Gif基因在食管鱗癌診治中的應用
【專利摘要】本發明公開了GIF基因在食管鱗癌診治中的應用，發明人證明了GIF基因與食管鱗癌的發生發展相關，增加GIF的表達可以促進食管鱗癌細胞的凋亡，本發明公開了食管鱗癌診斷和治療的方法，具有重要的臨床應用價值。
【專利說明】
GIF基因在食管鱗癌診治中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種基因在食管鱗癌診治中的應用，具體地涉及 GIF在食管鱗癌診治中的應用。
【背景技術】
[0002] 食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，約占所有惡性腫瘤的2%，在全球 范圍內，其發病率排名第八位，死亡率排名第六位。食管癌的病理類型包括食管鱗狀細胞癌 和食管腺癌，同時食管癌還具有區域性分布的特點，大部分的食管鱗癌主要發生在亞洲國 家。伊朗北部穿越中亞共和國到中國北方，這一區域被稱為"食管癌地帶"，其中90%的病理 類型為鱗狀細胞癌。我國是世界上食管鱗癌發病率較高的國家之一。隨著科學技術的不斷 發展，目前食管癌的治療已經發展成為以外科手術治療為主，再輔助放、化療等的綜合治療 模式。在我國，外科手術仍然是可切除食管癌首選的治療方法。近年來隨著食管癌診斷技術 的不斷提高，手術操作技能的不斷改進，術前輔助化療的應用，再加上術后規律放、化療的 施行，食管癌患者的生活質量在一定程度上逐步得到了改善，但是從整體上我國食管癌患 者術后的5年總體生存率僅為20%-30%。
[0003] 食管鱗癌的發生和發展是一個涉及多因素多步驟的復雜的病理過程，近年來，隨 著人們對分子生物學認識的不斷深入，大量的研究已經證明許多基因的特異性變化在腫瘤 發生發展過程中發揮著重要的作用。盡管到目前為止食管癌發生和發展的確切機制尚不明 確，但是關于與食管鱗癌相關的分子生物學標記物的研究一直以來都是該領域研究的熱 點。目前臨床上缺乏有效的食管鱗癌的診斷標志物，臨床上常使用消化道腫瘤標志物如 SCC、CEA、CA724和CA199,但上述分子作為食管鱗癌腫瘤標志物的診斷價值有限，因此尋找 更有價值的食管鱗癌相關分子標記物，評價其診斷價值并探索其功能，從而開發新的腫瘤 標志物和更有針對性的治療靶點，以改善患者的預后。
【發明內容】
[0004] 為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可用于診治食管鱗癌的分 子標記物-GIF基因。
[0005] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0006] 本發明提供了 GIF基因及其表達產物在制備診斷食管鱗癌的產品中的應用。
[0007] 進一步，所述產品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片檢 測GIF基因的表達水平以診斷食管鱗癌的產品。
[0008] 進一步，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產品至少包括一對特異擴增GIF基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌的產品至少包括一對特異擴增GIF基因的引物;所述 用免疫檢測診斷食管鱗癌的產品包括:與GIF蛋白特異性結合的抗體;所述用原位雜交診斷 食管鱗癌的產品包括:與GIF基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管鱗癌的產品 包括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括與GIF蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包 括與GIF基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 進一步，所述基因芯片可用于檢測包括GIF基因在內的多個基因（例如，與食管鱗 癌相關的多個基因）的表達水平。所述蛋白質芯片可用于檢測包括GIF蛋白在內的多個蛋白 質(例如與食管鱗癌相關的多個蛋白質）的表達水平。通過將多個與食管鱗癌的標志物同時 檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0010] 本發明提供了一種診斷食管鱗癌的產品，所述產品能夠通過檢測食管組織中GIF 基因的表達水平來診斷食管鱗癌，GIF基因在食管鱗癌組織中表達下調。
[0011] 進一步，所述產品包括芯片、或試劑盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質芯 片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒。所述基因芯片包括固相載體以 及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測GIF基因轉錄水平的 針對GIF基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質芯片包括固相載體以及固定在固相載體的GIF蛋 白的特異性抗體;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測GIF基因轉錄水平的試劑;所述蛋白免 疫檢測試劑盒包括GIF蛋白的特異性抗體。
[0012] 進一步，所述基因檢測試劑盒可用于檢測包括GIF基因在內的多個基因（例如，與 食管鱗癌相關的多個基因）的表達水平。所述蛋白免疫檢測試劑盒可用于檢測包括GIF蛋白 在內的多個蛋白質(例如與食管鱗癌相關的多個蛋白質）的表達水平。將食管鱗癌的多個標 志物同時進行檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0013] 本發明提供了GIF基因及其表達產物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應 用。
[0014] 進一步，所述藥物組合物包括增加 GIF基因表達、增強GIF表達功能、和/或增強GIF 表達產物活性的試劑。
[0015] 進一步，所述試劑包括:含有能編碼功能性GIF蛋白的核酸的試劑、GIF蛋白的激活 劑、含有GIF蛋白質的試劑。
[0016] 其中，所述含有能編碼功能性GIF蛋白的核酸的試劑可以是在有利條件下翻譯成 活性形式的GIF蛋白的單鏈核酸(如mRNA)或雙鏈核酸(如DNA)，所述的核酸可以連接在表達 載體上或重組到宿主細胞里，只要能編碼成活性GIF蛋白，任何一種GIF基因的攜帶方式均 可。所述的GIF蛋白激活劑是指刺激GIF蛋白活性、增加 GIF蛋白活性、促進GIF蛋白活性、增 強GIF蛋白激活、使GIF蛋白活性敏感化或上調GIF蛋白活性的試劑，如去甲基化試劑、GIF啟 動子和/或增強子特異性的轉錄激活劑、GIF蛋白的激動劑(如激活抗體)等。
[0017] 進一步，上述藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，所述載體可以是一種也可 以是多種，所述載體包括但不限于稀釋劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等;粘合劑 如淀粉、預膠化淀粉、糊精、麥芽糖糊精、鹿糖、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、 乙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸鹽、黃原膠、羥丙基纖 維素和羥丙基甲基纖維素等;表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸 鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等;致濕劑如甘油、淀粉等;吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、 硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤滑劑如硬脂酸鋅、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸 鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末、氫化植物油、硬脂富馬酸鈉、聚氧乙烯單硬脂酸酯、單月桂蔗 糖酸酯、月桂醇硫酸鈉、月桂醇硫酸鎂、十二烷基硫酸鎂等;填充劑如甘露醇(粒狀或粉狀）、 木糖醇、山梨醇、麥芽糖、赤蘚糖、微晶纖維素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀 粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉等；崩解劑如交聯乙烯吡咯烷 酮、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基甲基、交聯羧甲基纖維素鈉、大豆多糖等。
[0018] 所述的藥物組合物可以使用不同的添加劑進行制備，例如穩定劑、殺菌劑、緩沖 劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。
[0019] 穩定劑包括人類血清蛋白、L-氨基酸、糖及纖維素衍生物。L-氨基酸還可以包括甘 氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖 等;糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等;二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等;多聚糖，例如葡 聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維 素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羥甲基纖維素鈉。
[0020] 表面活性劑包括離子或非離子表面活性劑，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單 酰基酯、脂肪酸甘油酯。
[0021] 添加劑緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應的鹽(它們的堿金 屬或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽）。等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘 油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。
[0022] 本發明還提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括增加 GIF 基因表達、增強GIF表達功能、和/或增強GIF表達產物活性的試劑。
[0023] 本發明的藥物可以用于補充內源性的GIF蛋白的缺失或不足，通過提高GIF蛋白的 表達，從而治療因 GIF蛋白減少導致的食管鱗癌。
[0024] 本發明所述攜帶基因的載體是本領域已知的各種載體，如市售的載體、包括質粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0025] 進一步，本發明中GIF蛋白或編碼GIF蛋白的核酸可以通過脂質體給予，所述脂質 體的作用是將藥物靶向于特定的組織，以及增加藥物的半衰期。脂質體包括乳化劑、起泡 劑、液態脂質、固態脂質、不溶性單層、磷脂分散劑、表面活性劑等。所述的脂質體中還可以 包括能與靶向的細胞中的受體分子結合或其他治療性或免疫原性組合物。
[0026] 本發明的藥物組合物可以被配制成任何的給藥類型，例如，利用注射器或其它裝 置的皮內注射、皮下注射、靜脈內注射、腹膜內注射、胸膜內注射、膀胱內注射、冠狀動脈內 或腫瘤內注射、口服給藥、直腸給藥。
[0027] 本發明的藥物導入組織或者細胞的方式可以分為體外或者體內的方式。體外方式 包括將含有GIF基因的藥物或者含有GIF蛋白質的藥物導入細胞中，再將細胞移植或回輸到 體內。體內方式包括直接將含有GIF基因的藥物或者含有GIF蛋白質的藥物注入體內組織 中。
[0028] 本發明的藥物還可與其他治療食管鱗癌的藥物聯用，其他治療性化合物可以與主 要的活性成分(例如，GIF蛋白或編碼所述蛋白的核酸）同時給藥，甚至在同一組合物中同時 給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化 合物。主要成分(如GIF蛋白或編碼所述蛋白的核酸）的部分劑量可以與其它治療性化合物 同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。
[0029] 在疾病治療過程中，可以根據癥狀的嚴重程度、復發的頻率和治療方案的生理應 答，調整本發明藥物組合物的劑量。
[0030] 在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物 細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
[0031] 本發明中針對GIF基因的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。 所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度 都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長 至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、 信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個 堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好 少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0032] 本發明中所述GIF蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述GIF蛋白 的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F (ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與GIF蛋白的結合能力即可。用于檢測蛋白質水平的 抗體的制備是本領域技術人員公知的，并且本發明可以使用任何方法來制備所述抗體，如 所述的片段可以通過化學法從頭合成或利用重組DNA技術合成。
[0033] 在本發明的上下文中，"GIF基因"包括人GIF基因以及人GIF基因的任何功能等同 物的多核苷酸。GIF基因包括與目前國際公共核酸序列數據庫GeneBank中GIF基因（NC_ 000011.10)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
[0034] 優選地，GIF基因的編碼序列包括以下任一種DNA分子：
[0035] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列；
[0036] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
[0037] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質的DNA分子。
[0038]在本發明的具體實施方案中，所述GIF基因的編碼序列是SEQ ID N0.1所示的DNA 序列。
[0039]在本發明的上下文中，GIF基因表達產物包括人GIF蛋白以及人GIF蛋白的部分肽。 所述GIF蛋白的部分肽含有與食管鱗癌相關的功能域。
[0040] "GIF蛋白"包括GIF蛋白以及GIF蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括GIF 蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導突 變體、在高或低的嚴緊條件下能與人GIF的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質。
[0041 ]優選地，GIF蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白質：
[0042] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0043] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數通常為1-50個，較佳地1-30 個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。
[0044] (3)與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 優選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構成的多肽。
[0045]在本發明的具體實施方案中，所述GIF蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列 的蛋白質。
[0046] 通常，一個蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。本領域技 術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或對氨基酸序列的個別添加、缺失、插 入、替換是保守修飾，其中蛋白質的改變產生具有相似功能的蛋白質。提供功能相似的氨基 酸的保守替換表是本領域公知的。
[0047] 通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質的例子是GIF蛋白的融合蛋 白。對于與GIF蛋白融合的肽或者蛋白質沒有限制，只要所得的融合蛋白保留GIF蛋白的生 物學活性即可。
[0048]本發明的GIF蛋白也包括對SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經 過修飾的蛋白質仍然能夠保留GIF蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質中突變的氨 基酸數目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。
[0049] 在本發明的上下文中，"治療食管鱗癌"包括能消除、減輕、緩解、逆轉或預防或延 遲病癥的任何癥狀的發生和復發，即包括對疾病的治療性干預和預防性干預。
[0050] 本發明的優點和有益效果：
[0051] 本發明首次發現了一種食管鱗癌的新的分子標記物-GIF基因，通過檢測受試者食 管組織中GIF的表達水平，可以判斷受試者是否患有食管鱗癌，從而指導臨床醫師給受試者 提供個性化預防方案或者治療方案。
【附圖說明】
[0052]圖1顯示利用QPCR檢測GIF基因在食管鱗癌組織中的表達情況；
[0053]圖2顯示利用QPCR檢測GIF基因在食管鱗癌細胞中的表達情況；
[0054]圖3顯示利用MTT檢測GIF基因表達對食管鱗癌細胞增殖能力的影響。
[0055]具體的實施方式
[0056]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0057]實施例1篩選與食管鱗癌相關的基因標志物 [0058] 1、樣品收集
[0059] 各收集6例食管鱗癌癌旁組織和食管鱗癌組織樣本。上述所有標本的取得均通過 組織倫理委員會的同意。
[0060] 2、RNA樣品的制備（利用E.Z.N.A.i)miRNAkit進行操作）
[0061] 上述獲得的組織剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，按照試劑盒中的說明書提取 分離RNA。具體如下：
[0062] 1)RNA 的分離：
[0063] A.組織勻漿或細胞中加入 RNA.S:〇lv?ReagentII 1ml;
[0064] Β·室溫放置3min，加入0.2ml氯仿后劇烈搖動15s;
[0065] C.置于冰上防止lOmin;
[0066] D. 1200(^，4。〇離心 15min;
[0067] E.轉移80%的水相進入新的2ml EP管中，加入1/2量的無水乙醇，振搖；
[0068] F.將小于700μ1的上述液體轉移至HiBind?:RN_AMini column，振搖后10000g室溫 離心60s。
[0069] 2)RNA 純化：
[0070] A.向 HiBind?RNAMini column加入500μ1 RWC Wash Buffer，10000g離心30s; [0071 ] B.加入500μ1 RWB Wash Buffer，10000g離心30s，重復兩次后米取最大離心完全 干燥 H i B i n d.3? R N A M i n i c ο 1 umn;
[0072] C.向柱子加入15μ1預熱至70°C的DEPC水，室溫放置2min后全速離心。
[0073] 3、高通量轉錄組測序
[0074] 1 )RNA_seq 讀段定位
[0075] 首先將低質量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHat vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組(hgl9)進行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預先構建的索引 從TopHat主頁下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認 到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。TopHat根據外顯子區域和GT-AG剪切信號建立可能的 剪切位點庫，根據這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 TopHat方法的系統默認參數。
[0076] 2)轉錄豐度評估
[0077] 匹配上的讀段文件通過Cufflinks vl.0.3處理，Cufflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數目進行標準化計算轉錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定 基因 lkb長的外顯子區域的片段數目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數據庫下載（Homo_ sapiens.GRCh37·63·gtf)〇
[0078] 3)差異表達基因的檢測
[0079] 將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉錄本的表達豐度，檢測差異表 達。在Cuff idff輸出中只有q值<0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。
[0080] 4、結果
[0081 ] RNA-seq結果顯示，GIF基因在食管鱗癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織中的表 達量。
[0082] 實施例2QPCR測序驗證GIF基因的差異表達
[0083] 1、對GIF基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇 食管鱗癌癌旁組織和食管鱗癌組織各50例。
[0084] 2、RNA提取步驟同實施例1。
[0085] 3、逆轉錄:使用TAKARA公司的反轉錄試劑盒進行操作。具體步驟如下：
[0086] (1)取總RNA lyg進行逆轉錄，加入01 igo(dT)2μ1，充分混勻。70°C水浴5min后立即 冰浴2min。
[0087] (2)構建25μ1反應體系，其中包括5X逆轉錄緩沖液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，補無核酸酶水至預期體積。
[0088] (3)42°C水浴 60min 后，95°C水浴 5min 以滅活 M-MLV。
[0089] (4)-2(TC 儲存備用。
[0090] 4、QPCR 擴增
[0091] (1)引物設計
[0092] 根據Genebank中GIF基因和β-actin基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海生 工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[0093] GIF的引物序列：
[0094] 正向引物：5，-GTGTTACTTGTTGTCCTA-3，（SEQ ID N0.3)，
[0095] 反向引物：5'-CGATATTGTTGATAGAAGAG_3'（SEQ ID N0.4)
[0096] β-actin的引物序列：
[0097] 正向引物：5'-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3'（SEQ ID N0.5)
[0098] 反向引物：5'-TCCTTCTGCATCCTGTCG_3'（SEQ ID NO·6)
[0099] 以SYBR Green作為熒光標記物，在Light Cycler熒光實時定量PCR儀上進行PCR反 應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，A ACT法進行相對定量。
[0100] (2)按照表1配制PCR反應體系：
[0101 ] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0102] 表1PCR反應體系
[0104] (3)PCR反應條件：95°C lOmin，（95°C30s，60°C60s) X 35個循環。以SYBR Green作為 熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進行相對定量。
[0105] 5、統計學方法
[0106] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值土標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具 有統計學意義。
[0107] 6、結果
[0108]結果如圖1所示，與食管鱗癌癌旁組織相比，GIF基因在食管鱗癌組織中下調，差異 具有統計學意義(Ρ〈〇·〇5)，同RNA-s印結果一致。
[0109] 實施例3GIF基因的過表達 [0110] 1、細胞培養
[0111] 人食管鱗癌細胞株KYSE 150,以含10%胎牛血清和1%P/S的培養基DMEM在37°C、 5 % C02、相對濕度為90 %的培養箱中培養。2-3天換液1次，使用0 · 25 %含EDTA的胰蛋白酶常 規消化傳代。
[0112] 2、GIF基因的過表達
[0113] 2.1GIF基因表達載體的構建
[0114] 根據GIF基因的編碼序列（如SEQ ID NO.1所示)設計擴增引物，引物序列如下：
[0115] 正向引物：5'-CCGAAGCTTGCCACCATGGCCTGGTTTGCCCT-3'（SEQ ID N0.7)
[0116] 反向引物：5'-CGGGCGGCCGCGTACTGTGTGTGAAATTGGCT-3'（SEQ ID N0.8)
[0117] 從成人胎腦的cDNA文庫(clontech公司，貨號:638831)中擴增全長的GIF基因的編 碼序列，上述cDNA序列經限制性內切酶Hindlll和Notl雙酶切后插入到經限制性內切酶 Hindlll和Notl雙酶切的真核細胞表達載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-GIF用于后續實驗。
[0118] 2.2 轉染
[0119] 將食管鱗癌細胞分為兩組，分別為對照組(轉染pcDNA3.1空載體）、和GIF過表達組 (轉染PCDNA3.1-GIF)。使用脂質體2000進行載體的轉染，具體轉染方法按照說明書的指示 進行。pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-GIF的工作濃度均為0.5μg/ml。
[0120] 2.3RT-PCR 檢測
[0121] 具體步驟同實施例2。
[0122] 3、統計學方法
[0123] 實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值土標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具 有統計學意義。
[0124] 4、結果
[0125] 如圖2所示，與轉染pcDNA3.1空載體的細胞相比，轉染pcDNA3.1-GIF的細胞中GIF 的含量顯著上調，差異具有統計學意義(P〈〇. 05)。
[0126] 實施例4GIF基因對食管鱗癌細胞增殖的影響
[0127] 采用MTT實驗檢測GIF基因對食管鱗癌細胞增殖能力影響。
[0128] 1、步驟:各組細胞轉染12h后胰酶消化，制成單細胞懸液，以每孔6000個細胞接種 于96孔培養板中，每組分7個時間點，每個時間點設6個復孔。細胞貼壁后，進行第1次檢測： 每孔加入5g/L的MTT液20μ1，繼續培養4h后，吸去培養基，加入DMS0 150μ1，細心吹打，使紫 藍色沉淀充分溶解，用酶標儀在490nm波長測吸光度值(Α值）。然后每12h檢測1次，連續測 72h，共7次。本實驗重復3次。
[0129] 2、統計學方法
[0130] 實驗都是按照重復3次來完成的，采用SPSS13.0統計軟件來進行統計分析的，兩組 之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統計學意義。
[0131] 3、結果
[0132] 圖3所示的結果顯示：轉染pcDNA3. 1-GIF組的細胞生長速度明顯抵于轉染 pcDNA3.1空載體組的細胞生長速度，差異具有統計學意義(P〈0.05)，上述結果表明GIF的表 達能夠抑制食管鱗癌細胞的生長。
[0133] 實施例5GIF基因對食管鱗癌細胞凋亡的影響
[0134] 使用流式細胞儀檢測GIF基因對細胞凋亡的影響。
[0135] 1、細胞培養步驟同實施例3。
[0136] 2、細胞轉染步驟同實施例3。
[0137] 3、步驟
[0138] 細胞轉染72h后，使用預冷roS洗滌細胞，然后用0.25 %胰酶消化細胞，中止消化， 將離心收集的細胞使用PBS重懸，將細胞定量為IX 106個/ml，取200μ1上述細胞懸液放置到 Eppendorf管中，加入10μ1 Annexin-V-FITC混勾，室溫暗處孵育染色15min，上機前5min加 入10mg/L碘化丙錠(PI)染色5μ1。未轉染質粒的細胞分別用Annexin-V-FITC和PI染色用于 標準定量。用FACS流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數，觀察凋亡細胞百分比。
[0139] 3、統計學方法
[0140]實驗都是按照重復3次來完成的，結果數據都是以平均值土標準差的方式來表示， 采用SPSS13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當P〈0.05時 具有統計學意義。
[0141] 4、結果：
[0142] 轉染pcDNA3.1-GIF組的細胞凋亡率為（24.39±0.012)%，轉染pcDNA3.1空載體組 的細胞凋亡率為(6.73 ± 0.009) %，上述差異具有統計學意義(P〈0.05)，上述結果表明，GIF 基因的過表達促進食管鱗癌細胞的凋亡。
[0143] 上述實施例的說明只是用于理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. GIF基因及其表達產物在制備診斷食管鱗癌的產品中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交或芯片檢測GIF基因的表達水平以診斷食管鱗癌的產品。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產品至少包 括一對特異擴增GIF基因的引物;所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌的產品至少包括一對特 異擴增GIF基因的引物;所述用免疫檢測診斷食管鱗癌的產品包括:與GIF蛋白特異性結合 的抗體;所述用原位雜交診斷食管鱗癌的產品包括:與GIF基因的核酸序列雜交的探針;所 述用芯片診斷食管鱗癌的產品包括:蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與GIF蛋白 特異性結合的抗體，基因芯片包括與GIF基因的核酸序列雜交的探針。4. 一種診斷食管鱗癌的產品，其特征在于，所述產品能夠通過檢測食管組織中GIF基因 的表達水平來診斷食管鱗癌。5. 根據權利要求4所述的產品，其特征在于，所述產品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒。 6. GIF基因及其表達產物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述藥物組合物包括增加 GIF基因表達、增 強GIF表達功能、和/或增強GIF表達產物活性的試劑。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述試劑包括:含有能編碼功能性GIF蛋白 的核酸的試劑、GIF蛋白的激活劑、含有GIF蛋白質的試劑。9. 根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于，所述藥物組合物還包括藥學上可接受 的載體。10. -種治療食管鱗癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括增加 GIF基因 表達、增強GIF表達功能、和/或增強GIF表達產物活性的試劑。
【文檔編號】G01N33/574GK105886656SQ201610471615
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】田子強, 溫士旺, 蘇鵬, 李振華
【申請人】河北醫科大學第四醫院