一種用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重pcr引物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，本發明根據NCBI (National Center for Biotechnology Information）數據庫中鴨疫里默氏菌CH3株全基因序列，對該菌的TonB依賴受體（TbdR1）、OmpA、TonB1蛋白、TonB2蛋白和載鐵體相互作用蛋白（SIP）等毒力基因的保守序列進行引物設計，于國內外率先建立鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，該方法靈敏度高、特異性強，最低可檢測169pg的核酸。
【專利說明】
一種用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物
技術領域
[0001]本發明涉及一種用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，屬于獸醫傳染病學領域。
【背景技術】
[0002]鴨疫里默氏菌(RiemereI la anatipestifer，RA)是能引起雛鴨急性或慢性、敗血性傳染病的病原，主要侵害2-7周齡各品種雛鴨。通常將該病原引起的疾病稱為鴨疫里默氏菌感染或者鴨傳染性漿膜炎，該病的特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎及腦膜炎，其發病率為5 %-90 %不等，病死率高達80 %。目前該病已成為危害養全世界養鴨業的一種主要疾病。
[0003]鴨疫里默氏菌為革蘭氏陰性桿菌，無運動性、不形成芽孢。目前報道的鴨疫里默氏桿菌的毒力因子有鐵載體相互作用蛋白(SIP)(Tu J, Lu F，Miao S，Ni X，Jiang P, Yu
H,Xing L, Yu S， Ding C， Hu Q.The siderophore—interacting protein is involvedin iron acquisit1n and virulence of Riemerella anatipestifer strain CH3.VetMicrob1l.2014.168(2-4):395-402.)、0mpA(Qinghai Hu , Xiangan Han, Xiaoj inZhou, Chan Ding, Yinyu Zhu, Shengqing Yu.0mpA is a virulence factor ofRiemerella anatipestifer.Veterinary Microb1logy.2011.150:278_283)、TonBl和TonB2蛋白(Miao S, Xing L, Qi J, Yu H, Jiang P, Sun B, Cui J, Ou C, Hu Q.Roles of the TonBl and TonB2 proteins in haemin iron acquisit1n andvirulence in Riemerella anatipestifer.Microb1logy.2015.161(8):1592-9)、TonB依賴受體(TbdRl)(Lu F, Miao S, Tu J, Ni X，Xing L, Yu H, Pan L, Hu Q.The roleof TonB-dependent receptor TbdRl in Riemerella anatipestifer in ironacquisit1n and virulence.Vet Microb1l.2013.167(3-4): 713-8.)等，明確RA的毒力因子是闡明RA致病復雜性的關鍵環節，而疾病的發生通常是由多種毒力因子的相互作用而引起的，鑒于此，本發明建立了鴨疫里默氏菌主要毒力因子多重PCR方法，旨在快速檢測該菌的毒力基因，彌補單基因PCR檢測方法的不足，該法還可應用于該菌的診斷及分子流行病學的調查，對于鴨疫里默氏菌中毒力基因的監測及分布情況具有重要的生物學意義。本發明的建立可填補國內外相關領域空白。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物。
[0005]為達到上述目的，本發明采用以下技術方案:
一種用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，其特征在于，所述引物序列如下:
第一組:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’，
TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’；第二組:OmpA-Fl: 5’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3’，
OmpA-Rl: 5，CTAAAGCAGCTACTACAGA 3 ’.；
第三組:TonBl-Fl:5’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3’，
TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’；
第四組:TonB2-Fl: 5’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3’，
TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’；
第五組:SIP-Fl:5’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3’，
SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’。
[0006]所述5組引物根據各毒力基因的保守序列來設計合適大小的片段，分別用于檢測鴨疫里默氏菌五個主要的毒力因子。該引物組合不僅能準確地檢測出相應的毒力因子，還能根據片段大小來判別毒力因子。
[0007]所述5組引物主要用來檢測鴨疫里默氏菌五個主要的毒力因子。第一組引物所擴增的產物為TonB依賴受體(TbdRl)，片段大小為1179 bp;第二組引物所擴增的產物為外膜蛋白A(OmpA)基因，片段大小為843 bp;第三組引物所擴增的產物為TonBl蛋白基因，片段大小為723 bp;第四組引物所擴增的產物為TonB2蛋白基因，片段大小576 bp;第五組引物所擴增的產物為載鐵體相互作用蛋白(SIP)基因，片段大小為315 bp ο
[0008]利用本發明的引物可用于對鴨疫里默氏菌主要毒力因子進行檢測，通過對反應體系和反應條件的各種優化，建立一套可用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR方法。
[0009]具體操作方法如下:
1、引物設計
參考鴨疫里默氏菌CH3株五個毒力基因的核苷酸序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar軟件進行同源性分析比較，利用Oligo 7.0軟件，分別在保守區設計引物，并采用BLAST工具進行檢索，驗證其特異性。
[0010]2、反應體系的優化
優化出的25 yL最佳反應體系為:2 XGoTaq Master Green Mix 12.5 yL、五對上、下游引物(20 410各0.5 yL、模板I yL、滅菌去離子水補足至終體積25 yL。最佳反應條件為:94 °C 5 min；94 °C 30 s、53 °C 30 s、72 °C 60 s，35 個循環;72 °C lOmin。
[0011]3、多重PCR的建立
以優化的反應體系進行多重PCR擴增，該方法可用于鴨疫里默氏菌的流行病學檢測，為疾病的早期預防控制奠定技術基礎。同時，該方法的建立為研究該病原的復制動力學提供檢測平臺。
[0012]本發明的有益效果:
本發明根據鴨鴨疫里默氏菌CH3株基因組序列，設計主要毒力因子的多重PCR引物，于國內外率先建立檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR方法，該方法靈敏度高、特異性強，最低可檢測169pg的核酸。
【附圖說明】
[0013]圖1鴨疫里默氏菌毒力基因多重PCR的建立，I?5:鴨疫里默氏菌單個毒力基因PCR產物，分別是TonB依賴受體(TbdRl)、OmpA、鐵載體相互作用蛋白白；M:Marker(DL2000); 6:鴨疫里默氏菌毒力基因多重PCR產物。
[0014]圖2鴨疫里默氏菌毒力基因多重PCR特異性試驗，M: Marker(DL2000);l:鴨疫里默氏菌;2:禽大腸桿菌;3:禽多殺性巴氏桿菌;4:金黃色葡萄球菌;5:禽沙門氏菌;6:空白對照。
[0015]圖3鴨疫里默氏菌毒力基因多重PCR敏感性試驗，M: Marker(DL2000)； 1:169 ng/yL ；2:16.9 ng /yL ；3:1.69 ng /yL ；4:169 pg /yL；5:16.9 pg /yL；6:1.69 pg /yL；
7:空白對照。
【具體實施方式】
[0016]實施例1鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR方法的建立一、材料
鴨疫里默氏菌CH3株(GenBank登錄號:NZ_CP006649 )，其中:
TonB依賴受體(TbdRl) (GenBank登錄號:KC758117.I)；
OmpA (GenBank登錄號:JN871502);
鐵載體相互作用蛋白(SIP) (GenBank登錄號:KF309182);
TonBl (GenBank登錄號:KM393215.I)；
TonB2蛋白(GenBank登錄號:KM393216.I)。
[0017]二、步驟試劑
pMD18_T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，GoTaq Master Green Mix購自Promega公司，細菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收小量試劑盒、質粒小量抽提試劑盒購自Omega公司；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a感受態細胞自制；。
[0018]引物的特異性
引物的特異性是本實驗所建立方法的最重要因素。分別根據NCBI中CH3株中TonB依賴受體(TbdRl)、OmpA、鐵載體相互作用蛋白(SIP)、TonBl與TonB2蛋白的基因序列，通過比對分析，設計五組引物。
[0019]單因子PCR方法的建立
按照細菌DNA提取試劑盒說明書方法提取鴨疫里默氏菌DNA，分別擴增五個毒力基因: 第一組:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’，
TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’；
第二組:OmpA-Fl: 5’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3’，
OmpA-Rl: 5，CTAAAGCAGCTACTACAGA 3 ’.；
第三組:TonBl-Fl:5’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3’，
TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’；
第四組:TonB2-Fl: 5’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3’，
TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’；
第五組:SIP-Fl:5’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3’，
SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’。
[0020]每組引物所擴增的毒力基因片段大小分別為1179 bp,843 bp,723 bp、576bp、315 bp ο
[0021]擴增體系為50 yL，其中2XGoTaq Master Green Mix 25 yL、五對上、下游引物(20 μΜ)各lyL、模板2 yL、補充滅菌去離子水至終體積50 yL。反應條件為94°C預變性5min，隨后進行94°C 30 s、53°C 30 s、72°C60s循環35次后，72°C延伸10 min。反應結束后，取PCR產物5 41^，在1.0 %瓊脂糖凝膠上電泳。將五個PCR產物經膠回收試劑盒純化后與PMD18-T載體連接，轉化DH5a感受態細胞，用PCR和雙酶切方法鑒定重組質粒。陽性重組質粒進行序列測定。測序結果表明，陽性重組質粒符合預期。
[0022]多重PCR方法的建立
按照細菌DNA提取試劑盒說明書方法提取鴨疫里默氏菌DNA，并利用五組引物同時擴增五個毒力基因:
第一組:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’
TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’
第二組:OmpA-Fl: 5 ’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3 ’;
OmpA-Rl: 5’ CTAAAGCAGCTACTACAGA 3'
第三組:TonBl-Fl: 5 ’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3 ’;
TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’.第四組:TonB2-Fl: 5 ’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3 ’;
TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’.第五組:SIP-Fl: 5 ’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3 ’;
SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’.所擴增的毒力基因片段為1179 bp,843 bp,723 bp、576bp、315 bp(見圖1)。
[0023]反應條件的優化
采用25 yL反應體系2XGoTaq Master Green Mix 12.5yL、五對上、下游引物(20 μΜ)各0.5 yL、模板I yL、補充滅菌去離子水至終體積25 yL。對退火溫度(53?64 °C)、引物終濃度(0.1?I μΜ)進行優化。
[0024]特異性檢測
用優化的條件分別檢測禽大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌和禽沙門氏菌進行檢測，對其特異性進行評價。結果檢測均為陰性，PCR產物電泳均未見條帶(見圖2)。
[0025]敏感性檢測
基因組DNA敏感性試驗:分別提取鴨疫里默氏菌的基因組DNA，測定DNA含量為16.9yg /此，依次稀釋至以下濃度:1690 ng /yL、169 ng /yL、16.9 ng /yL、1.69 ng /yL、169pg AiL、16.9 pg /yL、1.69 pg /yL，各取分別取I yL已稀釋的DNA為模板進行多重PCR擴增，試驗結果表明:多重PCR最低可檢測169 pg的核酸(見圖3)。
[0026]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種用于檢測鴨疫里默氏菌主要毒力因子的多重PCR引物，其特征在于，所述引物序列如下: 第一組:TbdR-Fl:5’ CACAATATGGCTCTGATGCT 3’， TbdR-Rl: 5’ GCTCCTACCATTACTACCTG 3’； 第二組:OmpA-Fl: 5’ TTTGAGACACGACTATACAGG 3’， OmpA-Rl: 5，CTAAAGCAGCTACTACAGA 3 ’.； 第三組:TonBl-Fl:5’ AGCCAAACCATAAATACATCGG 3’， TonBl-Rl: 5’ TTGCCCGCTTTATCTACCAC 3’； 第四組:TonB2-Fl: 5’ AAGAACCTATTTTGGAGCAAC 3’， TonB2-Rl: 5’ TGGCATTCTAAATCTTGAACGA 3’； 第五組:SIP-Fl:5’ GGTAAAACCGCACTTCGTA 3’， SIP-Rl: 5’ GTATTTCGTAAGTTGGCAAT 3’。2.如權利要求1所述的引物在制備檢測鴨疫里默氏菌試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886658SQ201610483937
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月28日
【發明人】陳紅梅, 黃瑜, 程龍飛, 施少華, 傅光華, 萬春和, 傅秋玲, 陳翠騰, 劉榮昌
【申請人】福建省農業科學院畜牧獸醫研究所