一組與種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低相關的snp位點及其應用
【專利摘要】本發明涉及一組用于篩選和檢測種公牛畸形率和凍精解凍后活力高低的SNP分子標記。具體的，SNPs位點位于ARID4A基因第53位和826位堿基，兩個SNPs位點在種公牛群體中有多種基因型組合，通過提取種公牛凍精的基因組DNA，檢測其ARID4A基因的基因型組合，預測種公牛的畸形率及凍精解凍后活力。本發明成功篩選出種公牛ARID4A基因的SNPs，首次闡明了種公牛ARID4A基因單核苷酸多態性與種公牛畸形率和凍精解凍后活力的相關性，提供了用于檢測種公牛畸形率和凍精解凍后活力的簡便、高效方法，并開發出相應的檢測試劑盒。該試劑盒具有成本低、可靠性穩定、效率高等優點，可以用于早期優質種公牛的篩選。
【專利說明】
一組與種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低相關的SNP位點 及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于家畜分子生物學技術領域，具體涉及一組與種公牛凍精解凍后活力和 畸形率高低相關的SNP位點及其應用，尤其是涉及通過分子標記技術檢測與種公牛畸形率 和凍精解凍后活力高低相關的ARID4A基因的SNPs位點，提供檢測種公牛畸形率和凍精解凍 后活力高低的方法及試劑盒，應用于優良家畜繁殖性狀的早期選育。
【背景技術】
[0002] 牛奶營養價值極高，是我們日常生活中不可或缺的食品。中國荷斯坦奶牛是國內 飼養范圍最廣，產奶量最多的一個品種。在人工授精及冷凍精液等技術被廣泛推廣的今天， 種公牛已經成為現代奶牛改良體系中最重要的一環，其精液品質優劣是牛群能否可以快速 穩定發展的指示標。公牛的采精量、鮮精活力、凍精解凍后活力、鮮精密度和精子畸形率是 國際公認的衡量種公牛精液品質的重要指標。一項權威數據表明，我國的荷斯坦公牛年均 凍精生產量僅僅為2.18萬份，但在國外，最高的生產水平是一頭公牛年產凍精25萬份。這種 巨大的差距，直接表明了我國奶牛行業的實際水平還處在起步階段，未來還有較長路要走。 因此，如何提高公牛整體遺傳素質，解決公牛凍精質量差的問題，并進而培育大量良種公牛 已迫在眉睫。然而，種公牛精液品質屬于數量性狀，遺傳力極低，過去的常規育種手段很難 在較短時間內發揮作用。
[0003] 近年來，隨著分子遺傳技術的不斷發展，候選基因法(Candidate Gene Approach) 在遺傳育種中得到了廣泛應用。通過篩選候選基因上的多態位點，分析多態位點與精液品 質的相關性，從而鑒定出與精子質量相關的分子標記，進而為標記輔助選擇（marker assisted selected，MAS)提供理論指導。目前，多個研究通過全基因組關聯分析鑒定了與 精液品質密切相關的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點，發 現這些SNPs位點可能影響精子活力、密度、畸形率以及受精后的胚胎發育。
[0004] 基因任何構件的改變都會影響基因表達及其功能活性，單核苷酸多態性(SNP)是 最普遍的基因突變方式，主要是指DNA序列上單個堿基突變，包括單個堿基的轉換、顛換、插 入及缺失等。編碼區SNP(coding SNP，cSNP)可能對蛋白質的結構和功能產生有害的影響， 在遺傳性疾病的研究中具有重要意義。啟動子區SNP，尤其是有轉錄因子結合的SNP位點，影 響啟動子活性，進而調控基因的表達水平。近年來研究發現，某些基因啟動子區SNPs可以改 變影響公牛精液品質和繁殖力的主效基因啟動子區調控元件的結合位點，改變了基因的表 達模式，從而影響了公牛精液性狀和繁殖力。例如，本課題組Zhang等(2014)在前期研究中 發現KATNAL1基因的一個啟動子SNP(c.l63-210T>C)與中國荷斯坦公牛精子畸形率密切相 關。Pan等（2013)研究發現PLCz基因啟動子區的SNP(g.2456G>A)影響中國荷斯坦公牛的畸 形率。再如，Dai等(2009)分析了3個品種公牛的FSffi基因上游調控區，發現5'端側翼區的突 變改變了轉錄因子的結合位點，該突變可導致精液中FSH濃度的改變，解釋了 FSH0突變基因 型個體精子密度較低和頂體完整性較差的可能機理。相比于探究單個位點核苷酸多態性與 生物性狀的相關性，研究多個多態位點之間形成的單倍型組合更有意義，因為這可以同時 考慮到多態位點之間的相互作用。
[0005] ARID4A(之前也被稱為RBBP1或RBP1)是一個腫瘤抑制相關的有重要功能的蛋白， 可以和腫瘤抑制因子RB特異性結合。ARID4A屬于ARID基因家族，調控染色質重塑、基因表 達、細胞發育過程中的分化和增殖以及癌癥。Wu等（2013)發現，AR-和RB-應答通路基因是 ARID4A的下游靶標，ARID4A主要在睪丸支持細胞中表達，并且Ar 的小鼠在 初級精母細胞和單倍體精子細胞中表現出精子發生的阻滯，ARID4A可以通過AR和RB途徑調 節生精細胞的減數分裂。由此可以看出，ARID4A在調節種公牛的繁殖發揮重要的作用。然 而，Bos Taurus中ARID4A基因目前已知的SNP位點就多達2246個，不同SNP位點其關聯的性 狀也往往不同，如何篩選出可用于檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低的SNP分子標 記，是本領域技術面臨的主要難題。現有技術中影響種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低 的ARID4A基因的SNPs及其基因型組合的鑒定檢測試劑盒，目前仍未有報道。
【發明內容】
[0006] 本發明針對現有種公牛凍精解凍后活力和畸形率檢測技術的不足，開發相應的檢 測試劑盒，篩選凍精解凍后活力高和畸形率低的種公牛，為種公牛繁殖育種提供技術指導。
[0007] 本發明的目的是提供一組用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高 低的SNP位點，并提供一種通過ARID4A基因 SNPs檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低 的方法，以及研發相應的檢測試劑盒應用于種公牛繁殖。首先檢測ARID4A基因的SNPs位點， 確定個體中SNPs位點間的基因型組合，并進行基因型組合與種公牛精液品質的關聯分析， 從而鑒定出畸形率和凍精解凍后活力高的基因型組合。
[0008] 為實現上述目的，本發明的具體技術方案如下：
[0009] 本發明的第一方面，提供一組與種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低相關的SNP 位點：g. 53G>T和g. 826G>A，兩個SNPs分別位于ARID4A基因第53位和826位堿基（以ARID4A基 因轉錄起始位點的第一個堿基G為+1)。
[0010] 上述SNP位點用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低的應用也 是本發明的保護范圍。本領域技術人員應當明了，本申請所述SNP位點用于篩選和檢測種公 牛精子畸形率和凍精解凍后活力高低的應用，其是篩選和/或檢測得到精子畸形率較低、凍 精解凍后活力相對高的基因型的種公牛，其目的是指導種公牛的早期篩選和輔助育種，其 不屬于疾病的診斷和/或治療方法。
[0011] 上述SNP位點在種公牛的標記輔助育種中的應用也是本發明的保護范圍。
[0012] 本發明的第二方面，提供一組與種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低相關的含有 SNP位點的DNA片段，其核苷酸序列分別如序列表中SEQIDN0.1和SEQIDN0.4所示;其中， SEQ ID N0.1所示序列包含ARID4A基因第53位核苷酸，SEQ ID勵.4所示序列包含41?104八基 因第826位核苷酸。
[0013] 本發明的第三方面，提供一種非診斷目的的篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活 力和畸形率高低的方法，根據上述SNP位點，鑒定待測種公牛ARID4A基因第53位和826位 SNPs位點的基因型，根據兩個SNPs位點基因型的組合，預測種公牛凍精解凍后活力和畸形 率高低。
[0014] 上述方法中，ARID4A基因第53位SNP位點包括3種基因型，分別為GG、GT和TT; ARID4A基因第826位SNP位點包括3種基因型，分別為GG、GA和ΑΑ;根據兩個SNP的基因型構建 出6種基因型組合，分別為HlHl(GGGG)，H1H3(GGGA)，H1H4(GTGA)，H3H3(TTGG)，H3H4(TTGA)， H4H4(TTAA)，當基因型組合為TTAA時，該組合的種公牛個體畸形率低，當基因型組合為GGGG 時，該組合的種公牛凍精解凍后活力最高。
[0015] 上述方法中，所述鑒定待測種公牛ARID4A基因第53位和826位SNPs位點的基因型 包括：以種公牛精液DNA為模板，設計引物分別擴增包含兩個SNPs位點的DNA序列的步驟和 對擴增產物進行基因分型的步驟；
[0016] 所述引物分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示，可 以分別特異性地擴增包含ARID4A基因第53位（如SEQ ID NO. 1所示）和826位核苷酸（如SEQ ID NO.4所示)序列。
[0017] 所述對擴增產物進行基因分型的步驟可以為:對擴增產物進行酶切，將酶切產物 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據電泳結果區分基因型。
[0018] 具體的，所述酶切選用的酶為FastDigest限制性核酸內切酶Mst I和Sac II，其 中，F a s t D i g e s t限制性核酸內切酶M s t I可以識別A RID 4 A基因的第5 3位S N P位點， FastDigest限制性核酸內切酶Sac II用于識別ARID4A基因的第826位SNP位點。
[0019] 酶切產物分別用3%和2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據電泳的結果區分基因 型。對于ARID4A基因的第53位SNP位點：若酶切后產物片段為283bp和25bp是GG基因型；片段 為308bp、283bp和25bp是GT基因型；片段為308bp是TT基因型。對于ARID4A基因的第826位 SNP位點：若酶切后產物片段為485bp和294bp是GG基因型；片段為779bp、485bp和294bp是GA 基因型；片段為779bp是AA基因型。根據兩個SNP的基因型構建出6種基因型組合，其中H1H1 (GGGG)和HI H3 (GGGA)基因型組合種公牛個體的畸形率高于H4H4 (TTAA)，HI HI (GGGG)基因型 組合種公牛個體的凍精解凍后活力高于H1H3(GGGA)。
[0020] 所述對擴增產物進行基因分型的過程亦可采用其他常規方法，如對PCR產物直接 測序法，獲得所述SNP位點對應的基因型。
[0021] 上述所需的種公牛精液DNA均是通過高鹽法從種公牛的凍精中提取，并且利用核 酸蛋白分析儀檢測基因組DNA的濃度和純度，最終將DNA稀釋到50ng/yL，4°C保存備用。
[0022] 需要說明的是，上述方法是用于種公牛的早期篩選和輔助育種，并不屬于疾病的 診斷和/或治療方法。
[0023]本發明的第四方面，提供一種用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形 率高低的引物組，包括擴增含有ARID4A基因第53位核苷酸的引物對，其序列分別如SEQ ID NO .2和SEQ ID NO .3所示；
[0024] 擴增含有ARID4A基因第826位核苷酸的引物對，其序列分別如SEQ ID NO.5和SEQ ID Ν0· 6所示。
[0025] 上述引物組在制備用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低的試 劑盒中的應用也是本發明的保護范圍。
[0026] 本發明的第五方面，提供一種用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形 率高低的試劑盒，包括:擴增位于ARID4A基因第53位和826位堿基的兩個SNPs : g. 53G>T和 g. 826T>G的引物;PCR擴增試劑。
[0027] 優選的，上述引物為擴增包含ARID4A基因第53位核苷酸的基因組片段所用的上游 引物（如SEQIDN0.2所示）和下游引物（如SEQIDN0.3所示），擴增包含ARID4A基因第826 位核苷酸的基因組片段所用的上游引物(如SEQ ID N0.5所示）和下游引物（如SEQ ID N0.6 所示）。
[0028] 更優選的，一種篩選和檢測種公牛畸形率和凍精解凍后活力高低的試劑盒，試劑 盒的保存在_20°C，試劑盒的組成成分如下所示：
[0029] FastDigest限制性核酸內切酶Mst I;
[0030] FastDigest限制性核酸內切酶Sac II;
[0031] 10XFastDigest buffer；
[0032] 2XTaq PCR MasterMix；
[0033] ddH20；
[0034] 2000bp DNA Ladder Marker
[0035] 擴增包含ARID4A基因第53位核苷酸的基因組片段所用的上游引物（如SEQ ID NO.2所示）和下游引物（如SEQ ID NO.3所示）
[0036] 擴增包含ARID4A基因第826位核苷酸的基因組片段所用的上游引物（如SEQ ID NO.5所示）和下游引物（如SEQ ID NO.6所示）。
[0037] 本發明的有益效果：
[0038] (1)在中國荷斯坦公牛ARID4A基因中，通過篩選獲得一組可用于篩選和檢測種公 牛畸形率和凍精解凍后活力高低的SNP分子標記，其中SNP位點g.53G>T和g.826T>G與公牛 畸形率和凍精解凍后活力高低相關為首次公開。
[0039] (2)本發明利用SNP分子標記技術輔助育種，這種篩選方法可以避免常規育種周期 長、效率低等局限性，具有準確性高、高效靈敏、成本低等優勢。本發明鑒定出1種有效地 ARID4A基因基因型組合TTAA，該組合的種公牛個體畸形率低，以及GGGG基因型組合凍精解 凍后活力最高，可以進行輔助育種。
[0040] (3)本發明提供了一種新型的應用性檢測試劑盒，利用ARID4A基因第53位和826位 SNP位點篩選種公牛精子活力高低的個體。
[0041] (4)本發明在實踐中應用廣泛，通過對種公牛進行早期篩選，可以減少種公牛飼養 的盲目性，降低成本，增加牧場經濟效益。
【附圖說明】
[0042] 圖1:中國荷斯坦牛ARID4A基因第53位和826位的SNP反向測序結果；
[0043]圖2:中國荷斯坦牛ARID4A基因第53位和826位SNP位點瓊脂糖凝膠電泳分型圖。
【具體實施方式】
[0044] 結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發明，并不對其內容進行限定。
[0045] 下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等 人，分子克隆：實驗手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0046]下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0047]實施例1:牛ARID4A基因的SNP位點及基因型組合的鑒定
[0048] 本發明采用直接測序、CRS-PCR和PCR-RFLP的手段對牛ARID4A進行SNP鑒定。
[0049] 1.1實驗材料
[0050] 本發明用的公牛選自國內兩大種公牛站:北京奶牛中心(85頭)和山東奧克斯種公 牛站(130頭）。公牛凍精儲存于液氮中備用。
[0051 ] 1.2凍精基因組DNA的提取
[0052]采用高鹽法提取凍精基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀檢測DNA樣品的純度和濃 度，最終稀釋成50ngAU，4°C保存備用。
[0053] 1.3引物的設計
[0054] 根據NCBI提供的牛ARID4A基因序列（登錄號：AC_000167. 1)，利用Primer Premi er5.0軟件設計引物，所設計的兩對引物的序列如下所示：
[0061 ] 1.4PCR擴增反應
[0062] 25yL 的 PCR 反應體系：2XPower Taq PCR MasterMix 12·5μ1;上下游引物各 0·5μ 1，10μηιο1/1;模板ΙμL，50ng/yl ;ddH2〇補足到25μ1。
[0063] PCR反應程序：預變性95°C，5min;變性9 5°C，30sec，退火59°C，30sec，延伸72°C， 65sec，經過35個變性-退火-延伸循環;72°C終延伸lOmin。
[0064] 1.5SNP 的檢測
[0065] 用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，確定是目的條帶后，將PCR擴增產物送北京六 合華大基因科技股份有限公司雙向測序。測序結果用DNAMAN與GenBank上ARID4A基因的參 考序列進行序列比對，結合測序峰圖，確定目的片段中的SNP位點分別為:g. 53G>T和g. 826T >G〇
[0066] 1 · 6PCR-RFLP 基因分型
[0067] FastDigest限制性核酸內切酶Mst I可以識別ARID4A基因的第53位SNP位點。
[0068] FastDigest限制性核酸內切酶Sac II用于識別ARID4A基因的第826位SNP位點。 [0069]檢測PCR產物為目的片段后，用相應的限制性內切酶將PCR產物消化一個小時（3 7 °C )。酶切反應體系（30μ1) :PCR產物ΙΟμΙ;限制性內切酶ΙμL，iou/μL; 10 X buffer 2μ1; ddH20補足到30μ1。酶切產物分別用3%和2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據電泳得到的條 帶區分統計不同的基因型。g.53G>T被限制性核酸內切酶Mst I識別后，片段大小為283bp和 25bp是GG基因型；片段為308bp、283bp和25bp是GT基因型；片段為308bp是TT基因型。g.826T >G被限制性核酸內切酶Sac II識別后，片段大小為485bp和294bp是GG基因型；片段為 779bp、485bp和294bp是GA基因型；片段為779bp是AA基因型。
[0070] 1.7單倍型構建
[0071] 在試驗群體中鑒定出三種單倍型:H1(GG)，H3(TG)，H4(TA)。在群體中共發現6種基 因型組合：HlHl(GGGG)，H1H3(GGGA)，H1H4(GTGA)，H3H3(TTGG)，H3H4(TTGA)，H4H4(TTAA)。
[0072] 本發明的引物設計思路還不同于現有技術中常規的引物設計，本申請利用的是創 造酶切位點的方法，設計出特異性引物，使牛ARID4A基因第53位SNP位點g. 53G>T可以被 FastDigest限制性核酸內切酶Mst I識別；使牛ARID4A基因第826位SNP位點g.826G>A可以 被FastDigest限制性核酸內切酶Sac II識別。以種公牛基因組DNA為模板，分別利用上述特 異性的引物(53F、53R和826F、826R)進行PCR擴增，PCR擴增產物分別經FastDigest限制性核 酸內切酶Mst I和FastDigest限制性核酸內切酶Sac II切割后，在瓊脂糖凝膠凝膠電泳中 予以分型，通過電泳條帶對分型結果進行判定。
[0073] 本發明在試驗過程中還以常規方法設計了多組對照引物，其中部分引物如下：
[0082]以上述對照引物進行PCR擴增反應，結果發現，上述對照引物的擴增效率明顯低于 SEQIDN0.2、SEQIDN0.3和SEQIDN0.5、SEQIDN0.6兩對引物，而且有些擴增產物不能 被FastDigest限制性核酸內切酶Mst I和FastDigest限制性核酸內切酶Sac II識別，無法 通過電泳實現基因分型。
[0083]實施例2:牛ARID4A基因單倍型組合與種公牛精子活力的關聯分析
[0084] 采用SAS 9.0,比較牛ARID4A基因不同基因型組合與畸形率和凍精解凍后活力的 相關性。其模型為：
[0085] Υ：?」??=1τ?+6?+Υ」+Η??+θ：?」??
[0086] Yljk為公牛畸形率或精子活力性狀的觀察值;μ為群體平均值:單倍型組合的固 定效應;Yj:季節的固定效應;Hk:場次的固定效應;eijk:隨機殘差效應。
[0087]單倍型組合關聯的結果顯示:6種基因型組合中，H4H4基因型公牛個體的畸形率顯 著低于H1H1和H1H3基因型個體公牛(P〈0.05);H1H1基因型組合公牛個體的凍精解凍后活力 顯著高于H1H3(P〈0.05)基因型個體公牛(表1)。
[0088]表1牛ARID4A基因不同基因型組合與精子活力的相關性分析
[0089]
[0090] 注:!11=66;!13 = 了6;!14 = 了4;同列中具有不同小寫字母(3，13，(3，(1)上標的平均值間 差異顯著(P〈0.05)。
[0091] 運用SAS軟件分析ARID4A不同基因型組合與中國荷斯坦公牛精液品質性狀的相關 性。結果表明（表1)，H4H4基因型公牛個體的畸形率顯著低于H1H1和H1H3基因型個體公牛(P <0.05);H1H1基因型組合公牛個體的凍精解凍后活力顯著高于H1H3(P〈0.05)基因型個體公 牛。因此，可以將TTAA基因型作為判斷種公牛畸形率高低的分子標記，GGGG基因型作為判斷 種公牛精子解凍后活力高低的分子標記。
[0092] 用于低畸形率和高凍精解凍后活力個體的篩選。在育種工作者實際對種公牛進行 選育的過程中，如果發現某個公牛個體攜帶這種基因型組合，那么此個體與其他個體相比 期望有更加高的畸形率和凍精解凍后活力性狀。因此，該項技術可以指導種公牛的早期篩 選，減少奶牛飼養的盲目性，降低養殖成本，增加牛場的經濟效益。這種牛ARID4A的SNP分子 標記輔助育種的技術在以后的應用前景極其廣泛。
[0093]實施例3檢測試劑盒
[0094] 如實施例1所述，牛ARID4A基因第53位的G>T以及第826位的G>A均與種公牛的畸形 率和凍精解凍后活力密切相關。因此，可以發明一種適用于篩選種公牛畸形率和凍精解凍 后活力高低的ARID4A基因 SNP分子標記檢測試劑盒，即根據這兩個SNP位點設計牛ARID4A基 因的特異性引物進行擴增及檢測。
[0095] 制備用于種公牛精子活力高低檢測的試劑盒，詳細成分如表2所示：
[0096] 表2種公牛精子活力高低檢測的試劑盒成分
[0097]
[0098] 我們首先采集了種公牛的精液，于液氮儲存備用，利用高鹽法提取凍精總DNA。利 用上述試劑盒中的成分以提取的凍精DNA為模板進行PCR擴增。然后按照實施例1所述的PCR 體系和條件進行反應。25yL的PCR反應體系：2XPower Taq PCR MasterMix 12·5μ1;上下游 引物各0.5μ1，10μπιο1/1;模板ΙμL，50ngAU ; ddH20補足到25μ1 JCR反應程序:預變性95 °C， 5min;變性9 5°C，30sec，退火59°C，30sec，延伸72°C，65sec，經過35個變性-退火-延伸循 環;72 °C終延伸lOmin。利用CRS-PCR和PCR-RFLP方法對PCR擴增產物進行分型。具體酶切的 條件及體系同實施例1所述。酶切反應體系（30μ 1): PCR產物1 Ομ 1;限制性內切酶1 μ 1，1 OU/μ l;10Xbuffer2μl;ddH20補足到30μl，37°C消化酶切體系lh。酶切產物分別用3%和2.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0099] 根據實施例1中所述：g . 53G>T被限制性核酸內切酶Mst I識別后，片段大小為 283bp和25bp是GG基因型；片段為308bp、283bp和25bp是GT基因型；片段為308bp是TT基因 型。g.826T>G被限制性核酸內切酶Sac II識別后，片段大小為485bp和294bp是GG基因型；片 段為779bp、485bp和294bp是GA基因型；片段為779bp是AA基因型。再按實施例1中所述方法 分析各基因型組合個體的畸形率和凍精解凍后活力的高低，決定留種與否。
[0100] 在此，雖然直接測序可以檢測出牛ARID4A基因 g. 53G>T以及g. 826G>A的兩個突變。 但直接測序的方法成本較高，且周期長，不適用于大批量樣品的檢測。該試劑盒則可以很好 的彌補直接測序的缺陷，為種公牛的早期培育提供技術及理論指導。
[0101]本發明具有實用性的例證：
[0102] 1)本發明提供了一種通過鑒定牛ARID4A基因單核苷酸多態性，間接檢測種公牛畸 形率和凍精解凍后活力的方法。該方法適用于分析牛ARID4A基因上的2個SNP位點與種公牛 畸形率和凍精解凍后活力的相關性，進一步可以作為種公牛畸形率和凍精解凍后活力的早 期診斷的依據，為高品質的種公牛選育提供技術及理論指導。
[0103] 2)本發明中高效檢測牛ARID4A基因多態性和種公牛畸形率和凍精解凍后活力相 關位點方法，可類似的在種公牛畸形率和凍精解凍后活力相關基因診斷的試劑盒中得以應 用。
[0104] 綜上所述，牛ARID4A基因的多態性位點g.53G>T以及g.826G>A均與種公牛畸形率 和凍精解凍后活力高低的顯著相關，并根據這種相關性，研發檢測試劑盒，在實踐中應用到 基因診斷中。
[0105] 本發明提供了一種通過鑒定牛ARID4A基因單核苷酸多態性間接檢測種公牛畸形 率和凍精解凍后活力高低的方法。根據本發明，我們只需要極其少量的種公牛基因組DNA就 可以高效鑒定出牛ARID4A基因的SNP位點，通過構建基因型組合，分析這些基因型組合對種 公牛畸形率和凍精解凍后活力高低的影響。本發明又提供了一種適用于檢測種公牛畸形率 和凍精解凍后活力高低的試劑盒。最終，本發明提供了一種利用ARID4A基因 SNP分子標記檢 測種公牛畸形率和凍精解凍后活力高低的方法及試劑盒。
[0106] 本發明與常規的測序手段進行分型相比，具有費用更低、耗時更少及效率更高等 優點，符合現代科學發展的理念，可以在未來種公牛遺傳育種中被廣泛的使用。
[0107]上述雖然結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發明保護范 圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不 需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。
【主權項】
1. 一組與種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低相關的SNP位點，其特征在于，所述SNP 位點為種公牛ARID4A基因第53位的g.53G>T和第826位堿基的g.826G>A。2. 權利要求1所述的SNP位點用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低 的應用;或者在種公牛的標記輔助育種中的應用。3. -組與種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低相關的含有SNP位點的DNA片段，其核苷 酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.4所示；其中，SEQ ID NO. 1所示序列包含ARID4A基 因第53位核苷酸，SEQ ID NO.4所示序列包含ARID4A基因第826位核苷酸。4. 一種非診斷目的的篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低的方法，其 特征在于，鑒定待測種公牛ARID4A基因第53位和826位SNPs位點的基因型，根據第53位和 826位兩個SNPs位點基因型的組合，預測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，根據ARID4A基因第53位和826位SNPs位點的 基因型，構建出6種基因型組合，分別為GGGG，GGGA，GTGA，TTGG，TTGA，和TTAA;當基因型組合 為TTAA時，該組合的種公牛個體畸形率低，當基因型組合為GGGG時，該組合的種公牛凍精解 凍后活力最高。6. 如權利要求4或5任一項所述的方法，其特征在于，所述鑒定待測種公牛ARID4A基因 第53位和826位SNPs位點的基因型包括：以種公牛精液DNA為模板，設計引物分別擴增包含 兩個SNPs位點的DNA序列的步驟和對擴增產物進行基因分型的步驟； 引物序列為：擴增含有ARID4A基因第53位核苷酸的引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所 示;擴增含有ARID4A基因第826位核苷酸的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。7. -種用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低的引物組，其特征在 于，包括擴增含有ARID4A基因第53位核苷酸的引物對，其序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO. 3所示； 擴增含有ARID4A基因第826位核苷酸的引物對，其序列分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。8. 權利要求7所述的引物組在制備用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形 率高低的試劑盒中的應用。9. 一種用于篩選和/或檢測種公牛凍精解凍后活力和畸形率高低的試劑盒，其特征在 于，包括:權利要求7所述的引物組和PCR擴增試劑。10. 如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：限制性核酸內切酶 Mst I;限制性核酸內切酶Sac II和酶切緩沖液。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886639SQ201610321653
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月13日
【發明人】孫艷, 劉娟, 李秋玲, 王長法, 楊春紅, 姜強, 王秀革, 鞠志花, 張燕, 黃金明, 仲躋峰
【申請人】山東省農業科學院奶牛研究中心