重組潤滑素的制備

重組潤滑素的制備
【專利摘要】公開了類人潤滑素或PRG4糖蛋白的具有出色潤滑性質和新糖基化模式的新型重組同種型，以及使其能夠商業化生產的高水平制備方法。
【專利說明】重組潤滑素的制備
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年10月22日提交的美國臨時專利申請號61/894,366的優先權和 利益，其以整體援引加入本文。 發明領域
[0003] 本文所公開的發明涉及使用經轉染的細胞生產商業量的物質組合物的方法，所述 物質組合物包含重組類人潤滑素（lubricin)。更具體地，本發明涉及在商業規模生產新形 式的潤滑素，其具有優越的潤滑性質并且其可以配制并用于預防性地或治療性地治療各種 疾病，例如從關節疼痛到干眼病。
[0004] 發明背景
[0005] 蛋白聚糖4 (PRG4)基因編碼高度糖基化的表面潤滑蛋白叫做潤滑素、巨核細胞刺 激因子(MSF)、或淺表層蛋白（SZP)。（參見 Jay，Curr · Op in · Orthop · 15，355 (2004);美國專利 號6，743，774;美國專利號6，960，562)。潤滑素是從PRG4基因 （SEQ ID NO: 2)表達的，全長跨 12個外顯子，但是也有報道過多種天然發生的截短的版本。940個氨基酸的大的"類粘液素" 中央結構域（由外顯子6編碼)包含一些70+類KEPAPTT序列并且是重度糖基化的。所述糖蛋 白包含2型核心糖基化殘基和多樣性的1型核心聚糖(0-連接i3(l-3)Gal-GalNAc寡糖），其中 至少后者已經顯示出介導其主要的生理學功能，界面潤滑（Jay等，Glycoconj J 18,807 (2001))41^4已被顯示出存在于軟骨、滑膜、腱、和半月板的表面，在淚液膜中以及在其它 的解剖部位。PRG4已被顯示出有助于對接的關節軟骨表面的界面潤滑。PRG4已被顯示出不 僅僅作為單體存在還可作為二聚體和多聚體(1111111:;[1]161')(通過1'1-末端和0末端處保守的富 半月光氨酸結構域的二硫鍵）（Schmidt等，Biochim Biophys Acta· 1790(5): 375-84(2009); Kooyman等，Paper No.255,56th Ann.Meet of 0rthop.Res.Soc.，2010)〇
[0006] 在滑膜關節的軟骨交界面，有至少兩種潤滑的物理化學模式在起作用。這些被分 類為"流體薄膜"和"界面(boundary)"。運作的潤滑模式取決于關節連接組織上的正向力和 切向力，取決于這些表面之間切向運動的相對速率，以及取決于載荷和運動隨著時間的變 化。摩擦系數μ(無量綱單位，相對運動中的兩個表面之間所測量的摩擦力與所應用的正向 力的比率），提供了潤滑的定量量度。
[0007] -種類型的流體介導的潤滑或者"流體薄膜"模式是流體靜力的。在載荷開始時以 及通常延長的時間段里，軟骨內的組織液會變得增壓，由于此組織的雙相性（biphasic nature)，液體也可以通過滲流機制(weeping mechanism)而被擠壓至關節表面之間的微凸 體(asperities)。增壓的組織液和捕集的潤滑劑池(包含透明質酸）因而可以顯著有助于正 常載荷的承受(具有很少的對剪力的抵抗），促進了很低的摩擦系數。另外，在載荷和/或運 動開始時，可以發生擠壓膜、流體動力和流體彈性動力類型的流體薄膜潤滑，且有增壓、運 動、和變形作用來從相對運動中的兩個表面之間的缺口推動各種潤滑劑和/或推動各種潤 滑劑穿過相對運動中的兩個表面之間的缺口。
[0008] 在界面潤滑(boundary lubrication)中，載荷得到了表面-與-表面的接觸的支 持，并且相關聯的摩擦性質由潤滑劑表面分子(也即潤滑素種類)所確定。此模式很重要，因 為相對接的軟骨層通過互鎖、扁平微凸體而在總面積的+/-10%實現接觸，并且這很可能是 大部分的摩擦發生的地方。界面潤滑本質上減緩"粘滑（Stick-slip )"（Meyer等， Nanoscience:Friction and Rheology on the Nanometer Scale,fforld Scientific Publishing Co .Pte.Ltd，River Edge，N.J·，（2002)，pp. 373)，也即，承載重量的交界軟骨 表面彼此滑動時同時發生的猝動（jerking mot ion)，并因而表現為對穩定運動和起始運動 的降低的抵抗。軟骨表面典型的磨損模式表明，關節軟骨的界面潤滑對于關節表面結構的 保護和保持是關鍵的。例如，潤滑素空白小鼠顯示出磨損但是新生小鼠（其不承載重量)卻 未顯不（Jay等，Arthritis and Rheumatism,56:3662-3669(2007)。
[0009] 隨著載荷時間的增加以及流體靜壓的消失，相對于增壓的流體，潤滑劑涂敷的表 面承載越來越高的載荷，結果，μ越來越受到潤滑的界面模式的支配。潤滑的界面模式由穩 定滑動期間的摩擦系數所表示，其中影響流體薄膜形成的因素不變，如相對滑動速度和軸 向載荷。對于關節軟骨，已經得到的結論是界面潤滑必然會發生，但是要輔之以流體增壓和 其它機制。眨眼期間眼角膜和眼瞼交界面處的潤滑機制并不涉及顯著的載荷，因而減輕了 有效潤滑的物理化學要求，因此其很可能與軟骨潤滑有很大不同。然而，據提議潤滑的界面 模式可以在包含淚液膜時處于支配狀態，如在干眼病中。
[0010] 被認為造成滑液出色潤滑性質的兩種機械成分是潤滑素和透明質酸(或者透明質 酸鹽(酯)或"ΗΑ"，下文可互換使用）。潤滑素已經被顯示出在關節連接滑膜關節中作為界面 潤滑劑以及用于保護軟骨的表面以防摩擦力、細胞粘連和蛋白沉積。例如，美國專利號6， 960，562和6，743，774公開了包含基本純的PRG4同種型的潤滑多肽，以及通過全身性或者直 接施用至組織而潤滑滑膜關節或其它組織的方法。ΗΑ本身已經被顯示出在界面模式潤滑下 于軟骨-軟骨界面處相對于鹽水而言降低μ(3.3mg/ml的ΗΑ中0.12對比roS中~0.24)，而僅 有潤滑素將μ降低至更低的水平，但是包含HA以及潤滑素的滑液可以將僅有潤滑素或者HA 與潤滑素的合成混合物所不能實現的摩擦系數賦予給界面表面。尚未有潤滑素與ΗΑ的合成 混合物能夠完全復制天然形式的滑液所賦予的低摩擦系數。來自各種來源的以及各種分子 量的ΗΑ已經與以下混合進行了測試:從滑膜細胞體外表達的潤滑素，牛潤滑素，從滑液提取 的并且在ΗΑ中"重構的"潤滑素，以及在早期嘗試用重組DNA技術制備時以毫克量表達的潤 滑素。
[0011]此前在適于商業拓展的規模嘗試重組生產全長潤滑素還沒有取得成功。從CH0細 胞表達的人類潤滑素種類很低的（每升個位或者十位數毫克)生產率被認為過低而不能支 持商業產品。解決此問題的一種方法是截短外顯子6中的重復數目，并由此降低糖基化側鏈 的質量而又至少保留一些潤滑能力（參見，例如美國專利號7,642,236和7,893,029)。此方 法據報道會導致截短的構建物每升300至400毫克的總生產力（純化前）。
[0012] 發明概述
[0013]現在已發現人類PRG4基因可用于產生大的、商業量的新型的、高度糖基化的類人 類形式潤滑素，下文簡單稱之為"潤滑素"、多聚體潤滑素、重組人潤滑素、或rhPRG4。如本文 所公開的，這是通過以下來實現的：將人類PRG4基因（hPRG4)轉染至某些經修飾的中國倉鼠 卵巢(CH0)細胞中，所述細胞已被發現有能力大規模地將表達的蛋白翻譯后糖基化，并繼而 在商業規模體積的培養基中培養所述細胞，例如，至少10升、更常見至少50升、優選至少100 升或至少500升、以及最優選1，000升或更多。
[0014] 本發明的潤滑素包含多分散的潤滑素單體單元形成二聚體和多聚體以及任選存 在的游離單體。每個單元均被高度地且可變地糖基化，其中糖苷殘基側鏈貢獻了其分子量 的至少30%、常為35%或40%、以及可能高達45%或更高。
[0015] 在天然人類潤滑素中，糖基化由1型核心〇-連接GalNAc-Gal(N_乙酰半乳糖胺-半 乳糖)二糖(其至少60%在末端有唾液酸取代）、以及還有2型核心糖基化組成，所述2型核心 糖基化在1型核心之外涉及在各種同分異構的構型中的GlcNac(N-乙酰葡萄糖胺)單糖(參 見，例如Estrella等，Biochem J. ,429(2) :359-67(2010))〇
[0016] 本文中公開的所產生的重組材料與天然形式的人類潤滑素相比富含1型核心聚 糖。其糖基化包含至少95%的1型核心側鏈，更可能是超過98%或99%。另外，所述側鏈常常 會被硫酸化至天然人類潤滑素中未曾見過的程度。這將本發明的rhPRG4與天然hPRG4區分 開。該提高的硫酸化含量被認為可以向粘液糖蛋白增加額外的負電荷，其可用于增強所述 粘液糖蛋白抵制附近生物分子并由此提高其潤滑性的能力，并且使分子結構緊繃，從分子 角度使其更剛硬，這可以有助于發揮起降低納米尺度和中尺度摩擦的能力。
[0017] 全長（非截短的）潤滑素單體序列（SEQ ID NO: 1)在核心蛋白中包含1404個氨基 酸，或者說大約151kDa。人類潤滑素的信號序列是SEQ ID NO: 1的殘基1-24。因而，人類潤滑 素的成熟形式是SEQ ID NO: 1的殘基25-1404。如本文所公開的產生的重組產物的徹底還原 會產生大約300kDa-460kDa表觀分子量的單體種類，這是通過在許多分子量確定技術(包括 SDS三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽3-8%聚丙烯酰胺凝膠電泳）中與分子量標準比較而評估的。 使用質譜技術分析糖基化以及組合了其它操作表明，糖基化的重組單體的真實分子量(而 不是從凝膠迀移率所推斷）很可能是在220-280kDa的范圍，且不太可能超過大約300kDa。在 潤滑素單體的序列中可能存在的作為〇-連接糖基化位點的總共大約329個0-連接(其中284 個為蘇氨酸）中，有大量的可變和未知數量的被取代（100至150個，或許高達200或220)。在 總的糖基化中，大約有一般包含兩個糖單元（GalNAc-Gal)，以及一半包含三個糖單元 (GalNAc-Gal-唾液酸）。最豐富的形式是硫酸化的Gal-GalNac，次豐富的是唾液酸化的Gal-GalNac 〇
[0018] 所述潤滑素表達產物能夠抵抗(但卻并不能免除）斷裂成單體或者二聚體的潤滑 素種類。徹底還原的結果表明單體單元之間和之內包含二硫交聯。另外，用變性緩沖液處理 (沒有還原)可導致較低分子量的產物，表明了較高級別的四級結構，其中通過疏水相互作 用、氫鍵、物理纏結和/或允許自我組裝的其它非共價連結而將鏈保持在一起。所述二聚體 和多聚體是多分散的（polydisperse)。其中的分子種類通常具有大約450-600kDa的分子 量，以及多聚體種類常常是2,000kDa或更多。通常，非還原的復合物的一些種類在電泳實驗 中基本上不進入3-8%的SDS-PAGE凝膠。復合物更大的種類被認為是包含3至5個(或許可高 達20個)單體單元。
[0019] 不受理論局限，認為此類較大的超分子成分是作為單體/二聚體濃度的函數而形 成的。目前，認為單體/二聚體至少大約〇.5mg/ml的濃度對于較大復合物的自然形成是最佳 的。比這低很多的濃度(例如低于大約〇.lmg/ml)則包含單體和二聚體，而只有很少的量的 復合物；比這高很多的濃度則可形成肉眼可見的聚集物成為霧狀或絮狀溶液。可以使用表 面活性劑或者賦形劑來在形成復合物時防止大聚集物(其總是與二聚體的種類一起出現） 的形成，所述表面活性劑優選一般認為是安全的生理學適用的非離子表面活性劑，例如基 于聚氧乙烯的表面活性劑。
[0020]使用包含本發明潤滑素的制劑進行的測試顯示出，其在載荷下的潤滑和組織保護 性質可超過本領域內此前已知的重組潤滑素。不受理論局限，本發明人推測，在未受潤滑的 載荷下交界面組織運動時發生粘滑現象的時候，本發明潤滑素的涂敷可以將切力從下面的 軟骨表面轉移至多分散的潤滑素涂敷內的層。也即，本發明人認為，在載荷下和往復運動 時，下表面經受較少的切力，保持其完整性，因為涂敷中的潤滑素分子彼此覆蓋，而在載荷 去除后很可能會重新排列（參見，例如Lee等，PNAS，110(7):E567-574(2013))。該作者表明 了，滑膜關節磨損并不與摩擦系數直接相關，但是更直接地與粘滑滑動相關，并且滑膜關節 的不同分子成分協同作用來防止磨損。
[0021 ]在任何情況下，本發明的潤滑素產物，在接受測試時，呈現出卓越的潤滑性質，導 致摩擦系數(靜態和動態的)常常位于純化的天然牛潤滑素的系數的150%、120%、110%之 內或者基本上與之相等(通過本文公開的軟骨對軟骨的潤滑測試來測定）。在這些測試中， 本發明的類人糖蛋白實現了靜態摩擦系數位于或低于0.5和低于0.2(取決于本文所公開的 測試條件），以及動態摩擦系數常常位于或低于大約〇. 1，二者都是通過在體外減壓軟骨對 軟骨的載荷而進行測量(具有固定接觸面積）。當與透明質酸(HA)組合時，這些值提高至對 于靜態測量的低于大約0.3以及低于0.1(取決于保壓時間（dwell time))以及對于動態測 量的低于0.1，很接近于滑液可接受的值。因而，此類組合物可以顯著減少滑膜關節磨損。
[0022] 因此，本發明的一個方面包括用于潤滑素的商業生產的方法。在一個實施方案中， 所述方法包括以下步驟：在培養基中培養中國倉鼠卵巢（CH0)細胞，所述中國倉鼠卵巢 (CH0)細胞轉染有人類PRG4基因，并且其在足以產生潤滑素糖蛋白的時間里和條件下表達 所述人類PRG4基因并對表達產物進行翻譯后糖基化;和從所述培養基純化潤滑素糖蛋白。 例如，在一些實施方案中，將所述潤滑素糖蛋白與細胞外液中的宿主細胞蛋白和其它雜質 分離，以至少部分地將其純化。所述重組蛋白僅需要從培養基中富集，而不是純化至均質 性，以便純化用于本發明方法的目的。所述方法足以產生這樣的潤滑素糖蛋白，其具有至少 30%重量的糖苷殘基在培養基中濃度為至少0.4g/L。
[0023] 在一些實施方案中，所述CH0細胞是包含編碼人類PRG4基因的核酸的CH0-M細胞。 在其它實施方案中，所述CH0細胞轉染有第一載體以及轉染有第二載體，其中所述第一載體 包含編碼染色質元件的核酸，而所述第二載體包含編碼人類PRG4基因的核酸。所述染色質 元件可以是邊界元件、基質附著區、基因座控制區、或通用染色質開放元件（universal chromatin opening element)。在優選的實施方案中，所述染色質元件是基質附著區。 [0024]在另外的實施方案中，所述CH0細胞轉染有第一載體以及轉染有第二載體，所述第 一載體包含編碼染色質元件和編碼人類PRG4基因的核酸，而所述第二載體包含編碼染色質 元件和編碼人類PRG4基因的核酸。在優選的實施方案中，所述第一和第二載體中的染色質 元件是基質附著區。
[0025]在一些實施方案中，所述二聚體或多聚體潤滑素糖蛋白重量的至少30%、至少 35%、至少40%、或至少45%是糖苷殘基的重量。在一些實施方案中，所述二聚體或多聚體 潤滑素糖蛋白重量的超過30 %、超過35 %、超過40 %或、超過45 %是糖苷殘基的重量。所述 糖苷殘基可以與天然人類潤滑素的那些不同，因為重組類人潤滑素的糖基化至少90%、至 少95%、或至少99%的重量為1型核心糖基化。另外，在一些實施方案中，與天然人類潤滑素 相比所述糖苷殘基富含硫酸化的單糖。
[0026]所述方法出乎意料地能夠產生具有商業效益的量的全長潤滑素糖蛋白。例如，可 以在足以產生這樣的潤滑素糖蛋白的時間里和條件下培養所述細胞，所述潤滑素糖蛋白在 培養基里的濃度為每升培養基至少約〇. 4克或0.5克重組潤滑素、優選每升培養基至少0.8 克、以及最優選每升培養基至少1. 〇克的潤滑素，例如，在至少約1 〇、50或100升的培養中。所 述方法經優化后可以在每升的培養基產生多達2.0、至少2.5、或至少3.0克的潤滑素。基于 優化的純化方案的開發，將可能會獲得每升至少約200毫克的純化重組潤滑素、優選至少 300mg/L、更優選至少500mg/L、以及最優選可以獲得更多。就
【申請人】所知，此前在任何類粘 液素蛋白（或者大小上與潤滑素相當的蛋白）的重組表達中都從未實現這些水平的生產力， 并且表達PRG4的嘗試也從未成功產生具有本文所述產品的性質的材料。
[0027]在優選的實施方案中，單體潤滑素種類常常從培養基中與多聚體蛋白種類混雜在 一起被共同純化出來。所述多聚體種類富含二聚體潤滑素種類。例如，在一些實施方案中， 所述方法產生這樣的重組潤滑素的混合物，其包括單體、二聚體、和多聚體潤滑素種類。在 一些實施方案中，所述潤滑素糖蛋白包含至少5個經二硫鍵或者經非共價連結的個體糖基 化氨基酸鏈，并且具有至少1200kDa的分子量。
[0028]根據本發明的方法所產生的糖蛋白，在使用下文所述方案進行測試時，產生出接 近純化天然哺乳動物潤滑素所曾觀測到的最低值的摩擦系數。例如，在一些實施方案中，所 述重組潤滑素糖蛋白是這樣的多聚體蛋白蛋白，其在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的所產生 的靜態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素靜態摩擦系數的150%。在其它實施方案中，所 述重組潤滑素糖蛋白是這樣的多聚體蛋白，其在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的所產生的靜 態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素靜態摩擦系數的120%。在另外的實施方案中，所述 重組潤滑素糖蛋白是這樣的多聚體蛋白，其在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的所產生的靜態 摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素靜態摩擦系數的110 %。
[0029]本發明的另一方面涉及在宿主細胞培養中從人類PRG4基因表達的重組多聚體潤 滑素糖蛋白的組合物。所述重組潤滑素糖蛋白至少30%重量為糖苷殘基，并且在軟骨對軟 骨摩擦測試中測量的所產生的動態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素動態摩擦系數的 150%〇
[0030] 在一些實施方案中，所述重組潤滑素糖蛋白重量的至少35%、至少40%、或至少 45 %為糖苷殘基。
[0031] 在一些實施方案中，在軟骨對軟骨摩擦測試中，所述重組潤滑素糖蛋白產生不超 過純化的天然牛潤滑素的動態摩擦系數的110 %或不超過其120 %的摩擦系數。
[0032] 在一些實施方案中，所述重組潤滑素的糖苷殘基與天然人類潤滑素的糖苷殘基的 不同在于，所述重組潤滑素的糖基化重量的至少90%、至少95%、或至少99%為1型核心糖 基化。另外，在一些實施方案中，與天然人類潤滑素相比所述重組潤滑素的糖苷殘基富含硫 酸化的單糖。
[0033] 在一些實施方案中，所述重組潤滑素是單體、二聚體和多聚體種類的混合物。在一 些實施方案中，所述潤滑素包括單體種類。在一些實施方案中，所述潤滑素包括二聚體的種 類。在一些實施方案中，所述潤滑素包括多聚體種類。在一些實施方案中，所述潤滑素是多 聚體單體種類的混合物。
[0034] 在一些實施方案中，所述潤滑素糖蛋白包含至少5個經二硫鍵或者經非共價連結 的個體糖基化氨基酸鏈，并且具有至少1200kDa的分子量。
[0035] 在一些實施方案中，重組潤滑素糖蛋白的組合物還包含與所述潤滑素糖蛋白混雜 的透明質酸或其鹽。
[0036] 在另一實施方案中，本發明涉及包含溶液的組合物，所述溶液包含100克的人類潤 滑素，其中所述潤滑素的糖基化至少99%的重量為1型核心糖基化。在一個實施方案中，所 述潤滑素是重組人類潤滑素。在另外的實施方案中，所述溶液中潤滑素的濃度為至少〇.5g/ L。在另外的實施方案中，所述溶液是細胞培養基。
[0037]本發明的組合物可用于制備藥物，所述藥物用于任何已知的或此后發現的PRG4糖 蛋白的醫療或其它用途，包括作為用于與身體接觸的各種設備的涂層(參見，例如美國專利 申請號2009/0068247和2011/0142908);用于通過滑膜關節潤滑的增強而在人類或動物中 治療滑膜關節（美國專利申請號2004/0229804)或者粘彈性物補充療法(美國專利申請號 2008/0287369);用于局部應用于組織表面，例如，在手術期間抑制粘連或纖維性結締組織 的隨后形成（美國專利申請號2004/0229804);用于治療干眼病（美國專利申請號2011/ 0059902);用于治療口干癥(美國專利申請號2013/0039865);用于治療間質性膀胱炎（美國 專利申請號2012/0321693);作為陰道潤滑劑(美國專利申請號2012/0052077);用于隱形眼 鏡護理和儲存溶液(美國專利申請號2012/0321611)或者用于全身注射以便，例如抑制細 胞-細胞粘連或者在脈管內的運動（參見，例如2013年11月26日提交的美國臨時申請61/ 908,959)〇 [0038] 附圖簡述
[0039]圖1和2是用于開發表達潤滑素的CH0-M克隆（用于本發明的方法并編碼hPRG4全長 序列）的載體的質粒圖譜。
[0040] 圖3和4描繪了可用于評估本發明的重組人潤滑素結構的聚丙烯酰胺凝膠。
[0041] 圖5是一次潤滑素生產過程的生產力的圖示，該生產過程測量每升轉染的CH0-M細 胞培養物隨時間所產生的潤滑素毫克數。在每個收獲日期有三個柱狀圖。左側的柱狀圖為 "標準曲線24Jun 14"，中間的柱狀圖為"標準曲線24Jul 14"，而右側的柱狀圖為"標準曲線 25Jul 14"。
[0042] 圖6是顯示本發明重組人潤滑素的1型核心聚糖的示意圖。
[0043]圖7是色譜圖，其中峰被標記，顯示出從本發明的重組人潤滑素中的SER和THR殘基 上垂下的各種二糖和三糖的相對豐度。
[0044] 圖8是示意圖，其顯示了擴展至從人類滑液提取的天然潤滑素上的2型核心結構的 更大范圍的聚糖。
[0045] 圖9是色譜圖，其中峰被標記，顯示出天然人類潤滑素中各種糖殘基的相對豐度。 [0046] 圖10A、10B、和10C是表面張力對比rhPRG4和/或聚氧乙烯表面活性劑濃度的制圖， 顯示出隨著rhPRG4濃度的升高表面張力的降低。
[0047]圖11A和11B示出數據，將rhPRG4溶液的靜態（圖11A)和動態（圖11B)摩擦系數與純 化的天然牛PRG4、鹽水(PBS)、和牛滑液比較，其中兩種PRG4制劑均為450yg/mL。標注a、b、和 c表示結果中統計學顯著的差異(？〈〇.〇5)，11 = 7。在^1-?1?4(重組的）和1^1出4(天然的）的結 果中沒有統計學顯著的差異，由圖11B中每個柱狀圖上存在的"b"所表明。
[0048] 圖12A-B示出數據，將HA加上rhPRG4溶液的靜態(FIG.12A)和動態（圖12B)摩擦系 數與鹽水、僅有rhPRG4、和牛滑液比較，其中rhPRG4為450yg/mL而HA (1.5MDa)為3.3 3mg/mL。 圖12B中每個柱狀圖上的標注a、b、c、和d表示結果中統計學顯著的差異(p〈0.05)，n = 4。
[0049] 圖13示出數據，顯示在消化天然牛PRG4并應用rhPRG4之后于交界面牛組織表面的 潤滑性重建。
[0050] 圖14A-D示出數據，顯示鹽水中300μg/ml的天然牛PRG4和rhPRG4、和僅有鹽水時， rhPRG4在人類眼角膜-眼瞼交界面（圖14A-靜態，圖14B-動態)和人類眼角膜-PDMS (圖14C-靜態，圖14D-動態)交界面處對界面潤滑的作用。數值為均值±SEM(n = 6)，其中眼角膜-目艮 瞼(AB)和眼角膜-PDMS(O))交界面的平均正向應力（normal stress)分別為14.1 ± 2.2和 16.9 ± 5.3 (均值土 SD)。這些數據表明了 rhPRG4與純化的天然PRG4在低載荷潤滑任務中幾 乎相同的潤滑性質。
[0051] 圖15是全長人類潤滑素的氨基酸序列，其長度為1404個氨基酸。信號序列殘基（1-24)以粗體顯示。
[0052] 圖16是編碼全長人類潤滑素的核酸序列。
[0053] 發明詳述
[0054]本發明人研究了使用重組DNA技術生產已知人類潤滑素糖蛋白的選擇，目標在于 產生這樣的生產方法，其中涉及在無血清生長培養基中運用哺乳動物細胞進行的懸浮培 養。與
【申請人】熟知的使用重組DNA技術產生蛋白的之前的嘗試不同，挑戰在于產生商業量的 這樣的復雜的、大的生物聚合物，其價值在于其納米尺度的機械性質，而不是其生化性質， 并且這些物理性質依賴于翻譯后糖基化以此前從未在改造的細胞中觀測到的尺度成功進 行。
[0055]此前重組產生全長潤滑素的嘗試每升的量僅僅曾產出低數量的毫克，而需要的是 每升產生至少約1-2克的方法。對文獻的綜述表明尚無成功在商業規模重組產生全長的適 當糖基化的潤滑素的報道，也沒有商業規模表達任何粘液素或類粘液素蛋白的報道。檢索 確實顯示有報道提出此類高度糖基化的糖蛋白作為潤滑素很難表達。參見，例如美國專利 號7，642，236，其中提到："為了優化表達參數并研究所有大約76-78個類似KEPAPTT的序列 的功能必要性，設計了潤滑素表達構建物，其使得能夠合成具有變化程度的〇-連接寡糖取 代的重組潤滑素蛋白"。表達截短的潤滑素構建物的重組細胞系的生產力數據在該專利中 沒有公開。
[0056] 本發明人尋找并最終獲得了瑞士日內瓦的Selexis S.A.來產生表達潤滑素的克 隆培養物，這部分地基于報道的Selexis技術的能力（涉及表觀遺傳調節因子的表達，以增 強難以表達的蛋白的生產）（參見Selexis美國專利號7，129,062和8,252,917以及美國專利 申請公開號2011/0061117、2012/0231449和2013/0143264,其公開內容援引加入本文； Girod等，Nat Methods 4(9) :747-53(2007) ;Harraghy等，Curr Gene Ther.8(5) :353-66 (2008))〇
[0057] Selexis技術的應用導致了成功表達潤滑素的克隆的開發。分析之后，進行規模擴 大和純化，發現了新開發的重組生產過程導致了此前從未有描述過的、多聚體的、高度和差 異糖基化的類人潤滑素形式，并且產量對于此類高度糖基化的、高分子量的類粘液素糖蛋 白而言也是出乎意料的水平。對于富含新的重組潤滑素形式的制劑所進行的測試證明了出 乎意料的性質，并且使得可以產生具有改善的生理學適應性的組織潤滑組合物。
[0058] 重組人潤滑素(rhlubricin)制備過程
[0059] 宿主細胞
[0060] 產生Selexis克隆的工作是使用其專有的CH0-M細胞系來完成的，該細胞系含有基 于DNA的元件控制染色質的動態組織，所謂的基質附著區。所述CH0-M細胞系是中國倉鼠卵 巢細胞系衍生自CH0-K1細胞(ATCC，Cat. #CCL-61，Lot. 4765275)，其適應無血清培養條件并 用于產生重組蛋白。參見Girod等，Nat Methods 4(9) :747-53(2007)和上文提到的Selexis 的美國專利和出版物，其涉及使用基質附著區(MAR)的MAR方法用于開發穩定高表達的原核 細胞系如CH0、以及涉及經轉染表達蛋白的細胞所述蛋白參與表達產物穿過ER膜的移位和/ 或穿過細胞質膜的分泌。CH0-M被用于產生治療性重組蛋白并且允許更高的和更穩定的表 達。其使用使得可以分離出展現期望的、高水平表達(用于產生重組蛋白）的克隆。
[0061 ]基質附著區（"MAR"）是以高親和力結合分離的核骨架或核基質的DNA序列（Hart 等，Curr Opin Genet Dev,8(5):519-25(1998)。由此，它們可以定義獨立染色質結構域的 邊界，從而只有所涵蓋的順式調控元件控制結構域內的基因的表達。已經有顯示MAR序列與 增強子相互作用以提高局部的染色質可接近性（Jenuwein等，Nature，385 : 269-272 (1997))，并且可以在細胞培養系里增強異源基因的表達。攜帶有雞溶菌酶5'MAR元件的質 粒與一或多個表達載體的共轉染會導致提升的穩定轉基因表達(顯示出產生與對照構建物 相比提高20-倍的表達）。
[0062] MAR是本文引用的Selexis申請和出版物中公開的一種類型的"染色質元件"（本文 中也稱作Selexis遺傳元件或SGE)。染色質元件或SGE用于防止圍繞著異源基因整合至宿主 染色體位點的染色質影響所整合的基因的表達水平。染色質元件包括邊界元件或者隔離元 件（BE)、基質附著區（MAR)、基因座控制區（LCR)、以及通用或者遍在的染色質開放元件 (UC0E)。一旦表達載體整合至宿主細胞染色體中，則SGE使染色質成型并因而使轉基因保持 在高度轉錄活性狀態。
[0063] 所述CH0-M宿主細胞在SFM4CH0培養基(HyClone)中培養，其中補加了 8mM的L-谷氨 酰胺、次黃嘌呤和胸苷（lx HT，Invitr〇gen)。細胞在潮濕的溫育器中于37°C和5%的C02下 保持攪動（120rpm，25mm滑動（stroke))。
[0064] 載體構建
[0065] 將編碼全長1404AA人類潤滑素蛋白的PRG4基因（SEQIDN0:2)插入到了商業可購 買的質粒載體中（Selexis S.A.專有）（Geneva, Switzer land)以用于在哺乳動物細胞中增 強的基因表達。編碼全長人類潤滑素的另一個序列可以從GenBank登錄號NM_005807.3獲 得。
[0066]構建了兩個表達載體。潤滑素基因被克隆至攜帶有嘌呤霉素抗性的載體以及另一 個攜帶有潮霉素抗性的載體中。包括嘌呤霉素抗性的載體命名為pSVpuro_C+_EFlalpha (K0ZAK-ext9)EGFP_BGH pA>X_S29(2*HindIII，SalI填充）（Mw = 9861)。包括潮霉素抗性的 載體被命名為pSVhygro_C+_EFlalpha(K0ZAK-ext9)EGFP_BGH pA>X_29(2*HindIII，SalI填 充(Mw=10299)。所述表達載體含有來自轉座子Tn3(AmpR)的細菌β-內酰胺酶基因（賦予了 氨節青霉素抗性），以及細菌ColEl復制原點。作為pGL3Control(Promega)的衍生物，表達載 體的終止子區域含有SV40增強子(位于多腺苷酸化信號的下游）。每個載體還在表達盒的下 游包括一個人類X_29SGE以及在SV40啟動子控制之下的整合的嘌呤霉素或潮霉素抗性基 因。X_29SGE是指Selexis遺傳元件（"SGE"），在此情形中是基質附著區(MAR)，其在本文引用 的Selexis申請和出版物中公開。兩種表達載體均編碼在hEF-1-alpha啟動子結合CMV增強 子的控制下的感興趣的基因（PRG4)。質粒通過測序驗證。
[0067] 攜帶有嘌呤霉素抗性基因和攜帶有潮霉素抗性基因的載體的質粒圖譜分別在圖1 和圖2中示出。
[0068] 11?
[0069] 使用定義為CH0-M細胞脈沖條件（ 1250V，20ms和3脈沖）的MicroPorator? (NanoEnTek Inc.，Korea)來通過微穿孔而轉染所述細胞。使用了并行的GFP表達載體來控 制轉染效率，并顯示出轉染效率在50-70%之間。首先用嘌呤霉素 PRG4表達載體轉染所述 CH0-M細胞，并通過在含有嘌呤霉素的培養基上的培養來篩選經穩定轉染的細胞。更具體而 言，將稀釋液分配至96-孔平板上，在接下來的一周通過向所有孔添加100yL的新鮮培養基 (SFM4CH0培養基，補加有8mM的L-谷氨酰胺、lx HT包括5yg/mL的嘌呤霉素)來進行給料。通 過將完全的細胞懸液從相應的96-孔轉移至24-孔平板(用相同培養基預處理）的一個孔，而 在鋪板后的15天將27個小匯集(mini匯集)重置于24-孔平板。在4天之內分析了 24-孔的懸 液并且將14個小匯集轉移至6-孔平板（lmL細胞懸液+2mL新鮮培養基(包括篩選））。3天后通 過懸液以及在離心管(5mL工作容積）中收集而將8個表達最好的小匯集進行了擴展，并在3 天后在搖瓶(20mL工作容積）中進行培養。在保存前進行了隨后的一次傳代。
[0070] 在搖瓶中擴展了抗性細胞的匯集，以產生初步研究所需的材料(總管l-2mg).通過 將細胞培養物在800g離心5min而獲得了無細胞培養基樣品。通過斑點印記分析而測定了重 組PRG4的表達。將10微升的無細胞培養基(濃縮的樣品）應用于PVDF膜(Millipore)上并使 樣品干燥成斑點。通過將PRG4從80μg/ml系列稀釋至2.5μg/ml而創建了 PRG4標準物。通過針 對PRG4的潤滑素合成肽的單克隆抗體(Pierce)的措施來檢測重組PRG4。
[0071] 接下來用來自性能最佳的小匯集的細胞進行了超轉染(對已經過篩選的小匯集群 體進行額外的轉染），其中施用第二種篩選標記，所述潮霉素抗性盒。使用了上文所述的相 同轉染方案。在此第二次轉染后1天，在SFM4CH0培養基中開始了篩選，也補加了 8mM的L-谷 氨酰胺和lx HT，但還包括lOOOyg/mL的潮霉素。在更換培養基后，4天內將3個匯集轉移至6-孔平板；4天后將全部3個（3)匯集擴展至離心管（5mL工作容積）并在三天內擴展至搖瓶 (20mL工作容積）。
[0072] 克隆生成
[0073]繼而在多個以及系列的實驗中將超轉染的匯集進行培養并分析生長潛力，以嘗試 將細胞性質最大化。
[0074]在第一個實驗中，在100細胞/mL的濃度更換培養基之后，將三個超轉染的匯集(命 名為P01ST、P05ST、和P14ST)轉移至6-孔平板（每個匯集兩個平板），于半固態培養基（2x SFM4CH0培養基(HyClone)和CloneMatrix(Genetics)中，包括8mM的L-谷氨酰胺，lx HT和細 胞Boost 5TM(HyCl〇ne)，（無篩選）。16天之后對鋪板的細胞進行了篩選，（ClonePix?系統 (Molecular Devices))，且挑選了22個候選并轉移至96-孔平板(具有上文所述的生長培養 基(但是無篩選））。6天后將全部18個生長的候選重置至24-孔平板，其中是通過將完全的細 胞懸液從相應的96-孔轉移至24-孔平板的一個孔(經lmL的培養基預處理）。在3天內分析了 24-孔上清，并將12個候選轉移至6-孔平板（lmL細胞懸液+2mL新鮮生長培養基（包括篩 選））。5天后將7個最佳表達的候選擴展至離心管(5mL工作容積）內培養基(無篩選）中的懸 液培養中，并在5天內擴展至搖瓶(20mL工作容積）中。
[0075]所有的細胞系都被保存起來。在搖瓶(接種3xl05細胞/mL，20mL培養容積）內于分 批給料培養(給料策略-16%的原始體積的CB5溶液(HyClone)，52mg/mL，在第0、3、4、5、6、7 天給料）中比較了3個最佳候選的性能。在第8天，所述培養物含有4.22x 106至4.95x 106細 胞/mL以及94%至96%的活力。對這些匯集的細胞群體進行了計數并稀釋用于單一細胞鋪 板(濃度1細胞/孔，2個平板）。在11天后通過向每孔添加 100μΙ的生長培養基來對單一細胞 群(single colony)進行給料(無篩選）。在17天后，將99個克隆重置于24-孔平板中，其中是 通過將完全的細胞懸液從相應的96-孔轉移至24-孔平板的一個孔(經lmL的培養基預處 理）。在4天內，24個被轉移至6-孔平板(3mL的新鮮生長培養基包括篩選）。4天后8個克隆被 擴展至離心管(5mL工作容積）中的懸液培養，并且在一次培養基更換(SFM4CH0培養基，補加 有8mM的L-谷氨酰胺和lx HT)之后所有8個克隆都被擴展至搖瓶(20mL工作容積）。在保存所 有候選前進行了隨后的一次傳代。
[0076]使用分批給料培養(給料策略16%的原始容量CB5溶液(HyCl〇ne)，52mg/mL，在第 0、3、4、5、6、7天給料），在搖瓶(接種3x 105細胞/mL，20mL培養容積）中對5個最佳候選的性 能進行了比較。在第3天各個培養物中的細胞數目范圍在1.61x 106至3.46x 106細胞/mL，翻 倍時間范圍在19.8至30.7小時）。在第8天，細胞的濃度范圍在4.02x 106至9.48x 106細胞/ mL，其中細胞活力范圍是88.6%至97.7%。
[0077]在第二個實驗中，將3個不同的超轉染的匯集（命名為P14STcp08、P05STll和 P14ST33)用上文所述的相同的程序處理。這導致了 4個克隆細胞系。再次，這些克隆的性能 在搖瓶中進行了比較，導致在第8天細胞濃度的范圍是3.5x 106至9.48x 106細胞/mL并且活 力為 75.3%至 88.1%。
[0078] 來自上文所述的ClonePix?系統篩選的第一輪的克隆(P14ST15)(其在第8天展現 出6.03x 106細胞/mL以及95.5 %的活力）在搖瓶(20mL工作容積）中進行了解凍。在一次隨 后的傳代之后，該候選被轉移至單一平板（以200細胞/mL的濃度（1個平板）），于上文所述的 半固態培養基外加 CloneMatrix中，包括8mM的L-谷氨酰胺，lx HT和細胞Boost 5?，無篩選。 12天后使用ClonePix?系統對鋪板的細胞進行了篩選，挑選了 84個克隆并轉移至96-孔平板 (無篩選）。通過向每孔添加1〇〇μ1的生長培養基來對單一細胞群進行了給料。96-孔上清的 篩選在鋪板后18天進行。最佳的24個生長的克隆被重置于24-孔平板，其中是通過將完全的 細胞懸液從相應的96-孔轉移至24-孔平板的一個孔(經lmL的培養基預處理(無篩選）。在3 天內，分析了 24-孔上清，并將12個克隆轉移至6-孔平板（lmL細胞懸液+2mL新鮮的生長培養 基(包括篩選））。4天后將6個最佳表達的克隆擴展至離心管(5mL工作容積）中的懸液培養， 以及在4天內擴展至搖瓶(20mL工作容積）。在保存前進行了隨后的兩次傳代。保存了 6個克 隆細胞系。
[0079] 如上文在搖瓶中比較了6個最佳候選的性能。在第8天，細胞密度范圍在9.04x 106 至6 · 40x 106細胞/mL之間，并且活力在74 · 6%至93 · 1 %之間。
[0080] 冷凍保存和測試
[0081] 在所述克隆匯集的多次傳代后（從6至31)，以6xl06細胞/小管來將所述匯集冷凍 保存在小管中并儲存于液氮中。通過使用Veno^Gem支原體檢測試劑盒（ Minerva Biolabs)確認了所有細胞系都沒有支原體。根據廠商方案接種并溫育無菌性測試(Heipha， Caso-Bouillon TSB)。確認了所有小匯集和超轉染的小匯集的無菌性。
[0082] 放大培養
[0083] 選擇了命名為P05STll-cp05的細胞系用于放大。對于200升的運行，使用了如下條 件和方案：
[0084]
[0085] 在200升的培養中從第1天至第8天，rhPRG4的表達與存活細胞密度(V⑶)一起提 高。VCD在第8天進入平臺期，繼而開始下降，這在一旦條件對于密集細胞培養系統的代謝需 求不再是最佳時是通常可見的。盡管如此，rhPRG4的表達依然不減退，并且其表達在VCDS 12-14x 106細胞/ml的培養系統中于培養的第13天達到了最大濃度。圖5顯示了重組潤滑素 隨著時間的累積量，其是使用HPLC作圖的曲線下面積測量的，并通過與樣品系列稀釋的 HPLC純化(認為至少99%的純潤滑素)所制成的三個不同的標準曲線比較而進行解讀。如所 示，此過程估計重組潤滑素的生產接近2.5g/ml。另外的生產運行在由各種技術測量時其表 現產量有變化。由競爭性ELISA測量的一個運行產生了 1.5g/升水平的潤滑素。另一個產生 了 1.4g/升的讀數。
[0086] 重組PRG4的純化
[0087]開發純化方案的目的是要在與雜質分離時保留所表達的潤滑素產物及其多聚體 復合物的潤滑功能、避免聚積、以及保持高產量。這由于如下原因而成為挑戰：潤滑素的重 度糖基化、其高分子量、其抗粘連和表面潤滑性質、以及其隨著純度提高而形成復合物和聚 集形成不可溶微粒的傾向。早前的實驗表明，由于所收獲的培養基中潤滑素滴度很高，因而 可能必需要流通模式的色譜來避免純化損失。開發了一種策略，通過色譜吸附提取雜質而 將潤滑素產物保留在流通物中。在開發過程中，發現產量對于所使用的非離子表面活性劑 成分很敏感，如例如，失水山梨醇月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物。潤滑素匯集中此種表面活性 劑的缺失導致在色譜分離步驟后的超濾/滲濾以及〇.2μπι過濾期間產物的顯著損失。只要使 用0.1%重量的表面活性劑即可大大提高產量。通過試錯，發現較低濃度的表面活性劑成功 保留了功能并改善了產量。
[0088]在純化過程中所使用的非離子表面活性劑之外，生理學相容形式的賦形劑，如 [(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)和/或賴氨酸，可以與本發明潤滑素的溶 液混合并且可以對穩定溶液有益處，例如，避免或者減少含有超過〇. 4或0.6mg/ml濃度的溶 液中潤滑素的聚積。
[0089] 迭代測試導致了下文所示的純化過程的開發。
[0090] 通過沉降所澄清的培養基（10〇11^)用511^的20〇111]\11^8、4〇111]\11%(：124!18.2來稀 釋，并與400單位的1^112〇仙86(2501111；^8/^1，1'1〇￥38611)混合來去除可溶的多核苷酸。該溶液 在室溫混合4小時，繼而與37.8g的尿素混合以將尿素的濃度調節至6M，并導致120mL的溶 液。為此加入了 1N的NaOH以將pH調節至11以及0.01 %的Tween 20(失水山梨醇月桂酸酯， Sigma)〇
[0091] 經Benzonase處理后的材料接著用GE Q Big Beads?的陰離子交換樹脂(pH 11)處 理，其中存在6M的Urea和0.01 %的Tween 20并且以流通(FT)模式運行，其中雜質結合至樹 脂而產物卻不結合。該柱首先用0.1N的NaOH來清潔;接著充入100mM的NaP〇4、1.5M的NaCl、 pH 7.2;并用200mM的Tris-Borate、6M的尿素 、pH 10再平衡。30ml容積的（XK 26x 6cm)柱接 著裝載120ml溶液（4ml/ml樹脂20ml/min的流速（240cm/hr)，隨后用平衡緩沖液-100mM Tris-Borate、100mM NaCl、6M尿素、0.01%Tween 20、pH 11 來洗滌。裝載之后一會兒，通過 洗滌收集產物（290mL總體積)直至加入脫離溶液(strip solution)0.1N Na0H+lM NaCl〇
[0092] 用1M的檸檬酸將此種部分純化的流通物潤滑素匯集進行pH調節至pH = 7.5,并穿 過輕磷灰石柱(BioRad CHT)，柱體積-14ml(XK 16x 7cm)，柱載荷-21ml裝載/ml樹脂，流速 = 10ml/min(300cm/hr)。該柱首先用0.1N NaOH的 1M NaCl清潔，充入500mM NaP〇4，pH 6.5; 用500mM NaP(k/6M尿素 ，pH 7.4再平衡；并載入來自上述步驟的29〇11^流通物。這之后是用 平衡緩沖液洗滌（15禮似?04,61尿素，0.01%了￥661120，？!17.4)，以產生3051111的含有產物 的流通物(f 1 〇w-through)。
[0093] 用1M的檸檬酸將來自羥磷灰石柱的流通物調節至pH 4.8并用水稀釋，繼而穿過GE SP Big Bead樹脂，柱容積-6ml(XK 1·6χ 3cm)，柱載荷-58ml載荷/ml樹脂，流速= 6.7ml/ min(200cm/hr)。該柱首先用0.5N NaOH清潔，充入lOOmM NaP〇4，1.5M NaCl，pH 7.4;用50mM 檸檬酸鈉/6M尿素，0.01%TWeen 20，pH 4.8;并載入來自上述步驟的35〇11^的流通物。隨后 是用平衡緩沖液、501^檸檬酸鈉/61尿素、0.01%1^?^1120、？!14.8洗滌，以產生3781111的含 有產物的流通物。繼而用10N Na0H(pH 7.2)將所述流通物中和。
[0094] 為了濃縮以及更換緩沖液，使用50kDa分子量截斷值的TangenX 0.01m2平片膜 (TangenX技術Corporation)、LP篩選通道來過濾陽離子交換后的流通產物匯集。滲濾緩沖 液為 10mM NaP〇4、150mM NaCl、pH 7.2(PBS)和0.1%Tween 20。在用0.1N NaOH清潔后；用 MilliQ水清洗;并用 10mM NaP〇4、150mM NaCl、pH 7.2平衡，該膜以15,00〇1111/1112進行載荷;穿 流(Cross-flow)70ml/min;跨膜壓= 6_7psi ;滲透流= 5_6ml/min以將溶液濃縮至50ml。
[0095] 最后，經耶0?后的產物匯集通過3&1'1:〇1'；[118 3&1'1：(^0代2、150-0.0151112的膜而經 受0.2μπι的過濾，其中膜載荷為~17,000ml/m 2,以及流速為45-50ml/min。所述膜首先用 1011^的似?04、15011^的似(：1、？!17.4來準備好，繼而對產物進行過濾，隨后是用~401111的緩 沖液的追蹤過濾器(chase fi 1 ter)并且最后該過濾器被排干。
[0096]目前正在檢驗另外的賦形劑，以改進從UFDF和0.2um的過濾處回收最終純化的產 物。此過程可以從每升收獲的培養基產生大量的產物(至少96%的純度）。另外的純化策略 是本領域技術人員了解的。
[0097]潤滑素產物的表征
[0098] 電泳
[0099] 全長潤滑素氨基酸骨架的分子量為150,918道爾頓。分子和分子間的糖基化程度 和類型不同。本文中作為二聚體的種類制備的重組PRG4被認為是具有超過大約450kDa的平 均分子量。單體應具有220-280kDa的分子量，且不超過大約300kDa。
[0100] 圖3示出了rhPRG4的考馬斯亮藍染色凝膠(Tris-Ac 3-8%NuPAGE:l< SDS-PAGE聚 丙烯酰胺凝膠電泳系統，Invitrogen)，非還原的（作為純化的）和還原的和烷基化的。所有 編號的條帶都通過MS/MS確認為潤滑素，具有匹配人類PRG4的氨基酸序列（UniProt登錄號 Q92954:SEQ ID N0:1)。如所示，如上文所述產生的重組潤滑素(NR)含有具有~460kDa的大 約分子量(通過與分子量標準比較而估計）的主要條帶，一個條帶稍稍在之上，以及一個條 帶在凝膠的頂端未能迀移進入該凝膠。
[0101] 翻譯后加工成分的鑒別是用神經氨酸苷酶(NaNase 1)和0-糖苷酶DS同時消化 rhPRG4來完成的，其暴露出rhPRG4的氨基酸核心的分子量(如圖4中標記為L-N0的泳道內所 示）。該核心的預測分子量為151kDa，其通過此4-12%的SDS-PAGE而實驗確認。僅用神經氨 酸苷酶消化對分子量有降低作用，說明糖基化對神經氨酸是不完全覆蓋。用〇-糖苷酶DS(其 去除0-連接f3(l-3)GalNAc-Gal殘基)和神經氨酸苷酶消化表明該批蛋白大致上30%的重量 被糖基化。僅用〇-糖苷酶消化可能僅在去除一些未覆蓋的GalNAC-Gal殘基時有作用。
[0102] 糖基化分析
[0103]為了進一步表征此蛋白，對來自重組潤滑素和正常滑膜潤滑素的0-聚糖進行了質 譜分析和比較。簡言之，使用DEAE色譜從滑液分離了滑膜潤滑素。在轉移至PVDF膜之前，使 用3-8%三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽凝膠通過SDS-PAGE來分離重組和滑膜潤滑素。繼而通過 還原性β-消除隨后清除而從所述潤滑素斑點釋放0-聚糖用于LC-MS/MS分析。在MS/MS分析 前0-聚糖通過多孔石墨化碳色譜來分離，其中是在線性捕獲質譜上以負離子模式使用依賴 于數據的方法(LTQ(Thermo Scientific)) 〇
[0104]重組潤滑素樣品的分析僅鑒別出1型核心0-聚糖結構（圖6)。展示所鑒別的聚糖的 提取的離子色譜在圖7中示出。唾液酸化的結構，[M-H]_675,顯示為兩個主要的峰。它們是 相同的異構體，滯留時間21.4min的第二個峰是β-消除過程中創建的化學衍生物。鑒別出了 3個硫酸化結構（[M-H]-464)的異構體。還鑒別出了單硫酸化單唾液酸化結構的幾個異構 體。二唾液酸化的結構的豐度很低且不能在色譜中觀察到。對所鑒別的每種聚糖的比例的 估計在表1中示出(對于糖結構的關鍵，參見圖6)。此分析組合了表1中每種結構的所有的異 構體、衍生物和加合物。
[0105]表1.在重組潤滑素上所鑒別的每種聚糖的百分比。該數據包括表中所列的每種結 構的所有異構體、衍生物和加合物。
[0107]正常人類滑膜潤滑素具有較大范圍的聚糖延伸至2型核心結構中（圖8)。這些結構 中最富集的在圖9中示出（提取離子色譜上）。
[0108] 重組人潤滑素的糖基化模式與天然人類糖蛋白有很大差異，這可以容易理解，例 如，從圖7與圖9的比較。在天然滑膜潤滑素上，唾液酸化的1型核心結構是最富集的聚糖，但 是存在各種類型的顯著量的2型核心糖基化，以及僅僅少量的硫酸化的多糖。在重組糖蛋白 上，唾液酸化的和未修飾的1型核心構成了聚糖的超過半數，而硫酸化的1型核心結構構成 所鑒別的〇-聚糖的大約三分之一，其中鑒別出了所有三種可能的異構體。
[0109] 重組人潤滑素的物理化學性質 [0110] 類表面活性劑(兩親性)性質
[0111] rhPRG4的一種重要貢獻是其通過物理化學吸附而涂敷生物和非生物表面的能力。 天然PRG4是表面活性的，并且摻入了由大的類粘液素結構域分隔的末端球狀結構域。這些 可以在其結構中分為極性和非極性結構域。中心粘液素結構域(如人類滑液潤滑素的表面 力儀器研究所顯示的），可以折疊回其自身，表明在實現了此種取向時糖基化是朝外的。整 體而言，粘液素結構域變得比其N或C末端都更加親水。其重要性通過了解糖基化的消化回 去除潤滑能力而得以確認(Jay等，J Glycobiol 2001)。此種兩性分子特性也存在于rhPRG4 中。這可以通過對脂和水交界面之間界面張力降低的評估來進行測量。
[0112] 在使用本發明的方法而設計用于測試重組人潤滑素的表面活性劑性質的實驗中， 在PBS溶液中存在濃度增加的rhPRG4(其由未稀釋的、疏水的環己烷所覆蓋）。將置于含有 rhPRG4的水亞相的Du NoUy環向上拉，并記錄了該環突破交界面的臨界張力(fi)。在 Attension Sigma 702ET張力計中對每個濃度收集5次測量。針對fi將rhPRG4濃度的劑量反 應曲線作圖，參見圖10A。如所示，隨著含PBS的水亞相中rhPRG4濃度的提高，界面張力降低。 [0113]因為重組人潤滑素溶液含有殘留的非離子表面活性劑(Tween 20)，重復了該實驗 以研究這是否是造成添加重組產物后所誘導的表面張力大幅下降的原因，首先僅使用各種 濃度的表面活性劑，繼而使用很低濃度的本發明的rhPRG4。將微升量的表面活性劑和PRG4 添加至15mL的水亞相。結果顯示于圖10B和圖10C中。如所示，僅用PRG4(圖10C)降低表面張 力比僅用商業表面活性劑要好〇 . 1 % (圖10B)。因而，含有0.1 % Tween和不含有Tween的 rhPRG4降低的PBS和環己烷的界面張力比僅用0.1 %的Tween更多（所有的都具有相同量的 添加的感興趣溶液）。
[0114] 這些數據顯示，即便是在很低的濃度，rhPRG4優先位于水脂交界面，降低界面張 力。此現象概括了在減少摩擦以及模擬天然潤滑素行為時所需的表面結合相互作用。另外， 減少界面張力的活性可以用作rhPRG4生產的質量控制程序。
[0115] 潤滑性質
[0116] 軟骨潤滑
[0117] 從骨骼成熟的牛后膝滑膜關節的髕股溝，準備了新鮮的軟骨樣品（n=16)用于摩 擦測試（如此前所述的）。簡言之，從軟骨區塊收獲了內核（半徑= 6mm)和外環（外半徑= 3.2mm以及內半徑=1.5mm)，二者均具有中央孔(半徑=0.5mm)使得流體可以泄壓。在PBS中 于4°C將樣品嚴格清洗過夜以去除關節表面的殘余滑液，并通過測試潤滑的存在而對其進 行了確認。繼而將樣品在具有蛋白酶抑制劑的中于-80 °C冷凍，解凍，再在roS中搖動過 夜以進一步清除表面處的任何殘余PRG4。繼而在第二天的測試前，將樣品于4°C完全浸入大 約0.3ml的各個測試潤滑劑(下文所述)過夜，并在下次測試潤滑劑中溫育前，于每次測試后 再用PBS清洗。
[0118] 使用了BoseElectroforce'、的測試儀器（ELF 3200，Eden Prairie,Minnesota)來 分析每種PRG4形式以及對照的界面潤滑能力，其中使用已經確立的軟骨-對-軟骨摩擦測 試。簡言之，將所有樣品以0.002mm/s的恒定速率壓至18 %的總軟骨厚度，并允許其應力松 弛40分鐘以使組織液泄壓。繼而將樣品以已知的有效速度旋轉以在泄壓的軟骨-軟骨交界 面保持界面模式潤滑(〇.3mm/s)( ±2運轉(revolutions))。在留在預滑動的1200、120、12和 1.2秒的靜止期之后，在每個隨后的靜止期之后旋轉樣品，+/-2運轉。以相反的旋轉方向重 復測試順序，_/+2運轉。
[0119] 兩個測試順序評估了 rhPRG4的軟骨界面潤滑能力（單獨以及與HA組合）。在兩個測 試順序中，PBS都用作陰性對照潤滑劑而牛滑液用作陽性對照潤滑劑。rhPRG4和純化的天然 牛PRG4都在PBS中以450yg/mL的濃度制備，而HA( 1 · 5MDA Lif ecore Biomedical，Chaska， 麗)也在1?S中以3 · 3 3mg/mL的生理濃度制備。潤滑劑以推測的潤滑能力次序（摩擦系數降 序）來進行了測試。在測試順序1中，rhPRG4vs. nbPRG4，順序為PBS、rhPRG4、nbPRG4、滑液(η =7);在順序2 中，rhPRG4vs · rhPRG4+HA，順序為PBS、rhPRG4、rhPRG4+HA、滑液(η = 4)。
[0120] 對于此前所描述的每個潤滑劑，計算了兩個摩擦系數;靜態的(μ觀?,ΝμΚ從靜止狀 起始運動的阻力)和動態的施，Neq>)(穩定滑動的阻力）。結果在圖11和12中示出。數據以 均值土 SEM給出。使用了 AN0VA來評估潤滑劑的作用以及預滑動靜止期作為μ縮、Neq和<μ5施， Neq>的重復因素，其中在1.2s的預滑動靜止期對<μ5施，Neq>進行Tukey事后測試。用Systatl2 (Systat Software, Inc.，Richmond，CA)進行了統計學分析。
[0121] 如圖11中所示，所測量的重組PRG4的潤滑性質、動態摩擦系數，與天然牛PRG4稍低 的值之間沒有統計學顯著性。如圖12中所示，與僅有rhPRG4相比，rhPRG4與HA組合改善了靜 態（圖12A)和動態（圖12B)潤滑性。所有的測定都在PBS中最高而在牛滑液中最低，且rh-PRG4與rhPRG4+HA為中等。rhPRG4+HA的混合溶液趨向于比僅有rhPRG4顯著更低的摩擦系數 (p = 0.075)并且在統計學上與牛滑液類似(0.021 ±0.001，p = 0.20)。
[0122] 也嘗試了使用2小時的透明質酸酶消化來確保從要用作軸承(bearings)的牛軟骨 去除天然潤滑素。透明質酸酶消化是要用于從軟骨外植體的淺表層去除天然PRG4(P〈 0.050)。此種處理去除了表面PRG4而未顯著影響關節軟骨的機械特征。將rhPRG4應用于這 些表面并比較對BSF和PBS對照的摩擦反應，這顯示出使用本發明的rhPRG4可以重建低COF。 圖13顯示經透明質酸酶處理的牛內髁軟骨外植體(具有rhPRG4)的COF值，BSF和PBS作為居 間潤滑劑。根據上文所述的方案依照前述潤滑劑測試了軟骨外植體。如所示，重組類人PRG4 重建了低C0F(rhPRG4N = 18 ;BSF N=6 ;PBS(N=8)。
[0123] 眼睛表面潤滑
[0124] 具有3mm的鞏膜的正常人類眼角膜得自Southern Alberta Lions Eye Bank。人類 眼瞼從來自卡爾加里大學的遺體捐贈項目的新鮮尸體獲得。這些組織的使用許可以及批準 從Health Research Ethics Board獲得。將眼角膜(n = 6)儲存在4°C的基于硫酸軟骨素的 眼角膜儲存介質(Optisol-GS)中并在兩周內使用。眼瞼(n = 6)被冷凍并在使用時解凍。
[0125] 通過3-8%的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽NUPAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電 泳評估所述rhPRG4種類的純度為50%。對富集的rhPRG4制品的濃度進行了測定并調整為將 純度水平納入考量。
[0126] 將組織樣品裝載于具有軸向和旋轉執行器、以及軸向載荷和扭矩傳感器的Bose ELF3200上。通過向鞏膜應用腈基丙烯酸酯粘合劑(強力膠），而將切片的眼角膜固定在半球 形硅橡膠塞(半徑= 6mm)的末端。在眼角膜-塞裝置周圍安置硅橡膠管套，其用于保持住潤 滑劑流體。繼而將此裝置附著至所述Bose ELF3200的旋轉執行器，由此形成底部關節連接 表面。從模型]^MS材料（~0.4mm厚的UntrSylgard 184，Dow Corning,)或者人眼瞼組織鉆 出了外環(外半徑=3.2_，內半徑=1.5mm)，并粘合至外環支持物。繼而將此外環支持物附 著至線性執行器，由此形成上部關節連接表面。
[0127] 在裝載完樣品之后，將0.3ml的測試潤滑劑置于眼角膜上以形成潤滑劑浴，并且用 測試潤滑劑將關節連接表面平衡至少5分鐘。將所述組織樣品于三個人工確定的軸向位置 與相應的0.3±0.02、0.5±0.03、和0.7±0.03_勺軸向載荷接觸，導致軸向壓力范圍在12.2 至28.5kPa(基于24.6mm 2的接觸面積。一旦在給定軸向位置接觸，所述樣品在兩個方向都以 4個不同的有效速度(veff = 30、10、l .0、0.3mm/s)進行4次運轉，其中veff= ω · reff以及reff = 2/3[0-03-η3)/0-02-η2)]。在旋轉期間于20Hz收集了軸向載荷以及力矩。每次運轉之間 有12秒的保壓時間。每個測試順序(下文所述)包括了預處理步驟，其中所述組織在鹽水浴 中進行所述的測試方案。
[0128] 為了確定rhPRG4制品在人類眼角膜-眼瞼（測試1)和在人類眼角膜-聚二甲硅氧烷 (PDMS，測試2)的交界面處的界面潤滑能力，使用了如下測試順序:鹽水中300yg/mL的PRG4， 鹽水中300yg/mL的rhPRG4,接著鹽水（Sensitive Eyes Saline Plus,Bausch&Lomb)〇
[0129] 為了評估測試潤滑劑在該兩個交界面處的效力，計算了靜態和動態的摩擦系數。 如圖14中所示，PRG4和PRG4,二者都顯著地且類似地，在人類眼角膜-PDMS交界面處(參見圖 14C和14D)和在眼角膜眼瞼交界面處（圖14A和14B)降低了摩擦。
【主權項】
1. 制備重組潤滑素糖蛋白的方法，包括以下步驟： 在培養基中培養中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，所述中國倉鼠卵巢(CHO)細胞轉染有人類 PRG4基因，并且其在足以產生潤滑素糖蛋白的時間里和培養條件下表達所述人類PRG4基因 并對表達產物進行翻譯后糖基化，其中所產生的潤滑素糖蛋白包含至少30%重量的糖苷殘 基，在培養基中濃度為至少〇. 4g/升，和 從所述培養基純化潤滑素糖蛋白。2. 權利要求1的方法，其中所述CHO細胞是包含編碼人類PRG4基因的核酸的CHO-M細胞。3. 權利要求1或2的方法，其中所述CHO細胞轉染有第一載體和第二載體，其中所述第一 載體包含編碼染色質元件的核酸，而所述第二載體包含編碼人類PRG4基因的核酸。4. 權利要求3的方法，其中所述染色質元件是邊界元件、基質附著區、基因座控制區或 通用染色質開放元件。5. 權利要求4的方法，其中所述染色質元件是基質附著區。6. 權利要求1-5任一項的方法，其中在足以產生這樣的潤滑素糖蛋白的時間里和培養 條件下培養所述細胞，所述潤滑素糖蛋白在培養基中濃度為至少〇. 5g/升。7. 權利要求1-5任一項的方法，其中在足以產生這樣的潤滑素糖蛋白的時間里和培養 條件下培養所述細胞，所述潤滑素糖蛋白在培養基中濃度為至少〇. Sg/升。8. 權利要求1-5任一項的方法，其中在足以產生這樣的潤滑素糖蛋白的時間里和培養 條件下培養所述細胞，所述潤滑素糖蛋白在培養基中濃度為至少1.0 g/升。9. 權利要求1-5任一項的方法，其中在足以產生這樣的潤滑素糖蛋白的時間里和培養 條件下培養所述細胞，所述潤滑素糖蛋白在培養基中濃度為至少2. Og/升。10. 權利要求1-9任一項的方法，其中至少95%重量的所述潤滑素糖蛋白的糖基化是1 型核心糖基化。11. 權利要求1-9任一項的方法，其中至少99%重量的所述潤滑素糖蛋白的糖基化是1 型核心糖基化。12. 權利要求1-11任一項的方法，其中與天然人類潤滑素相比，所述糖苷殘基富含硫酸 化的糖側鏈。13. 權利要求1-12任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含這樣的多聚體蛋白，其所 產生的在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的靜態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素靜態摩 擦系數的150 %。14. 權利要求1-12任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含這樣的多聚體蛋白，其所 產生的在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的靜態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素靜態摩 擦系數的120 %。15. 權利要求1-12任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含這樣的多聚體蛋白，其所 產生的在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的靜態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素靜態摩 擦系數的110 %。16. 權利要求1-15任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含從所述培養基中共純化 的并且混雜有多聚體潤滑素種類的單體潤滑素種類。17. 權利要求13-15任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含二聚體潤滑素種類。18. 權利要求1-17任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含至少5個經二硫鍵或者經 非共價連結的個體糖基化氨基酸鏈，并且具有至少1200kDa的分子量。19. 權利要求1-18任一項的方法，其中所述細胞在至少10、50、或100升的培養基中培 養。20. 權利要求1-19任一項的方法，其中所述潤滑素糖蛋白包含至少35 %重量的糖苷殘 基。21. 由權利要求1-20任一項的方法所生產的潤滑素糖蛋白。22. 物質的組合物，其包含： 在宿主細胞培養中從人類PRG4基因表達的重組多聚體潤滑素糖蛋白，其包含至少30% 重量的糖苷殘基，并且其所產生的在軟骨對軟骨摩擦測試中測量的動態摩擦系數不超過純 化的天然牛潤滑素的動態摩擦系數的150%。23. 權利要求22的組合物，其中所述潤滑素糖蛋白特征在于，其所產生的在軟骨對軟骨 摩擦測試中測量的動態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素的動態摩擦系數的120%。24. 權利要求22的組合物，其中所述潤滑素糖蛋白特征在于，其所產生的在軟骨對軟骨 摩擦測試中測量的動態摩擦系數不超過純化的天然牛潤滑素的動態摩擦系數的110%。25. 權利要求22-24任一項的組合物，其中所述潤滑素糖蛋白包含至少35%重量的糖苷 殘基。26. 權利要求22-24任一項的組合物，其中所述潤滑素糖蛋白包含至少40 %重量的糖苷 殘基。27. 權利要求22-26任一項的組合物，其中所述潤滑素糖蛋白的至少99%重量的糖基化 為1型核心糖基化。28. 權利要求22-27任一項的組合物，其中與天然人類潤滑素相比，所述糖苷殘基富含 硫酸化的糖側鏈。29. 權利要求22-28任一項的組合物，還包含混雜有多聚體潤滑素種類的單體潤滑素種 類。30. 權利要求22-29任一項的組合物，包含二聚體潤滑素種類。31. 權利要求22-30任一項的組合物，其包含這樣的潤滑素種類，所述潤滑素種類包含 至少5個經二硫鍵或者經非共價連結的個體糖基化氨基酸鏈，具有至少1200kDa的分子量。32. 權利要求22-31任一項的組合物，還包含與所述潤滑素糖蛋白混雜的透明質酸或其 鹽。33. 權利要求22-32任一項的組合物，用于制備藥物，所述藥物用于通過粘彈性物補充 療法治療滑膜關節。34. 權利要求22-32任一項的組合物，用于制備局部應用于組織表面的藥物。35. 權利要求22-32任一項的組合物，用于制備治療干眼病的藥物。36. 權利要求22-32任一項的組合物，用于制備藥物，所述藥物用于在手術期間應用于 體表以抑制隨后形成粘連或纖維性結締組織。37. 權利要求22-32任一項的組合物，用于制備藥物，所述藥物用于全身性注射以抑制 細胞-細胞粘連或者在脈管內的運動。38. 包含溶液的組合物，所述溶液包含100g的人類潤滑素，其中所述潤滑素包含糖基 化，所述糖基化的至少99 %重量為1型核心糖基化。39. 權利要求38的組合物，其中所述人類潤滑素是重組人類潤滑素。40. 權利要求38或39的組合物，其中所述溶液中潤滑素的濃度為至少0.5g/L。
【文檔編號】C07K14/47GK105899527SQ201480065482
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月22日
【發明人】T·施密特, G·D·杰伊
【申請人】盧布里斯有限責任公司