一種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量pcr的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測試劑盒，屬于分子生物學領域。本發明的檢測引物、探針和檢測試劑盒，利用鎖核酸的特點，設計含有鎖核酸的特異性探針，該探針對DNA有強大的識別能力和強大的親和力，從而能夠很好的適用于對病毒含量低、病毒基因組GC含量高的豬偽狂犬病毒進行檢測，提高了豬偽狂犬病毒野毒株檢測的效率，檢索漏檢的概率降低，為豬偽狂犬病毒野毒株檢測提供了一種新的檢測方法和檢測試劑。本發明的探針、引物和試劑盒，與現有的常規檢測方法相比，具有特異性強、靈敏度高、操作方便等優點，特別適用于臨床豬偽狂犬病毒野毒株的檢測，也可用于科研及臨床應用，且具有很好的商業應用價值。
【專利說明】
一種鎖核酸増敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測 試劑盒
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種鎖核酸(LNA)增敏的豬偽狂犬病毒野 毒株熒光定量PCR的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是在世界范圍內導致豬群發生嚴重性 疾病并產生重大經濟損失的病原之一。豬偽狂犬病毒是一種高度親和神經性病毒，可引起 仔豬神經癥狀甚至死亡、嚴重的呼吸道疾病及母豬繁殖障礙，具有傳播速度快、流行范圍 廣、死亡率高等特點。該病毒除感染豬外，還可感染牛、羊、狗、鼠等動物。
[0003] 豬偽狂犬病毒又名豬皰疹病毒I型，屬于皰疹病毒甲亞科水痘皰疹病毒屬。豬偽狂 犬病毒基因組為線狀雙鏈DNA結構，基因組全長約150kb，基因組GC含量高達74%，至少含有 70個基因，編碼約100種蛋白質，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質。豬偽狂犬病毒基因組 編碼16種囊膜蛋白，包含11種糖基蛋白（gB，gC，gD，gE，gH，gI，gK，gL，gM，gN，gG)還有其余4 個非糖基化的跨膜蛋白（UL20，UL43，US9，UL24)。其中gE基因是豬偽狂犬病毒的主要毒力相 關基因，也是豬偽狂犬病毒復制非必需的基因。缺失gE基因后，豬偽狂犬病毒毒力明顯減 弱，但其抗原性不受影響，為基因缺失疫苗的研制及應用提供了可靠保障。我國普遍推廣使 用的豬偽狂犬病毒gE基因缺失疫苗，對預防和控制豬偽狂犬病起到了重要作用。但自從 2011年以來全國多個省份使用gE基因缺失活疫苗免疫的規模化豬場出現了母豬產弱仔、死 胎、流產，仔豬神經癥狀及死亡等疑似偽狂犬病的臨床癥狀并造成了嚴重的經濟損失。發病 仔豬腦組織病毒分離鑒定結果顯示為豬偽狂犬病毒，全基因組測序及分析結果顯示，病毒 基因組序列已發生較多變異，包括堿基的插入、缺失及突變，且目前臨床檢測中面臨偽狂犬 病發病率高但病原檢出率低的困擾，給該病的防控增加了前所未有的難度。急需建立新的 靈敏度更高、特異性更強的野毒鑒定方法，應對病原不斷變異帶來的檢測不確定性，及時、 準確淘汰野毒感染豬，有利于偽狂犬病凈化。
[0004] 目前豬偽狂犬病毒野毒株的檢測方法有針對gE基因的乳膠凝集、ELISA及膠體金 免疫層析等血清學方法;也有針對gE基因的常規PCR檢測及定量PCR檢測等方法。但這些方 法均存在一定的缺陷性，血清學方法雖然能有效區分野毒感染抗體和疫苗免疫抗體，但由 于病毒感染早期和潛伏感染期不產生抗體，因此無法做到早發現，而PCR檢測方法仍然存在 靈敏度不夠，檢出率低的缺陷，對實際生產的指導意義不夠。因此，建立一種靈敏度更高、準 確性更好的定量PCR診斷方法已迫在眉睫。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種鎖核酸增敏的 豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測引物和探針。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR 的檢測試劑盒。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0008] -種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測引物和探針，包括用于 檢測的1組引物和1條LNA-Taqman探針；
[0009] 所述的1組引物為：
[0010]正向引物：5/-ccgaggacgagttcagcag-3'; (SEQ ID NO: 1)
[0011]反向引物：5'-ccattcgtcacttccggtt-3'; (SEQ ID N0:2)
[0012] 所述的LNA-Taqman探針由Y端帶有的焚光物質，LNA-Taqman探針的序列和Y端帶 有的淬滅物質組成；
[0013]所述的5'端帶有的熒光物質優選為FAM;
[0014]所述的3'端帶有的淬滅物質優選為BHQ1;
[0015] 所述的1條LNA-Taqman探針的序列如下：
[0016] LNA-TagMan熒光探針：5/-FAM-cgctccggctTCGacgtc-BHQl-3 /。（SEQIDN0:3) [0017]其中，引物用來檢測豬偽狂犬病毒野毒株基因 gE;
[0018]其中，LNA-Taqman探針是用來檢測豬偽狂犬病毒野毒株基因 gE的探針。
[0019] LNA-Taqman探針所示序列的探針中，第11位的堿基"T"、第12位的堿基"C"和第13 位的堿基"G"均為鎖核酸。
[0020] 本發明的再一方面公開了一種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的 檢測試劑盒，包括本發明的探針試劑、引物試劑和陽性對照樣品。
[0021] 所述的陽性對照樣品為包含所述豬偽狂犬病毒野毒株gE基因片段的質粒DNA。
[0022] 所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測試劑盒適用于各種 組織、細胞及血清中的豬偽狂犬病毒野毒株核酸的定量檢測。
[0023]所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測試劑盒在豬偽狂犬 病毒野毒株的檢測、豬偽狂犬病的診斷治療方面的應用。
[0024] -種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：
[0025] (1)熒光定量核酸擴增反應體系的配制：在反應管中加入正向引物、反向引物和 LNA-TagMan熒光探針、模板DNA、2XPremix Ex Tag PCR反應混合液，增加 ddH20至反應體系 為20yL，混合均勻；
[0026] (2)熒光定量核酸擴增:將所述步驟（1)得到的混合溶液置于熒光定量檢測儀上進 行反應；
[0027] (3)反應結束后，將模板DNA的循環閾值Ct與標準曲線對照，得到模板DNA中豬偽狂 犬病毒野毒株基因片段拷貝的濃度。
[0028]步驟(2)中所述的反應的條件為95 °C 10分鐘；熱循環為95 °C 15秒，60 °C 1分鐘，40個 循環。
[0029]本發明豬偽狂犬病野毒的引物、探針和試劑盒是基于豬偽狂犬病毒野毒株gE基因 的特點而設計的，目前在豬偽狂犬病毒的檢測中面臨兩大難題。第一、病毒早期和潛伏期感 染病毒含量低，第二、病毒基因組GC含量太高;而現有檢測方法的檢測靈敏度和檢測效率不 高。本發明的檢測方法以實時熒光PCR為基礎，采用特殊結構的含有鎖核酸的探針對豬偽狂 犬病毒野毒株gE基因進行檢測，使得整個檢測靶標片段可以大大的縮短，同時增加與靶標 序列的識別能力和親和能力。需要說明的是，本發明的一個關鍵因素就是采用了特殊結構 的含有鎖核酸的探針。
[0030] 本發明中的含有鎖核酸的探針，又稱為LNA探針。LNA(Locked Nucleic Acid)是一 種核酸類似物，它和普通核酸分子區別在于在其堿基碳環的2'氧原子和V碳原子位置有亞 甲基橋而成鎖狀結構，因此也稱鎖核酸。LNA鎖核酸共有A，C，G，T，U，mC六種堿基，它們均可 以引入實時熒光TagMan探針。引入LNA堿基的TagMan探針既為LNA-TagMan探針，即LNA探針。 每引入一個LNA堿基可提高探針TM值3~8攝氏度，這樣既可縮短探針的長度，又可大大增加 探針的靈敏度和穩定性，從而使檢測信號增強、信噪比增大。本發明正是利用該特性，設計 了合適的特異性探針和引物。
[0031] 需要說明的是，在本發明的引物和探針的基礎上，將引物或探針凍干制成粉劑或 者直接制成高濃度的溶液從而制成便于使用的試劑盒是容易做到的，比如本領域中，為了 使引物能夠長期保存并便于運輸經常會將其制成粉劑，在使用時加入滅菌蒸餾水或者實驗 室常規使用的TE緩沖液即可。
[0032]本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0033]本發明的豬偽狂犬病毒野毒株的檢測引物、探針和檢測試劑盒，利用鎖核酸的特 點，設計含有鎖核酸的特異性探針，該探針對DNA有強大的識別能力和強大的親和力，從而 能夠很好的適用于對病毒含量低、病毒基因組GC含量高的豬偽狂犬病毒進行檢測，提高了 豬偽狂犬病毒野毒株檢測的效率，檢索漏檢的概率降低，為豬偽狂犬病毒野毒株檢測提供 了一種新的檢測方法和檢測試劑。本發明的探針、引物和試劑盒，與現有的常規檢測方法相 比，具有特異性強、靈敏度高、操作方便等優點，特別適用于臨床豬偽狂犬病毒野毒株的檢 測，也可用于科研及臨床應用，且具有很好的商業應用價值。
【附圖說明】
[0034]圖1是本發明實施例中常規的實時熒光PCR檢測方法和本發明的檢測方法的對比 結果圖；其中，A為本發明的檢測方法的檢測結果，B為常規實時熒光PCR檢測結果。
[0035]圖2是本發明實施例中的引物和探針的特異性檢測結果;其中，曲線1為PRV野毒株 陽性樣品的擴增曲線；曲線2-6分別為豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒、豬瘟病毒、豬 偽狂犬病疫苗和陰性對照的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0036]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0037] 實施例1 [0038] -、試劑和儀器
[0039] 1、主要試劑
[0040] 2XPremix Ex Tag(Probe qPCR)可通過市售購買。本例所用的試劑為分析純或生 化試劑，實驗用水符合GB/T6682中一級水的規格。所有試劑均無 DNA酶污染的容器分裝。 [0041 ] 2.主要儀器
[0042]實時熒光PCR儀、離心機、微量移液器、冰箱、高壓滅菌器、紫外分光光度計。
[0043]二、供試樣品
[0044] 豬偽狂犬病毒野毒株標準品，在中國專利申請"申請號：201410217702.5、名稱為 豬偽狂犬病毒野毒株的熒光定量PCR檢測引物、探針和試劑盒"中公開。
[0045]三、樣品制備
[0046] 1、提取待測樣品的DNA模板，按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Ki t Ver. 4.0的說明書進行樣品中DNA的提取。
[0047] 2、DNA濃度測定:使用Biodropsis的BD-2000超微量紫外分光光度計測定DNA濃度。 [0048]四、引物和探針設計
[0049] 針對Genbank公布的豬偽狂犬病毒gE基因序列設計特異性檢測引物和探針，并且 通過引物合成公司合成引物和探針，其中，探針中根據檢測要求設計若干鎖核酸，引物、探 針及探針中的鎖核酸具體情況如表1。同時，本例還合成了不含有鎖核酸的如表1所示的探 針，即表1中所示的探針按照常規的方法合成，其中不含有鎖核酸，以作為對比。
[0050] 表lgE基因檢測引物和探針
[0051]
[0052] 注：其中"正"表示正向引物，"反"表示反向引物，"探針"即實時熒光PCR檢測用的 探針，各探針序列中的大寫字母表示該堿基為鎖核酸。
[0053] 五、檢測步驟
[0054] 1、熒光PCR反應體系
[0055] 實時熒光PCR反應體系見表2。
[0056] 表2實時熒光PCR反應體系
[0058] 2、熒光PCR反應參數
[0059] 置于LightCycler96(Roche)定量PCR儀上進行擴增，實時熒光PCR反應條件為:95 °C 10分鐘;熱循環為95 °C 15秒，60 °C 1分鐘，40個循環；
[0060] 3、實時熒光PCR擴增
[0061] (1)樣品設置
[0062] 每個樣品設置三個平行的反應體系。檢測過程中分別設立陽性對照和陰性對照。
[0063] 以上檢測，均采用本例設計的引物和含有鎖核酸的探針，以及本例的引物與不含 鎖核酸的探針進行比對試驗。
[0064] (2)特異性檢測
[0065]分別采用本例設計的引物和探針，以陽性病料研磨液作為陽性對照，水作為陰性 對照，分別對豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、豬痕病毒（Classical Swine fever Virus，CSFV)和豬偽狂犬病疫苗4種病毒的核酸樣品進行檢測。豬圓環病毒為陽性病料，豬 繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒均采購自市場上的商品化疫苗，其中豬 繁殖與呼吸綜合征病毒為大華農JXA1-R疫苗，豬瘟病毒為廣東永順C-株細胞疫苗毒，豬偽 狂犬病毒為大華農Barhta-K61(偽蘭威）疫苗。上述材料均在中國專利申請"申請號： 201410217702.5、名稱為豬偽狂犬病毒野毒株的熒光定量PCR檢測引物、探針和試劑盒"中 公開。
[0066] (3)靈敏度檢測
[0067]分別取豬偽狂犬病毒野毒株DNA 10ng、l .0ng、100pg、10pg、lpg、0. lpg和 10fg，進 行靈敏度檢測。
[0068] (4)臨床樣品檢測
[0069]取疑似感染PRV的豬的腦、肺和脾等組織樣品，從樣品中提取DNA，按TAKARA的 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的說明書進行樣品中DNA的提取，進行 檢測。
[0070] 六、檢測結果
[0071] 1、含鎖核酸和不含鎖核酸的探針的檢測結果對比
[0072] 本例設計的探針序列在合成時，分別合成了含有鎖核酸和不含鎖核酸的探針。然 后分別采用這兩組探針對不同的樣品進行檢測。具體，采用含鎖核酸和不含鎖核酸的探針， 對豬偽狂犬病野毒基因組DNA中的gE基因進行檢測，檢測的體系和條件均相同。
[0073] 部分檢測結果見表3,部分擴增圖譜見圖1。結果顯示，含鎖核酸的探針的Ct值最多 可提前近4個循環，即其靈敏度至少可提高10倍。
[0074] 表3兩種TagMan探針Ct值的比對
[0076] 2、特異性檢測
[0077] 采用本例的引物和含有鎖核酸的探針，對供試樣品進行檢測，結果顯示，只有陽性 對照有擴增，而其他病毒豬圓環病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬疫苗 毒和陰性對照均沒有擴增，即沒有Ct值，在圖譜上也沒有峰值(圖2)。
[0078] 可見，本例的檢測方法以及檢測引物和含鎖核酸的探針具有較好的特異性，能夠 特異擴增出靶標序列，而對其他不含靶標序列的樣品沒有非特異擴增。
[0079] 3、靈敏度檢測
[0080] 樣品DNA濃度為10f g時，LNA探針的陽性檢出次數為4次(33 % )，而普通TagMan探針 的檢測次數為0;樣品DNA濃度為0.10pg時，LNA探針的陽性檢出次數為12次(100 % )，而普通 TagMan探針的檢測次數為0;樣品DNA濃度為l.Opg時，LNA探針和普通TagMan探針的檢測次 數均為12次（100%)。因此，LNA探針的最低檢測濃度為O.lOpg，而普通TagMan探針的最低檢 測濃度為l.Opg (表4)。
[0081] 以上靈敏度檢測，采用含鎖核酸和不含鎖核酸的探針，對豬偽狂犬病毒野毒株基 因組DNA中的gE基因進行檢測，檢測的體系和條件均相同，檢測重復12次。
[0082] 表4兩種TagMan探針擴增陽性數比對
[0083]
[0084] 4、臨床樣品檢測
[0085]分別采用含鎖核酸和不含鎖核酸的探針，對臨床87份樣品DNA進行檢測，檢測的體 系和條件均相同。
[0086]結果顯示，不含鎖核酸的探針共檢測獲得陽性臨床樣品47份，陽性率54.02%;含 鎖核酸的探針檢測獲得陽性臨床樣品55份，陽性率達63.22%，含鎖核酸的探針提高了臨床 樣品的檢出率(表5)。
[0087] 表5兩種TagMan探針臨床樣品檢測結果
[0089] 從上面的實驗表明，本發明豬偽狂犬病毒野毒株鎖核酸探針熒光定量PCR檢測試 劑盒，可以用于科研及臨床應用，達到靈敏、快速準確地檢測豬偽狂犬病毒野毒株。
[0090] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測引物和探針，其特征在于： 包括用于檢測的1組引物和1條LNA-Taqman探針； 所述的1組引物為： 反向引物：5' -ccattcgtcacttccggtt-3'; 所述的LNA-Taqman探針由5'端帶有的熒光物質，LNA-Taqman探針的序列和3'端帶有的 淬滅物質組成。2. 根據權利要求1所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測引物和 探針，其特征在于:所述的5'端帶有的熒光物質為FAM。3. 根據權利要求1所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測引物和 探針，其特征在于:所述的3'端帶有的淬滅物質為BHQl。4. 根據權利要求1所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測引物和 探針，其特征在于:所述的1條LNA-Taqman探針的序列如下： LNA-TagMan探針：5' -FAM-cgctccggctTCGacgtc-BHQl-3'; LNA-Taqman探針所示序列的探針中，第11位的堿基"T"、第12位的堿基"C"和第13位的 堿基"G"均為鎖核酸。5. -種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測試劑盒，其特征在于:包 括權利要求1~4任一項所述的引物和探針。6. 根據權利要求5所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測試劑 盒，其特征在于:還包括陽性對照樣品。7. 根據權利要求6所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測試劑 盒，其特征在于:所述的陽性對照樣品為包含所述豬偽狂犬病毒野毒株gE基因片段的質粒 DNA08. 權利要求5~7任一項所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測 試劑盒的應用，其特征在于:所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR的檢測 試劑盒適用于各種組織、細胞及血清中的豬偽狂犬病毒野毒株核酸的定量檢測。9. 一種鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測方法，其特征在于包括如 下步驟： (1) 熒光定量核酸擴增反應體系的配制：在反應管中加入正向引物、反向引物和LNA-TagMan熒光探針、模板DNA、2 XPremix Ex Tag PCR反應混合液，增加 CldH2O至反應體系為20 yL，混合均勻； (2) 熒光定量核酸擴增:將所述步驟（1)得到的混合溶液置于熒光定量檢測儀上進行反 應； (3) 反應結束后，將模板DNA的循環閾值Ct與標準曲線對照，得到模板DNA中豬偽狂犬病 毒野毒株基因片段拷貝的濃度。10. 根據權利要求9所述的鎖核酸增敏的豬偽狂犬病毒野毒株熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于:步驟(2)中所述的反應的條件為95°C 10分鐘；熱循環為95°C 15秒，60°C 1分鐘， 40個循環。
【文檔編號】C12N15/11GK105886663SQ201610272623
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月26日
【發明人】李艷, 李春玲, 蔡汝健, 蔣智勇
【申請人】廣東省農業科學院動物衛生研究所