、ΗΡΜΑ(1· 028g，7. 14mmol)、DEGMA(0. 576g， 3. 06mmol)和ACVA(8. 0mg，0. 028mmol)稱重進入50ml圓底燒瓶。添加用隊預先凈化30min 的磷酸鹽緩沖鹽水溶液（20ml)然后用N2凈化溶液持續另外的lh，然后將燒瓶浸入設定在 70°C的油浴。3h之后，基于4 NMR光譜中5. 5ppm和6. 5之間的單體乙烯基信號的消失，粗 產物的4 NMR分析表明總單體轉化率>99% (參見圖3)。將獲得的雙嵌段共聚物對磷酸 鹽緩沖鹽水溶液透析過夜以產生10% w/w共聚物分散體。通過4 NMR和DMF GPC分析干 燥的樣品。
[0314] 通過1H NMR 確定的雙嵌段組成=PGMA55 - P (HPMAS4-stat-DEGMA36)。
[0315] DMF GPC 分析（相對 PMMA 標準物）：Mn= 36, 000g mol 1 Mw/Mn= 1. 18〇
[0316] 流變學測量表明臨界凝膠化溫度為26°C (參見圖4)。
[0317] 實施例3 :制備可膠凝的干細朐培養基
[0318] 在4°C使用預洗滌的Spectra/Por透析膜（分子量截留=1000)將來源于實施 例1的10ml 10% w/w蠕蟲凝膠（在磷酸鹽緩沖鹽水中）對100ml的人胚胎干細胞培養基 (K0-DMEM培養基，Invitrogen)透析24h，并且然后使用預先在冰上冷卻的0. 22 μ m過濾裝 置（Sartorius Minsart)過濾滅菌。將凝膠混合物用K0-DMEM培養基按50:50稀釋（最終 5% w/w)并且用移液管吸入在冰床上冷卻的12孔培養板（Nunc)的孔中(600 μ 1/孔）并 且搖動板以允許混合物的均勻涂布。
[0319] 然后孔內的可膠凝的干細胞培養基被用于隨后的實驗。
[0320] 實施例4 :捕獲、儲存和恢復干細朐
[0321 ] 將胚胎干細胞（Shef 1、11和RPE1細胞系）通過移液管機械地收獲并且使用塑料 Pasteur移液管將50-100聚集物（50-100 μ m直徑）以小體積（~20 μ 1)轉移至實施例3 中描述的凝膠孔或具有單獨的細胞培養基（對照）的平板的孔。搖動平板以分布細胞聚集 物并且直接轉移至37°C、空氣中5% 0)2和95%濕度的培養箱。5min之后，將在溫度引起 的干細胞培養基的相變之后形成的凝膠用100 μ 1的細胞培養基覆蓋并放回至培養箱。將 覆蓋凝膠的培養基每2天更換并且通過顯微術檢查孔。
[0322] 在恢復和隨后的測試之前，將干細胞儲存4、7、14和21天。
[0323] 實施例5 :測試儲存的/恢復的干細朐
[0324] 在4、7、14和21天時，從在冰床上冷卻的孔板恢復干細胞聚集物，在所述時間點使 干細胞培養基經受相變回到流體形式并且轉移至具有標準培養條件（hES培養基和小鼠胚 胎成纖維細胞飼養細胞）的孔板以觀察細胞活力和自發的細胞分化。
[0325] 觀察封裝在具有細胞和凝膠之間的小間隙的凝膠中的干細胞的聚集物是可能的 (參見圖5)。如通過相差顯微鏡檢查判斷的，在培養中隨著時間的推移每一個細胞聚集物 的擴展表現出很少的或沒有增加。當細胞聚集物在以上指定的時間段之后進行恢復時（圖 6)，它們顯示出如由單層增殖表明的活力、以及由細胞形態和由用特定標志物單克隆抗體 的熒光激活細胞分選術（FACS)的分析表明的細胞分化的多能性（圖7-9)。
[0326] 平鋪至單獨的細胞培養基的對照干細胞聚集物表現出如通過形態觀察和FACS分 析表明的直接分化（圖10)。
[0327] 總之，胚胎干細胞聚集物在膠凝的干細胞培養基組合物中的孵育導致相比于標準 干細胞培養物超過21天的干細胞分化和增殖兩者的停滯。
[0328] 實施例6 :NTERA2克降D1懷胎癌干細朐的包封
[0329] 本實施例描述了與聚（單甲基丙烯酸甘油酯）（PGMA) -起共聚合的甲基丙烯酸 2_羥基丙酯（HPMA)作為用于細胞包封的3D支架的用途。該共聚物可以在室溫下自組裝為 蠕蟲狀膠束。這些膠束能夠彼此相互作用以產生3D凝膠基質。細胞分化和多能性標志物 的評價在將NTERA2克隆D1細胞包封進入聚合物凝膠中之后被評價。
[0330] 實驗過程
[0331] 共聚物 3D 懦蟲凝膠如之前由 Armes 等人（Adam Blanazs, Jeppe Madsen, Giuseppe Battaglia, Anthony J. Ryan 和 Steven P.Armes J. Am. Chem. Soc.，2011，133, 16581)描述 的被制備。然后使用0.2 μπι注射器式過濾器將共聚物凝膠過濾滅菌。然后將NTERA2克隆 D1胚胎癌干細胞脫離并且然后在4°C包封在凝膠內。作為參考，它們還被平鋪入2D形式的 多孔細胞培養板中。
[0332] 在24h之后，將細胞培養基更換為含有視黃酸的分化培養基。在不同時間點測 定3D (凝膠）和2D (組織培養塑制品）系統的MTS和標志物表達（例如TUJ1、TRA1-60和 Vin2Pb22)〇
[0333] 結果
[0334] 在將細胞包封在凝膠內之后（圖11)，它們被保持培養持續七天。MTS測定（圖 12)顯示蠕蟲凝膠對于這種類型的細胞培養物是無毒的。此外，細胞的肌動蛋白-DAPI染色 顯示它們可以在僅72h之后分裂、增殖并形成3D球體（圖13)。在七天之后，球體形成隨著 大的細胞集群的形成變得更明顯（圖13)。
[0335] 熟知的多能性干細胞標志物TRA1-60被用以染色細胞。圖14顯示相比于在組織培 養塑制品上培養的細胞，包封的細胞在14和21天之后依然表達這種標志物。諸如Vin2Pb22 的分化標志物的分析顯示了其中在2D系統（組織培養塑制品）中直至21天才檢測到表達 的單一情形。
[0336] 免疫熒光測定數據通過使用qPCR來定量標志物表達中的實時差異被證實。圖 15顯示了兩種多能性標志物Nanog和0CT-04的表達，其當與分化標志物β 3微管蛋白和 h-ASHl相比時明顯不同。
[0337] 結果顯示PGMA-PHPMA蠕蟲凝膠對NTERA2克隆D1 EC細胞是無毒的。此外，細胞 增殖并且形成球體，如由肌動蛋白/DAPI染色鑒定的。這使得蠕蟲凝膠是用于在模擬3D細 胞環境的系統內研究分化過程和細胞發育的良好的候選物。表達的標志物的研究表明，細 胞在視黃酸中培養超過21天保持未分化。qPCR結果證實可能因為與PGMA-HPMA蠕蟲凝膠 的低的相互作用，在具有視黃酸的情況下細胞沒有分化。這些觀察結果表明，干細胞分化更 加依賴于細胞和支架之間的機械傳導力而不是來自生物活性分子的刺激。
[0338] 實施例7 TGMAfPHPMA^雙嵌段共聚物蠕蟲直接在細朐培養基中制備蠕蟲凝膠 的用涂
[0339] 伸用2-氰丙基二硫代苯甲酸醅（CPDB)合成PGMAtmacro-CTA
[0340] 將 CPDB(0. 80g，3. 6mmol)和單甲基丙烯酸甘油酯（GMA，40. 59g，0. 25mol)稱重進 入250ml圓底燒瓶并且用N2凈化20min。添加 ACVA(202. 9mg，0. 72mmol)并且將溶液脫氣 持續另外的5min。添加脫氣的無水乙醇（61ml，1.04mol)并且將溶液再次脫氣持續另外的 5min，然后浸入設定在70°C的油浴中。2h之后，在⑶ 30D中記錄的1H NMR光譜表明GMA單 體轉化率為約80%。通過從甲醇重復沉淀入過量二氯甲烷兩次以移除未反應的單體，將 獲得的聚合物純化。在第二次沉淀之后，將純化的聚合物過濾并且將獲得的固體溶解在水 (200mL)中。使用設定在30°C的旋轉蒸發儀使殘留的二氯甲烷蒸發。在所有的痕量溶劑 被去除之后，將水溶液冷凍干燥過夜以提供粉紅色粉末。溶解在CD 30D中的純聚合物的1Η NMR光譜法研究表明平均聚合度為55。DMF GPC分析（相對聚（甲基丙烯酸甲酯）校準標 準物）給出 14, 100g mol 1的 Μ "和 1. 09 的 M W/Mn。
[0341] 在0. 15M PBS中以20% w/v固體合成PGMAf - PHPMA^雙嵌段共聚物蠕蟲
[0342] 將 PGMA55 (3. 023g，0· 33mmol)和 HPMA (6. 240g，41. 62mmol)稱重進入 100ml 圓底燒 瓶并且用N2凈化20min。添加 ACVA(31. 0mg，0. llmmol)并且將燒瓶脫氣持續另外的5min。 然后添加磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)溶液（Dulbecco A，0xoid，Basingstoke，37ml，150mM，預先 用N2凈化30min)并且將溶液脫氣持續另外的5min，然后將反應燒瓶浸入設定在70°C的油 浴2h，之后，在⑶ 30D中記錄的1H NMR光譜表明HPMA轉化率為幾乎100% (在5. 6ppm和 6. 2ppm的乙烯基信號的消失）。對于獲得的PGMA55-PHPMA135雙嵌段共聚物，DMF GPC分析 (相對聚（甲基丙烯酸甲酯）校準標準物）給出35, 900g mol 1的MJP Mw/Mn= 1. 10。
[0343] 對于細胞生物學研究，評價了用于純化并制備PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠的三種方 案，參見以下。
[0344] 方案 1
[0345] 將合成的20 % w/v水性PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠在4°C對PBS透析2天，透析液 (PBS)每12h更換（MWC0 = 1，000)。將獲得的冷的自由流動共聚物分散體在合適的細胞培 養基中（DMEM或Nutristem ;在混合之前預冷至4°C )稀釋至期望的濃度（通常6% w/v或 者10% w/v共聚物）并且在使用之前在該溫度下過濾滅菌，如以下描述的。
[0346] 方案 2
[0347] 將合成的20 % w/v PGMA55_PHPMA135凝膠在4 °C對PBS透析7天，透析液每12h 更換（MWC0 = 1，000)。將獲得的冷的自由流動分散體在合適的細胞培養基中（DMEM或 Nutristem ;在混合之前預冷至4°C )稀釋至期望的濃度（通常6% w/v或者10% w/v共聚 物）并且在使用之前在該溫度下過濾滅菌，如以下描述的。
[0348] 方案 3
[0349] 將合成的20 % w/v PGMA55-PHPMA135凝膠在4°C對純水透析7天，透析液每12h更 換（MWC0= 1，000)。將獲得的凝膠冷凍干燥以產生干燥的共聚物蠕蟲的精細粉末。將該粉 末再分散在合適的細胞培養基中（DMEM、EB (擬胚體培養基）或Nutristem ;在混合之前預 冷至4°C )以提供6% w/v或者10% w/v的共聚物分散體。使用冰浴將溫度維持在約4°C 并且磁力攪拌持續至少20min直到實現完全分散。在使用之前將獲得的液體過濾滅菌，如 以下描述的。
[0350] 滅菌橾作
[0351] 將分散在期望的細胞培養基中的6% w/v PGMA55-PHPMA135共聚物蠕蟲凝膠冷卻至 4°C以引起蠕蟲至球形的轉換，并且因此經受去凝膠化以提供自由流動的共聚物球體分散 體。然后使用無菌〇. 20 μ m注射器式過濾器將該冷的低粘度流體超濾入置于超凈工作臺內 的無菌容器中。在超濾之前將注射器和過濾器儲存在_20°C持續至少lh以防止在接觸時的 凝膠化。然后將獲得的滅菌的共聚物分散體直接用于細胞集落包封實驗，或儲存在4°C或 者-20°C用于將來使用（取決于細胞培養基的規格）。
[0352] 與PGMA^-PHPMA^蠕蟲凝膠直接接觸中的細朐活力
[0353] 細胞活力測定使用原代人真皮成纖維細胞（HDF)來執行。
[0354] 原代人真皮成纖維細胞（HDF)從ATCC (LGC Standards，UK)分批獲得。它們主要提 取自乳房縮小術和新生兒包皮。使用標準培養基（DMB1補充以10% FCS、2x 10 3 mol dm3 L_谷氨酰胺、0. 625 μ g/ml兩性霉素 B、100IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素）在T75燒瓶 中常規地培養成纖維細胞。在傳代4次和9次之間的成纖維細胞被用于測試。
[0355] 使用MTT測定對人真皮成纖維細胞（HDF)的細胞活力進行測定
[0356] 將HDF以3xl04個細胞/孔的密度接種在24孔板中，并且生長直到80%匯合（通 常48h)。在與細胞的直接接觸和另外地非直接接觸兩者中評價凝膠（轉籃法）。將非接觸 的ThinCert (Greiner Bio-One, UK)裝置用以鑒定可能存在于懦蟲凝膠中的任何毒性低分 子量化合物（比如，未處理的HPMA單體）。ThinCert是組織培養塑制品的小籃樣結構，具 有安裝在24孔板上的聚碳酸酯膜底部。因此將細胞通過24孔板中的細胞培養基暴露至凝 膠，但不是通過直接接觸。該裝置區分蠕蟲凝膠的直接接觸對細胞的影響和殘留的小分子 雜質的影響。
[0357] 對于非直接接觸的裝置，將250 μ 1的10%共聚物凝膠加至每一個ThinCer籃。將 細胞置于每一個籃下并且浸入合適的細胞培養基（500 μ 1)中。對于直接接觸的裝置，將細 胞培養基從孔移出并且將凝膠（通常500 μ 1)直接施加至細胞單層上。將凝膠批次在80% 匯合的HDF細胞上測試超過24h。然后通過ΜΤΤ測定（3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二 苯基溴化四氮唑）（Sigma-Aldrich，St Louis，M0)來評價細胞活力。將細胞在4°C用冷的 PBS洗滌，然后與MTT溶液（20°C下的PBS中的0. 5mg/ml MTT，lml/24孔板的孔）一起在 37°C在增濕的培養箱（5%C02/95%空氣）中孵育lh。對于健康的有活力的細胞，MTT通過 線粒體酶、琥珀酸脫氫酶被還原為紫色甲臜鹽，其允許細胞活力的光譜定量。lh之后，將溶 液抽出并且通過加入酸化的異丙醇（0. 30ml/24孔板的孔），隨后孵育10min，將不可溶的細 胞內甲臜產物溶解并且從細胞移出。然后使用讀取板的可見吸收分光光度計確定在540nm 處的吸光度，在630nm處的吸光度被用作參照。將平均活力數據和SEM針對陰性對照（未 處理，100%活力）歸一化并且表示為活力百分比土SEM。實驗在一式兩份的孔的樣品中執 行，η = 3次獨立實驗。對于統計分析，學生配對t檢驗被用于原始數據以評價樣品和對照 組之間的差異顯著性。
[0358] 結果
[0359] 使用聚合誘導自組裝（PISA)構想，（Blanazs等人，J Am Chem Soc，2012 年，134, 9741-9748) PGMA-PHPMA雙嵌段共聚物蠕蟲凝膠可以在純水中或者在生理緩沖液 諸如PBS中直接合成。原則上，PBS應促進細胞生物相容性，因此初始構想（參見以上方案 1)包括在PBS中以20% w/v固體合成PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠，隨后在4°C以其非膠凝的 形式對PBS透析2天（以確保完全去除任何低分子量雜質），然后用期望的細胞培養基稀釋 以提供6% w/v蠕蟲凝膠。然而，對人真皮成纖維細胞（HDF)的細胞活力測定表明，該方案 不允許實現最佳的細胞活力（圖16)。事實上，直接接觸和間接接觸ThinCert測定二者均 表明細胞活力的明顯降低（P〈〇. 01)，參見圖16。因此新的方法（參見以上方案2)被開發， 其中使PGMA55-PHPMA135共聚物分散體經受持續7天而不是2天的透析。細胞活力測定證實 了性能的改進，ThinCert測定顯示相比于未處理的對照組沒有顯著差異（參見圖16)。然 而，直接接觸測定仍然表明次佳的細胞活力（P〈〇. 05)。這不是出乎意料的，因為當制備此類 蠕蟲凝膠時細胞培養基用PBS稀釋兩倍并且因此未處于其最佳濃度。為進一步優化細胞活 力，設計了第三方案（參見以上方案3)，其中在PBS中以20% w/v制備PGMA55-PHPMA135共 聚物蠕蟲，對純水透析7天并且冷凍干燥過夜以提供干燥粉末，其可以被再分散在100 %細 胞培養基中以重新形成無需支撐的透明水性蠕蟲凝膠。該后面的方案產生表現出非常高的 細胞活力（圖16)，同時維持細胞生物學應用期望的熱可逆凝膠化行為的水凝膠。
[0360] 實施例8 :將hES細朐集落于37°C長期潯入PGMAfPHPMA^禱蟲凝膠中、隨后通討 在4°C去凝膠化收獲細朐之后，伸用存活/死亡測宙宙量hES細朐集落的存活
[0361] 集落恢復％實驗
[0362] 除非另外聲明，hES細胞通常使用Nutristem細胞培養基（Stemgent, UK)和用 Cellstart 包被的 t25 容器（Life Technologies, UK)在無異種成分（xeno-free)的條件 下生長。將細胞培養物維持在37°C在增濕的培養箱中（5% C02/95%空氣）并且將培養基 每天更新。當培養物達到最佳的細胞密度（通常60-70%表面覆蓋）時，將細胞培養基再 度補滿并且將集落在光學顯微鏡的輔助下機械地收獲。將集群從細胞培養基恢復并且置于 35mm皮氏培養皿上，為凝膠接種做好準備。將ibidi 8孔載玻片置于冰上并且將500 μ 1冷 的6% PGMA55-PHPMA135共聚物分散體（其在~4°C是自由流動的液體）加至每一個孔。使 用配備有'超細'吸頭的無菌塑料巴斯德吸管，將個體集落置于每一個ibidi孔的中心并且 溫和地攪拌以允許混合。通過將ibidi孔置于設定在37°C的增濕的培養箱（5% C02/95% 空氣）中來直接引發凝膠化（圖17)。將細胞集落孵育期望的時間段（即7、14或21天）， 然后收獲。使用光學顯微鏡確定每一個膠凝的孔中的集落的數目（通常3-15個）。通過將 每一個ibidi載玻片置于冰上約5min來引發凝膠化（圖17)并且將獲得的冷的自由流動 的含有細胞集落的共聚物分散體在Cellstart處理的含有Nutristem(5. 0ml)的6孔板中 稀釋約10倍。這導致集落釋放入培養基。使用光學顯微鏡檢查ibidi孔并且記錄保持在 孔中的集落（或集落損耗）的數目。將6孔板在增濕的培養箱（5% C02/95%空氣）中儲 存約3h以允許有活力的細胞集落粘附至Cellstart基質。隨后，將培養基每天再度補滿并 且持續直至7天監控集落，記錄旺盛生長的集落的數目。將集落恢復％計算為針對去凝膠 化之前的初始集落數目歸一化的每個時間點的平均集落恢復土SEM。集落損耗％也被相似 地評價。將內部對照組包括在本研究內，其中將細胞集落浸入蠕蟲凝膠中僅lOmin，并且然 后直接收獲。這使得集落分離和集落轉移方案的效率能夠被評價。實驗在一式三份的孔中 執行，η = 3次獨立實驗。
[0363] 存活/死亡測定
[0364] 使用熟知的商業化的存活/死亡測定（Life Technologies, UK)評價浸入在 PGMA55-PHPMA13蠕蟲凝膠內的hES細胞集落的活力。該測定使用細胞可滲透的SYTO? 9 綠色熒光核酸染料（激發光480nm，發射光500nm)和不可滲透的紅色熒光核酸染料，碘化丙 啶（PI，激發光490nm，發射光635nm)的二元混合物。具有受損的（即滲漏的）膜的細胞被 染成紅色（PI)并且被指定為死的或將死的，然而具有完整膜的細胞被染成綠色（Syto-9) 并且指定為活的。當單獨使用時，PI染料通常標記所有細胞；但當兩種染料均存在時，PI滲 透損壞的膜并且由于Syto 9而猝滅熒光，使得其綠色信號不被檢測到。簡而言之，將膠凝 的集落冷卻至約4°C持續5min以引發去凝膠化并且然后允許在重力下沉淀。將自由流動的 水性共聚物分散體上清液部分地移出并且用預冷至4°C的細胞培養基將集落洗滌一次。然 后將水性流體移出并且將溫的（37°C )細胞培養基加至含有Syto 9(15 μ M)和PI (60 μ M) 的每一個孔。將細胞在增濕的培養箱（5% C02/95%空氣）中孵育25min以允許染料攝取 發生。然后將細胞核用Hoechst 33342 (Life Technologies, UK)復染另外的5min。最終， 將集落用PBS(預冷至4°C )洗滌并且加入另外的培養基（取決于容器，通常對于6孔板為 3ml并且對于ibidi成像板為500 μ 1)，然后使用用于活細胞研究的配備有Okolab環境控 制室的Nikon A1共聚焦顯微鏡檢測。
[0365] MM.
[0366] 基于熒光染料保留與共聚焦顯微術組合的存活/死亡細胞測定使能夠在細胞浸 入蠕蟲凝膠內的同時監測其活力（參見圖18)。在7天之后，所有細胞集落表現出高的活 力，具有非常少的碘化丙啶（PI，其選擇性將死細胞染成紅色）染色的證據并且觀察到主要 的綠色熒光標志物（Syto 9)。在浸入14天之后，一些集落包含無活力的PI染色的細胞區 域（估計為〈總區域的10% )，但是集落中的大多數細胞表現出良好的活力，如通過由于 Syto 9的綠色熒光指示的（圖18)。在浸入蠕蟲凝膠內21天之后，顯著比例的細胞集落仍 然表現出至少一些有活力的細胞（參見圖18)。
[0367] 為進一步評價這些蠕蟲凝膠內的細胞集落的活力，確定了去凝膠化之后恢復的有 活力的集落的比例（圖19)。已知集落脫離的力學可損害PSC活力（Heng等人，Biotechnol Appl Biochem. 2007, 47, 33-37)，因此實施對照實驗（參見圖19,0周），其中將細胞集落浸 入蠕蟲凝膠內僅10分鐘，然后通過冷離心再次移出。約70±3%的收獲的細胞集落能夠粘 附至Cellstart并且增殖。在7天和14天之后，分別恢復了 57±10%和59±5%的有活力 的集落。
[0368] 因為接種用于集落恢復％實驗的集落被機械地解聚，所以難以實現均一的集落大 小分布。人們發現在從蠕蟲凝膠分離之后，初始集落大小對結果具有明顯影響。如果集落 大小小于100μπι直徑，在分離之后極少的集落粘附至CellStart并增殖并且該小的群體 完全分化或不會旺盛生長（圖20A和20B)。對于超過100 μ m的集落大小觀察到較好的 恢復率（圖20C、20B)，具有在100μπι和200 μπι之間范圍的集落表現出典型的ES細胞形 態（圖20D)。當使用液體培養基時，集落大小對細胞活力的相似影響已經被其他工作者在 7??? (Thomson, J. A. , Itskovitz-Eldor, J. , Shapiro, S. S. , ffaknitz, M. A. , Swiergiel, J. J.，Marshall, V. S.和 Jones, J. M. Science, 1998, 282, 1145-1147 ;Reubinoff 等人，Nature Biotechnology 2000, 18, 399-404)。有趣地，當將相對大（》200 μ m)的集落浸入蠕蟲凝膠 中時（圖20E)，它們在頂部明顯變得密集，而不是平展。此外，此類集落的邊緣往往表現出 一定程度的神經元分化，如通過光學顯微術判斷的。對于分散在液體培養基中的高密度集 落，報道了相似的觀察結果（Reubinoff 等人，Nature Biotechnology, 2000, 18, 399-404) 〇
[0369] 實施例9 :非增葙件停滯（假死狀杰）的實驗證據
[0370] DNA 提取
[0371] 將集落從t25燒瓶機械地回收并且在使用之前置于35mm皮氏培養皿上。用固定 體積（500 μ 1)的細胞集落接種每一個ibidi孔。該懸浮液允許沉淀5min并且然后將液體 培養基小心地移出。然后將6% PGMA-PHPMA共聚物分散體（500 μ 1 ;預冷至4°C )加至每一 個孔并且溫和攪拌以允許混合。通過將ibidi孔在37°C置于增濕的培養箱（5% C02/95% 空氣）中直接引發凝膠化。然后將細胞集落孵育7、14或21天。當需要時，通過將每一個 ibidi載玻片置于冰上約5min引發去凝膠化。然后將每一個孔的內容物置于含有冰冷的 PBS(l.Oml)的標記的1.5ml Eppendorf管中。在4°C持續5min兩次離心樣品（1000rcf)。 使用100 μ 1的消化緩沖液（包含TE緩沖液（10mM Tris pH 8和ImM EDTA)加0· 2% SDS) 將細胞沉淀物在37°C孵育4h。在此之后，將包含用TE緩沖液飽和的25:24:1的苯酚：氯 仿：異戊醇（100 μ 1)的溶劑混合物加至每一個Eppendorf管并且通過禍旋完全混合。將樣 品在20°C離心5min(14, OOOrcf)。然后將水性上清液輕輕倒出并且與冰冷的乙醇（450 μ 1) 和3Μ乙酸鈉（50 μ 1)混合。通過在20°C離心5min(14, OOOrcf)使DNA沉淀。將上清液小 心地輕輕倒出并且將DNA沉淀物在37°C烘箱中干燥。將干燥的沉淀物重懸在TE緩沖液 (20 μ 1)中。使用Nanodrop分光光度計通過確定在260nm處的吸光度來計算DNA濃度。將 數據相對于內部對照組歸一化，在內部對照組中細胞集落膠凝持續約l〇min并且然后直接 收獲（第〇天）。實驗在一式兩份的孔中執行，η = 3次獨立實驗。
[0372] ki67 免痔標iP,
[0373] 對膠凝的集落和恢復的集落（即在熱誘導的去凝膠化之后）執行針對ki67的免 疫標記測定。將平鋪的恢復的集落用PBS直接洗滌兩次并且使用PBS中的4%甲醛的水 溶液（750 μ 1)固定30min。通過在冰上孵育約5min以誘導去凝膠化來從蠕蟲凝膠分離 集落。然后將每一個孔收集到含有冰冷的PBS(lml)的1.5ml Eppendorf管中。將集落 在4°C持續5min(1000rcf)洗滌兩次并且然后使用PBS(100 μ 1)中的4%甲醛的水溶液固 定30min。然后在PBS中將所有樣品洗滌三次并且使用0. 1 % Triton X100PBS溶液滲透 20min (lmL/6孔板中的孔并且100 μ Ι/Eppendorf管）。然后將集落在PBS中洗滌三次并且 在20°C于5% BSA-PBS中封閉2h，然后在溫和搖動下與一抗溶液（1:1000兔抗人ki67單 克隆抗體（Abeam)+PBS中的1% BSA) -起在4°C孵育過夜。然后將這些抗體標記的集落在 PBS中洗滌三次并且在溫和搖動下與二抗溶液（1:1000山羊抗兔Cy3 IgG (abeam)+PBS中的 1% BSA) -起在20°C孵育lh。用PBS洗滌集落三次并且將細胞核用Hoechst 33342(Life Technologies，UK)復染5min。最后，使用PBS將每一個樣品洗滌三次，然后使用EV0S熒光 顯微成像系統檢查。
[0374] MS
[0375] hES集落隨時間推移的光學顯微術研究顯示，集落大小或數目幾乎沒有變化（參 見圖21)。然而，存活/死亡成像和集落恢復數據表明，在集落長期儲存于蠕蟲凝膠中之后， 其相對高的比例保持有活力的（圖18)。為評價蠕蟲凝膠內的細胞增殖的程度，收獲集落并 且隨時間推移確定從細胞核提取的DNA的歸一化的量（相對于第0天）（參見圖21)。檢測 到 DNA的總量沒有明顯變化，表明在細胞集落儲存在蠕蟲凝膠中期間其可忽略的增殖。免 疫標記實驗（參見圖22)表明浸入蠕蟲凝膠中之后，hES細胞經歷細胞周期在G1/S檢查點 的停滯。ki-67的存在是細胞增殖的熟知的標志物并且該蛋白質存在于細胞周期的每一個 階段期間（Scholzen和 Gerdes J Cell Physiol. 2000, 182, 311-322)。膠凝的集落中 ki-67 的不存在通過在調查的每個時間點的選擇性染色實驗來證實，其暗示了 hES細胞在GJ月退 出細胞周期并且進入其休眠狀態或停滯態（參見圖22)。與此相反，經由去凝膠化然后粘 附至合適的ECM基質（即，Cellstart)的收獲使集落能夠重新進入細胞周期（如通過陽 性ki-67染色判斷的）并且重新恢復其增殖狀態（參見圖22)。PGMA 55-PHPMA135雙嵌段共 聚物蠕蟲凝膠不包含特異性結合基序以促進細胞粘附。事實上，它的多個羥基的功能被已 知為減少細胞粘附（Faucheux 等人，Biomaterials, 2004, 25, 2721 - 2730 ;Arima 等人，J. Mater. Chem.，2007, 17, 4079-4087)。最近，已報道hES細胞利用失巢凋亡作為（i)在細胞粘 附不存在時的細胞死亡機制（Watanabe 等人，Nature Biotechnology, 2007, 25, 681-686) 和（ii)在分化期間典型的生理事件（Coucouvanis 和 Martin Cell, 1995, 83, 279 - 287)。 因此，將hES細胞浸入如此生物惰性的、非相互作用的3D基質中是不明顯的，因為這些蠕蟲 凝膠應導致停滯而不是失巢凋亡。
[0376] 實施例10 :運輸數據
[0377] 最近，胚胎干細胞庫已經在全世界范圍建立。這些庫在將用于研究團體的高質 量的人和動物ES細胞存檔和提供高質量的人和動物ES細胞中起重要作用。這些細胞庫 已經有效產生大量冷藏保存的細胞系和基因工程化的（即報告物基因）細胞系并且已經 向要求其的研究者供應這些株系。冷藏保存對于儲存和運輸人胚胎干細胞（ES細胞）是 關鍵的步驟（The International Stem cell banking Initiative, Stem Cell Rev and R印，2009, 5, 301 - 314)。有效冷藏保存的方法必須提供高的解凍效率并且維持細胞的多 能性和分化潛能兩者。然而，冷藏保存的細胞的運輸是相對昂貴的并且具有許多相關的 問題。例如，接收設施必須具有特定冷凍和解凍方案所需的合適的技術人員和設備并且 最佳的遞送時間是關鍵的（Shaw 和 Nakagata Methods Mol Biol, 2002, 180, 207 - 228)。 此外，次佳的冷凍解凍過程可以對細胞造成明顯損傷（Shaw和Nakagata Methods Mo 1 Biol, 2002, 180, 207 - 228)。此外，液氮容器的運輸由國際航空運輸協會（International Air Transport Association)嚴格規定（ΙΑΤΑ0(ΙΑΤΑ危險物品條例手冊第54版本（國際 航空運輸協會），產品代碼：BK-IATA13, 2013)，所以可選的較便宜的和較安全的運輸選擇 是高度期望的。通常，研究機構交換細胞，將它們在以液體培養基填充的C0 2充氣的細胞培 養容器中運輸。盡管這潛在地是有用的替代選擇，但是培養中的ES細胞無法很好地應對低 溫應激（Reubinoff等人Hum. Reprod. 2001，16, 2187 - 2194)。可能令人意外地，非常少的研 究者已專心于此課題，特別是考慮到生長ES細胞市場的潛在商業收益。對于可局部配送的 產品，其應該能夠在運輸條件下存活至少24h。如果其存活時間可以被增加至48h，這應該 使能夠洲際間遞送并且存活72h在原則上會允許在全世界范圍的遞送。
[0378] 調查了使用Nutristem制備的6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠作為持續24、48和72h 的儲存時間的潛在運輸培養基（圖23)。作為對照實驗，Nutristem還以其液體（即非膠凝 的）形式被用作常規細胞培養基。在本實施例中，使細胞集落粘附至單獨的Cellstart包被 的35mm ibidi培養皿的底部。將浸入蠕蟲凝膠或者液體Nutristem的細胞集落在37°C的 5 % C02-增濕的培養箱中平衡8h，然后儲存在典型的聚苯乙烯運輸盒中。在假設的儲存時間 期間，將加熱的（37°C)墊加至儲存盒以最小化隨該時間段的推移的熱損失。這使得能夠維 持在約18°C至22°C的溫度范圍而不是37°C。在每一個時間點之后，將浸入液體Nutristem 中的細胞返回至正常細胞培養條件（即37°C在增濕的培養箱中（5%C02/95%空氣）），而將 蠕蟲凝膠內的集落通過去凝膠化（如前述的）分離并且然后允許粘附至單獨的Cellstart 包被的35mm ibidi培養皿的底部。將粘附的細胞集落留置在培養箱中過夜（約16h)以恢 復并且然后記錄這些集落的光學圖像（圖23)。在模擬的運輸儲存條件下，液體Nutristem 中的細胞集落良好存活直至24h，大多數集落表現出典型的hES形態。相似地，在相同條件 下儲存之后，浸入懦蟲凝膠中的集落也良好恢復。但是，儲存在液體Nutristem中的細胞在 48h之后表現出應激跡象。集落表現出'聚集'并且脫離的碎片的量增加，盡管一些集落仍 然保持粘附。（圖23)。相反，在蠕蟲凝膠內儲存的細胞集落在48h之后恢復相對良好并且 保留其特征性形態，但是相比于在24h之后分離的那些，顯著較少的有活力的集落被恢復。 在72h之后沒有有活力的集落可以從液體Nutristem被恢復；所有集落表現出脫離和聚集 (圖23)。然而，在蠕蟲凝膠內儲存72h之后，一些有活力的細胞集落仍然可以被恢復（圖 23) 〇
[0379] 實施例11 :在蠕蟲凝膠內儲存個體hES細朐
[0380] 研究了蠕蟲凝膠保存個體hES細胞的懸浮液（而不是hES集落）的用途。培養個 體hES細胞的懸浮液并且然后在使用3i培養基制備的6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠中膠 凝。該特定的培養基包含有利于個體hES細胞培養物的特定失巢凋亡抑制劑（Gafni等人， Nature. 2013, 504(7479)，282-286)。簡言之，用PBS將含有培養中的hES細胞的每一個t25 容器洗滌一次并且然后加入細胞解離液（1. 50ml，Sigma-Aldrich)。在37°C于增濕的培養 箱（5% C02/95%空氣）中孵育3min之后，通過加入3i細胞培養基（1.51111)、隨后于201€ 在lOOOrcf離心5min收獲個體細胞的懸浮液。將沉淀物在~4°C重懸在液體3i細胞培養 基（1. 5ml)中或者冷的自由流動的共聚物分散體中（使用3i培養基制備的），其在加熱至 37°C后快速形成蠕蟲凝膠。在Cellstart包被的6孔板上培養液體3i培養基中的細胞，而 蠕蟲凝膠加3i培養基中儲存的細胞在37°C于增濕的培養箱（5% C02/95%空氣）中24h之 后，通過去凝膠化分離并且然后允許粘附在Cellstart包被的6孔板上。在16h之后，通過 光學顯微術檢查細胞（圖24)。從液體3i培養基以及蠕蟲凝膠加3i培養基回收的細胞，在 其恢復之后表現出相似的大小、形態和表面覆蓋率。因此，6% PGMA55-PHPMA135蠕蟲凝膠可 以被用以儲存個體hES細胞的懸浮液而沒有任何可辨別的有害影響。
[0381] 實施例11 :流奪學研究
[0382] 使用配備有可變溫度Peltier板和40mm 2°鋁錐體的AR-G2流變儀（TA儀器）對 多種水性培養基中的6% w/v PGMA55-PHPMA135共聚物蠕蟲凝膠進行流變學研究。
[0383] 對于三種類型的細胞培養基（例如PBS、EB(擬胚體培養基， Millipore)、NS(Nutristem 培養基，Stemgent)或 3i 培養基（Gafni 等人， Nature. 2013, 504 (7479)，282-286)，在凝膠強度（G，~lOta)或者臨界凝膠化溫度（CGT~ 18°C )方面沒有觀察到顯著差異。使用PBS制備的蠕蟲凝膠的CGT是略低的（17°C )，但其 熱可逆行為卻是廣泛地類似的。在所有情況中，每種凝膠的應變掃描（圖25b)產生可比較 的G'值（9Pa至13Pa)，具有以約60%應用的應變存在的從線性粘彈區的偏離。角頻率掃 描（圖25c)也是廣泛可比較的；表明改變細胞培養基對蠕蟲凝膠流變學僅具有相對緩和的 影響。
【主權項】
1. 一種用于干細胞的培養基，所述培養基包含分散在水性媒介物中的合成的熱響應共 聚物的顆粒； 其中所述培養基能夠響應溫度變化經受非凝膠狀形式和凝膠狀形式之間的變化，并且 在所述非凝膠狀形式中，所述培養基包含所述合成的熱響應共聚物的顆粒的膠狀穩定的水 性分散體，并且在所述凝膠狀形式中，所述培養基是提供能夠容納干細胞的支架或基質的 凝膠形式； 并且其中所述水性媒介物還包含用于維持干細胞的活力的營養物； 并且其中所述熱響應共聚物由式B來定義：其中P1表示源自單體M i的聚合物組分并且P 2表示源自水溶性單體M 2的基本上水不溶 性的聚合物組分。2. 如權利要求1所述的培養基，其中所述培養基能夠響應溫度變化經受所述非凝膠狀 形式和所述凝膠狀形式之間的可逆變化。3. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述培養基在低于膠凝溫度的溫度下以 所述非凝膠狀形式存在，并且在高于所述培養基的所述膠凝溫度的溫度下以凝膠狀形式存 在，并且所述培養基在大于或等于20°C的溫度下是所述凝膠狀形式。4. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述培養基以所述凝膠狀形式是透明的。5. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述培養基（任何干細胞/分化后的細胞 除外）不含動物來源的產品。6. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中當所述培養基是所述非凝膠狀形式時，所 述合成的熱響應共聚物的顆粒基本上是球形（例如，球體或類球體顆粒），并且當所述培養 基是凝膠狀形式時，所述合成的熱響應共聚物的顆粒基本上是各向異性的"蠕蟲"或"蠕蟲 狀"顆粒。7. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述熱響應共聚物包含至少一種親水性聚 合物嵌段和至少一種疏水性聚合物嵌段。8. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中： 每個單體M1選自式M 1A、Mib和/或M i。的單體：其中R1、Rw和R 11表示允許P i是至少部分水溶性的M 1A或M 1C的取代基， R2表示 H、CH 3或 CN， Rs表示有效允許P i是至少部分水溶性的芳環的一個或更多個取代基，并且 每個單體M2選自式M 2A和/或M 2B的單體：其中R3是允許P 2是基本上水不溶性的M 2的取代基，并且R4和R6獨立地表示H或甲 基； 或P1是包含單體M i與單體M 2的共聚物，條件是所述聚合物P i保持水溶性。9. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中P i自身是包含單甲基丙烯酸甘油酯（GM) 單體單元的聚合物或共聚物，并且P2g身是包含甲基丙烯酸2-羥基丙酯（HPM)單體單元 的聚合物或共聚物。10. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述熱響應共聚物是選自包括以下的組 的式B [P1-P2]的嵌段共聚物： -PGMA-PHPMA，其中所述PGM嵌段具有在20和200之間的聚合度；并且所述PHPM嵌 段具有在50和300之間的聚合度； -PGM-P (GM-HPM)，其中所述PGM嵌段具有10至120的聚合度（DP)，并且所述 P(GM-HPM)嵌段可以合適地具有在20和200之間的聚合度（DP);以及 -PGM-P (DEGM-HPM)，其中所述PGM嵌段具有在20和200之間的聚合度；所述 P(DEGM-HPM)嵌段具有在20和200之間的聚合度（DP);并且所述P (DEGM-HPM)嵌段中 DEGMA與HPMA單體單元的摩爾比位于10:1和1:10之間。11. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述水性媒介物包括磷酸鹽緩沖鹽水。12. 如任一前述權利要求所述的培養基，其中所述培養基包含： -1-30% w/w合成的熱響應共聚物的顆粒； -70-99% w/w水性媒介物。13. -種用于制備根據權利要求1至12中任一項所述的培養基的試劑盒，所述試劑盒 包括： (i) 如權利要求1至12任一項中定義的合成的熱響應共聚物的顆粒；以及 (ii) 如權利要求1至12任一項中定義的水性媒介物。14. 一種形成根據權利要求1至12中任一項所述的培養基的方法，所述方法包括將所 述合成的熱響應共聚物的顆粒分散在所述水性媒介物中。15. 如權利要求14所述的方法，其中所述方法包括在所述熱響應共聚物的顆粒在所述 水性媒介物中的分散之前，將其預滅菌；所述預滅菌包括所述熱響應共聚物的顆粒的超濾。16. -種儲存或保存一種或更多種干細胞的方法，所述方法包括： (i) 使非凝膠狀形式的根據權利要求1至12中任一項所述的培養基與一種或更多種干 細胞接觸以產生流體干細胞組合物； (ii) 改變所述培養基的溫度使得所述培養基從所述非凝膠狀形式改變為所述凝膠狀 形式并且從而產生膠凝的干細胞組合物；以及 (iii) 儲存所述膠凝的干細胞組合物。17. 如權利要求16所述的方法，其中步驟（i)在KTC或低于KTC的溫度下用所述干細 胞培養基來執行；并且步驟（ii)包括將所述干細胞基質的溫度從在l〇°C或低于KTC調整 直至18°C或高于18°C。18. 如權利要求16至17中任一項所述的方法，其中步驟（iii)包括將所述膠凝的干細 胞組合物儲存至少7天。19. 一種干細胞組合物，所述干細胞組合物包含分散在根據權利要求1至12中任一項 所述的培養基中的一種或更多種干細胞。20. -種從膠凝的干細胞組合物釋放一種或更多種干細胞的方法，所述方法包括： (i) 提供膠凝的干細胞組合物，所述膠凝的干細胞組合物包含分散在凝膠狀形式的根 據權利要求1至12中任一項所述的培養基內的一種或更多種干細胞； (ii) 改變所述干細胞培養基的溫度使得所述培養基從所述凝膠狀形式改變為所述非 凝膠狀形式，從而產生流體干細胞組合物；以及 (iii) 任選地其后從所述流體干細胞組合物分離所述干細胞。21. 如權利要求1至12中任一項所述的培養基用于儲存、保存、培養和/或分化一種或 更多種干細胞的用途。22. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據權利要求19所述的干細胞組合物，以 及任選地一種或更多種藥學上可接受的賦形劑。23. -種如權利要求22所述的藥物組合物，用于在治療中使用。24. -種如權利要求22所述的藥物組合物，用于在干細胞治療中使用。25. 如任一前述權利要求所述的培養基、試劑盒、方法、干細胞組合物、用途或藥物組合 物，其中所述干細胞是哺乳動物干細胞。26. 如任一前述權利要求所述的培養基、試劑盒、方法、干細胞組合物、用途或藥物組合 物，其中所述干細胞是除了通過包括破壞人胚胎和/或人胚胎干細胞的方法產生或獲得的 那些之外的干細胞。27. 如任一前述權利要求所述的培養基、試劑盒、方法、干細胞組合物、用途或藥物組合 物，其中所述干細胞是未分化的。28. 如上文參考所附的實施例和附圖大體上描述的培養基、試劑盒、方法、干細胞組合 物、用途或藥物組合物。
【文檔編號】C12N5/00GK105899656SQ201480009328
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年2月21日
【發明人】艾倫·坎頓, 史蒂文·彼得·阿姆斯, 尼古拉斯·約翰·沃倫, 哈里·摩爾, 朱塞佩·巴塔利亞, 丹尼斯·賽欽
【申請人】謝菲爾德大學