一種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記及其應用，該功能標記的序列如SEQ ID NO:1所示，分子量為465 bp，其在油菜抗旱育種中的應用步驟是：A、提取油菜單株的DNA；B、PCR擴增：引物序列為F：5′?TGAGGCTGATAGGATACTGG?3′，R：5′?CCACGGGCACCTACATTA?3′；C、擴增產物經1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳分離后，分子量為465 bp的功能標記的特異性條帶出現時，預測油菜單株的抗旱性較好，分子量為465 bp的功能標記的特異性條帶缺失時，預測油菜單株的抗旱性較差。本發明為油菜苗期抗旱性的遺傳改良提供了新的遺傳標記，有效解決了常規育種方法中存在的抗旱性鑒定工作量大、周期長、易受環境影響等問題，從而顯著提高了油菜抗旱育種的選擇效率，加快新品種的選育步伐。
【專利說明】
一種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于油菜育種和分子生物學領域，更具體地涉及一種與油菜苗期抗旱性關 聯的功能標記，還涉及該功能標記在油菜抗旱育種中的應用。
【背景技術】
[0002] 干旱和水資源缺乏是世界農業生產的最大制約因素，因干旱造成的農作物產量損 失超過其它自然災害的總和。油菜是我國最重要的冬季油料作物，主要種植于長江流域，但 近年來該地區季節性干旱頻繁發生，嚴重影響油菜產量。研究表明，油菜苗期是干旱最敏感 的時期之一，受旱后可造成41%的產量損失（Hashem et al.Drought stress effects on seed yield,yield attributes ,growth,cell membrane stability and gas exchange of synthesized Brassica napus L. Journal of Agronomy and Crop Science,1998, 180,129-136)。因此，提高油菜的抗旱減災能力，對于保障我國油料供給安全具有重要意 義。在長期的進化過程中，作物逐漸形成了避旱、御旱和耐旱等多種干旱脅迫響應機制，其 中御旱和耐旱統稱為抗旱性。御旱性是植物加強根部水分吸收、減少地上部分的水分蒸發 來抵御干旱的能力。耐旱性主要是通過生理和生化調節來實現的，如合成小分子糖類、醇 類、醛類來提高提高滲透調節能力，防止細胞水分的散失，以及產生脅迫感應信號、啟動體 內的防御系統和活性氧清除系統來維持細胞結構的穩定性，從而在一定程度上減輕和緩解 干旱造成的影響（景蕊蓮.作物抗旱研究的現狀與思考.干旱地區農業研究，1999,17:79-85)〇
[0003] 實踐證明，培育和應用抗旱性作物品種是應對農業干旱的最經濟有效的手段。然 而，植物抗旱性屬多基因控制的數量性狀，而且抗旱性鑒定周期長，易受環境因素影響，因 而通過常規育種方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。隨著分子生物學的發展，利用特 定的分離群體對抗旱性開展QTL分析，獲得抗旱性相關的分子標記并進行標記輔助選擇，則 可顯著提高抗旱育種的效率。比如，李真等人利用一個DH群體，利用SSR和AFLP標記對油菜 苗期的抗旱性和耐漬性進行了 QTL分析，共檢測到28個有關的QTL(Mapping of QTL associated with waterlogging tolerance and drought resistance during the seedling stage in oilseed rape.Euphytica,2014,197:341-353)。然而，上述傳統的QTL 分析和標記輔助選擇存在一定的局限性，因為QTL分析的工作量很大，難以實現QTL的精細 定位，而且在標記輔助選擇過程中有可能因為遺傳重組或遺傳漂移而丟失目標基因 (Collard B C,Mackill D J.Marker-assisted selection:an approach for precision plant breeding in the twenty-first century.Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B,Biological Sciences,2008,363:557-572)〇
[0004] 利用對性狀具有決定作用的、具有明確功能的基因序列開發出來的多態性標記， 即功能標記進行分子標記輔助育種，則可以保證選擇的準確性和選擇效率，因為選擇的就 是基因本身（Andersen J R，Liibberstedt T.Functional markers in plants.Trends in Plant Science，2003，8: 554-560)。根據已知功能基因序列開發功能分子標記是最直接有 效的方法，但是可供利用的油菜抗旱候選基因序列十分有限，尚無法滿足油菜抗旱育種的 技術需求。張靜利用SNP標記進行全基因組關聯分析，檢測到16個顯著關聯的位點，但無法 開發出功能標記供育種應用(華中農業大學博士論文，2015,武漢）。
[0005] 本研究通過轉錄組關聯分析技術制備到與油菜苗期抗旱性高度關聯的功能標記， 并驗證了該標記在育種中的應用價值。經文獻查新，國內未見有關油菜苗期抗旱性的功能 標記的制備及其應用的研究報道，也未見相關的專利技術公開或使用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是在于提供一種油菜苗期抗旱性關聯的功能標記，其序列為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，該標記為油菜抗旱育種提供新手段，加速油菜抗旱性遺傳改良進 程，提高育種的選擇效率和準確性。
[0007] 本發明的另一個目的是在于提供了一種油菜抗旱性高度關聯的功能標記在油菜 抗旱育種中的應用，通過該方法有效解決了常規育種方法中存在的抗旱性鑒定工作量大、 周期長、易受環境影響等問題，準確率高達92.5%。
[0008] 為了達到上述目的，本發明采取以下技術方案：
[0009] -種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記的制備方法，其步驟是：
[0010] (1)以101份遺傳來源不同的油菜品種資源為研究材料(已公開，具體參見文獻:陸 光遠等.Associative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosin olate content in Brassica napus.DNA Research,2014,21:613-625), 在溫室下生長至2片真葉。
[0011] (2)用Trizol法抽取油菜幼嫩單株葉片的RNA，進行商業化mRNA-Seq測序，并進行 生物信息學分析，開發獲得基因表達標記(Gene Expression Marker,GEM);
[0012] (3)自然群體在干旱棚種植，苗期利用二次干旱存活法鑒定每份品種資源的抗旱 性表現，根據存活率高低將抗旱性劃分為5個等級(見表1);
[0013] 表1油菜苗期抗旱性評價標準
[0016] (4)運用統計軟件R(http://www. R-project.org/)中的混合線性模型將GEM標記 數據與干旱存活率進行關聯分析，以顯著性P〈10_5(-L〇g1QP = 5)為標準，篩選獲得79個顯著 關聯的GEM標記，其中A_EE476451標記的顯著水平最高(P=1.5E-10)。該標記對表型方差的 貢獻率達到23.8%。
[0017] (5)從公共數據庫(http: //brassica·nbi · ac ·uk/)查詢獲得候選基因 EE476451的 核苷酸序列，blastn搜索(http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/)發現該核苷酸序列與甘藍型 油菜中的一個RNA解旋酶(DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 27_like，NCBI序列號： XM_013786005)的同源性為100%。針對EE476451的核苷酸序列設計引物并以油菜品種的 DNA為模板進行PCR擴增、序列測定和比對，在序列變異位點重新設計PCR引物將其轉化為特 異性的功能標記EE476451-465，該標記的序列為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，其引物正 向序列EE476451-89F為5' -TGAGGCTGATAGGATACTGG-3'，引物反向序列EE476451-554R為5'-CCACGGGCACCTACATTA-3 7 〇
[0018] -種油菜苗期抗旱性關聯的功能分子標記在油菜育種中的應用，其步驟是：
[0019] (1)提取油菜單株的DNA;
[0020] ( 2 )PCR擴增：引物序列為F : 5' -TGAGGCTGATAGGATACTGG-3'，R : 5'-CCACGGGCACCTACATTA-3' ; PCR反應體系：DNA模板 lyL，引物（50ng/yL)各0 · 5yL，10 X PCR Buffer lyL, dNTPs (1 Ommo 1/L) 0.2yL,MgCl2 (25mmo 1 /L) 0.8yL, Taq(5U/yL)0.5yL, ddH20 5.5 yL;PCR反應程序:95°C預變性3min;94°C變性30s，58°C復性30s，72°C延伸45s，共40個循環； 72°C 延伸 lOmin;
[0021] (3)擴增產物經1.5%濃度(w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，分子量為465-bp的功能 標記的特異性條帶出現時（陽性），預測油菜單株的抗旱性較好，繼續用于育種選擇;分子量 為465-bp的功能標記的特異性條帶缺失時（陰性），預測油菜單株的抗旱性較差，予以淘汰。
[0022] 本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：
[0023] (1)與常規育種方法相比，本發明提供的與油菜苗期抗旱性關聯的分子標記可極 大提高育種效率，有效克服了抗旱性鑒定工作量大、周期長、易受環境影響等技術難題； [0024] (2)與現有的分子標記相比，本發明提供的分子標記為功能標記，無需經過QTL的 初級定位、精細定位、目標基因克隆、標記開發等耗時長、費用高的研發過程，而是直接通過 轉錄組關聯分析獲得大量的候選基因并進一步開發為功能標記，用時短，效率高，是功能標 記開發的一個重大技術創新；
[0025] (3)本發明中分子標記的準確率高達92.5%，操作十分方便，僅需要常規的PCR反 應和電泳檢測即可完成檢測，成本低廉，便于在育種工作者中推廣應用，前景十分廣闊。
【附圖說明】
[0026] 圖1為一種油菜苗期抗旱性關聯的功能標記的技術流程圖。
[0027] 圖2為一種油菜苗期抗旱性的關聯分析結果示意圖。
[0028]橫坐標為染色體物理距離，縱坐標為取對數后的概率值，每個散點代表一個GEM標 記，箭頭指示顯著關聯分子標記的位置，橫虛線為顯著性閥值。
[0029]圖3為一種功能標記EE476451-465在育種群體中部分單株的檢測結果圖。
[0030] Μ為分子量標準物 100-bp DNA ladder;泳道1、5、6、7、13為陰性;泳道2、3、4、8、9、 10、11、12為陽性，特異性條帶的分子量為465-bp。
【具體實施方式】
[0031] 本發明實施例的舉例并不構成對本發明的任何限制。在下面的實驗步驟中，除非 特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實驗指南》(第三版）（黃培堂等譯，北京:科學出 版社，2002)所提供的方法進行。
[0032] 實施例1:
[0033] 一種油菜苗期抗旱關聯的功能標記EE476451-465的制備方法（陸光遠等， Associative trans criptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolate content in Brassica napus，DNA Research，2014,21:613-625)，其步驟 是：
[0034] 本實施例以101份遺傳來源不同、抗旱性差異較大的油菜品種為例，構建了一個自 然群體，詳細說明獲得與抗旱性關聯的分子標記的方法，具體如下：
[0035] ( - )群體構建：
[0036] 以101份遺傳來源不同的油菜品種為研究材料(已公開，具體參見文獻:陸光遠等， A ssociative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolate conte nt in Brassica napus,DNA Research,2014,21(6):613-625),? 溫室(溫度20°C;光照周期16h，光照強度150001x)下生長至1~2片真葉。上述材料用于DNA 和RNA的提取。
[0037](二）油菜苗期抗旱性鑒定：
[0038]采用二次反復干旱處理法（李德全，鄒琦，程炳高.土壤干旱下不同抗旱性小麥品 種的滲透調節和滲透調節物質.植物生理學報，1992，18: 37-44)，對自然群體101份材料的 苗期抗旱性進行測定，獲取群體的表型數據，具體步驟是：
[0039] (1)植物材料在干旱棚內種植，干旱棚內的培養池（長30m，寬2m，高0.8m)填充有 0.6m厚的沙壤土，中等肥力，底部有排水孔。設置3個重復，每個重復小區種植2行(共60株）， 隨機區組設計;長江流域的播種期為9月底至10月初，播種后立即用微噴灌系統定時定量供 水，使土壤含水量達到20~25 % (水分充足），使油菜正常發芽、生長；
[0040] (2)當幼苗長至3葉期時停止澆水，開始干旱處理。每天利用快速土壤水分測定儀 (浙江拓普頓儀器TZS-1W型）測定每盆土壤含水量，當土壤含水量降至10%左右（中度干旱） 時，進行復水;然后再次干旱處理，當土壤含水量降至10%時再次復水，72h后觀察幼苗存活 數（以心葉轉綠為標準），記錄每個品種的干旱存活率(干旱處理后存活苗數/處理前總苗數 X100%)；
[0041] (3)求算3個重復小區的干旱存活率平均值，用平均值評價各個品種的苗期抗旱 性；
[0042] (4)油菜苗期抗旱性的鑒定標準:根據油菜苗期干旱存活率的高低，將油菜的抗旱 性從高到低劃分為5個等級，具體見表1。
[0043] (三)DNA 提取：
[0044] 對于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩葉片，用CTAB法（Doyle J.DNA protocols f or plants-CTAB total DNA isolation.In:Hewitt G M, Johnston A.Molecular Technique s in Taxonomy .Berlin: Springer-Verlag，1991 .P283-293)提取 總DNA，具體提取步驟如下：
[0045] (1)將新鮮或-20°C冰凍保存的葉片0.5g放入1.5mL離心管中，用玻璃棒磨為勻漿， 加入800yL CTAB提取液（50mmol/L Tris-HCl，pH8.0;20mmol/L EDTA，pH8.0;50mmol/L NaCl;lg/L CTAB)并搖勻，65°C水浴30min;
[0046] (2)取出離心管，加入400yL的純氯仿溶液，在振蕩儀上（2000rpm)震蕩30秒，然后 室溫（20~25°C)下12000rpm離心6min，取上清液（約400yL);
[0047] (3)在上清液中加入兩倍體積的無水乙醇（約800yL)，冰上靜置30min后，然后 12000rpm離心8min收集DNA沉淀；
[0048] (4)DNA沉淀自然風干后，加入雙蒸水200yL溶解即可使用。
[0049] (四)RNA 提取：
[0050] 對于所有植物研究材料，在苗期采集幼嫩葉片，用TRIZol法(裴東和谷瑞升，幾種 提取木本植物中RNA方法的比較和改進，植物生理學通訊，2002，38: 362-365.)提取總RNA， 具體提取步驟如下：
[0051 ] (1)勾衆處理：將200mg葉片組織在液氮中磨碎，加入2mL TRIzol(購自Invitroge ne公司），用勻漿儀進行勻漿處理；
[0052] (2)將勻漿樣品在室溫（15~30 °C)放置5min，使核酸蛋白復合物完全分離；
[0053] (3)加入0.4mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min;
[0054] (4)在2~8°C條件下10000g離心15min，RNA主要在上層無色水相中；
[0055] (5)把水相轉移到新管中，加入1 .OmL異丙醇沉淀水相中的RNA，室溫放置10min;
[0056] (6)在2~8Γ條件下10000g離心10min，移去上清；
[0057] (7)用2mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，在2~8°C條件下不超過7500g離心5min，棄上 清；
[0058] (8)室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5~10min即可，加入25~200yL雙蒸 水，用槍頭吸打幾次使RNA溶解，-70 °C保存。
[0059](五)RNA-Seq測序與標記開發：
[0060] 參照文獻（陸光遠等.Associative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolate content in Brassica napus.DNA Research，2014,21:613-625)報道的方法，將檢測合格的RNA樣品送到深圳華大基因股份有 限公司（http://www.genomics, cn)利用HiSeq4000平臺進行商業化測序，獲得大量的120-bp 的測序數據 ，經過篩選后保留質量較好的序列數據進行拼接以及與油菜參考序列 （由 94558個油菜Unigene組成)進行比對。然后，利用該套RNA-Seq測序數據開發出189116個GEM 標記（用RPKM值表示），RPKM的計算方法是將匹配到Unigene的測序讀數(read)除以匹配到 基因組的所有測序讀數（以百萬為單位)與Unigene的長度（以kb為單位）。
[0061] (六)關聯分析：
[0062] 運用R語言(http: //www · R-pro ject · org/)中的混合線性模型對GEM標記數據和抗 旱性表現數據進行關聯分析（具體方法請參見文獻：陸光遠等，Associative transcriptomics study dissects the genetic architecture of seed glucosinolate content in Brassica napus，DNA Res earch，2014,21(6) :613_625)。以顯著性P〈10-5為標 準，篩選獲得79個顯著關聯的GEM標記，其中標記A_EE476451的顯著性最高(P=1.5E-10)。 該標記對表型方差的貢獻率達到23.8%。
[0063](七)功能標記轉化與檢測：
[0064] 從公共數據庫(http://brassica.nbi .ac.uk/)查詢獲得候選基因 EE476451的核 苷酸序列，blastn搜索(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/)發現該核苷酸序列與甘藍型油 菜中的一個RNA解旋酶（DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 27-like，NCBI序列號： XM_013786005)的同源性為100%，針對EE476451的核苷酸序列設計特異性PCR引物(正向引 物EE47645 卜llFj' -TACCCCTGGCAGACTTCTCG-3';反向引物EE47645 卜5541^:57 -CCACGGGCACCTACATTA-3')，并以2個高度抗旱油菜品種(Apex和Baltia)和2個干旱敏感油菜 品種(Tempi e和Raf al)的DNA為模板進行PCR擴增、序列測定和比對，發現干旱敏感品種中缺 失了 4bp的一段序列。針對這段缺失序列重新設計特異性的正向PCR引物EE476451-89F(目 的是使抗旱品種可正常進行PCR反應，而不抗旱品種無法進行PCR反應），成功將其轉化為功 能標記EE476451-465,該標記的序列為SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，其引物正向序列 EE476451-89F為5' -TGAGGCTGATAGGATACTGG-3'，引物反向序列EE476451-554R為5'-CCACGGGCACCTACATTA-3 7 〇 [0065] 實施例2:
[0066] -種油菜苗期抗旱性高度關聯的功能分子標記在抗旱育種中的應用，其步驟是：
[0067] 從實施例1中的101份品種資源中挑選出抗旱的品種材料20份(干旱存活率平均為 93% )，以及干旱敏感的材料20份(干旱存活率平均為30% )，利用特異性PCR標記EE476451-465進行鑒定，步驟如下：
[0068] (1)提取油菜單株的DNA;
[0069] (2)采用功能標記EE476451-465進行PCR擴增，引物序列是：
[0070]正向引物ΕΕΑ?θΑδΙ-βθΡΧ -TGAGGCTGATAGGATACTGG-3'
[0071 ]反向引物-CCACGGGCACCTACATTA-3';
[0072] (3)PCR反應體系:總體積為10yL，具體成分如下：
[0074] Taq酶購自Fermentas公司，產品提供的PCR Buffer溶液包含的成分是：750mmol/L Tris-HCl，pH8 ·8; 200mmol/L(NH4)2S〇4,0 · 1 % (v/v)Tween 20。卩〇?反應在美國Bio-Rad公司 生產的PTC-200型PCR儀上進行。
[0075] (4)PCR 擴增程序：95.0°C 預變性 3min;94.0°C 變性 3〇8,58.0°(：復性3〇8,72.0°(：延 伸45s，共40個循環;72.0°C延伸lOmin，4°C保存；
[0076] (5)PCR擴增產物經1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳分離后，檢測是否獲得分子量為 465bp的功能標記(序列如SEQ ID N0:1所示）的特異性條帶；
[0077] 在40個測試品種中，出現分子量為465-bp的特異性帶型（即陽性）的品種共19個， 其平均干旱存活率為91 %，總體上抗旱性較高；其中的18個被表型鑒定為抗旱品種，1個鑒 定為不抗旱品種，準確率為94.7% (見表2);
[0078]缺失分子量為465-bp的功能標記帶型（即陰性）的品種共21個，其平均干旱存活率 為35.0%，總體上抗旱性較差(見表2);其中被表型鑒定為不抗旱的品種19個，抗旱的品種2 個，準確率為90.5%。
[0079] 上述鑒定結果表明，在育種中通過功能標記鑒定篩選，保留出現465-bp的功能標 記的特異帶型的材料，淘汰缺失465-bp帶型的材料，即可顯著提高種質資源群體的抗旱性， 平均準確率在92.5%以上，從而大大提高選擇效率，減少后期篩選鑒定的工作量，加速育種 進程。
[0080] 表2功能標記EE476451-465在40個油菜品種中的鑒定效果
[0083] 注:+表示分子標記檢測陽性，-表示檢測結果陰性。
[0084] 實施例3:
[0085] -種油菜苗期抗旱性高度關聯的功能標記在油菜抗旱育種中的應用，其步驟是：
[0086] (1)利用抗旱油菜品種'Apex'（來源于實施例1和2)和抗旱性較差的油菜品種'中 雙5號'（中國農業科學院油料作物研究所選育，種子市場可購買)構建的^群體分離群體為 研究材料，在苗期取樣，利用功能標記EE476451-465進一步擴大檢測范圍，檢測方法同實施 例2。
[0087] (2)預測凡是出現465-bp特異帶型（陽性）的單株其抗旱性將顯著提高，而缺失 465-bp特異片段(陰性)的單株其抗旱性顯著降低。
[0088] (3)在F2*離群體中利用功能標記檢測，隨機選取10株檢測結果為陽性(編號為 15Y-01~15Y-10)和10株檢測結果為陰性(編號為15X-01~15X-10)的單株，花期套袋自交 留種。
[0089] (4)利用實施例1相同的方法，對自交留種的20個單株進行抗旱性鑒定，結果表明， 陽性單株的干旱存活率在74~100%之間，抗旱性較好(見表3)，通過選擇這種類型的單株， 可進一步快速培育抗旱油菜新品種；陰性單株的干旱存活率在〇~42%之間，抗旱性較差 (見表3)，可提前淘汰，從而大大減輕后期的育種工作量。
[0090] 以上結果充分說明，該功能標記確實可以用于油菜苗期抗旱性的預測、鑒定和篩 選。
[0091] 表3功能標記EE476451-465在育種群體中的應用效果
[0093] 注:+表示分子標記檢測陽性，-表示檢測結果陰性。
【主權項】
1. 一種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記，其序列為SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列。2. -種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記的擴增引物，其特征在于，正向引物序列為 5Z-TGAGGCTGATAGGATACTGG-3'，反向引物序列為5-CCACGGGCACCTACATTA-3'。3. 權利要求1所述的一種與油菜苗期抗旱性關聯的功能標記在油菜抗旱育種中的應 用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886651SQ201610411408
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月13日
【發明人】陸光遠, 黃倩, 趙永國, 張學昆, 喬醒
【申請人】中國農業科學院油料作物研究所